联合检测大肠癌组织中PTEN与CyclinD1的表达及DNA含量的临床意义

1、结合检测大肠癌组织中PTEN与CyclinD1的表达及DNA含量的临床意义【摘要】目的：讨论大肠癌组织中PTEN和ylinD1的表达及与DNA含量结合检测的关系及意义。方法：应用免疫组织化学SP法检测58例大肠癌及14例癌旁正常大肠黏膜组织中PTEN和ylinD1蛋白表达;应用流式细胞术检测以上组织中PTEN和ylinD1的DNA含量;分析它们之间及与肿瘤分期、分级的关系。结果：PTEN蛋白在大肠癌组织中的表达(65.52%)显著低于癌旁正常组织(100%),ylinD1蛋白在大肠癌组织中的表达(60.34%)显著高于癌旁正常组织(1.72%),两种蛋白在大肠癌组织中的表达呈负相关(r=-0.

2、71);大肠癌组织的异倍体率(68.97%)显著高于癌旁正常组织(0);PTEN阳性组的DNA指数(DNAindex，DI)、S期细胞比率(S-phasefratin，SPF)均低于阴性组(P0.05)，ylinD1阳性组的DI及SPF均高于阴性组(P0.05);两者的表达与肿瘤病理分级、Dukes分期及淋巴结转移相关;淋巴结转移患者的异倍体率及SPF均高于无淋巴转移患者(P0.05)。结论：PTEN和ylinD1基因的异常改变可能参与大肠黏膜细胞的恶性转化过程，两者的变化存在相关性;DNA含量的变化可能与淋巴结转移有关。结合检测PTEN、ylinD1蛋白及DNA含量可作为评估大肠癌病理生物学

3、行为和预后的重要指标。【关键词】大肠肿瘤癌基因DNA，肿瘤【ABSTRAT】bjetive:TinvestigatetheexpressinfPTEN、ylinD1andDNAntentinthetissueflretalarinas,andtdisussthEirrelatinships.ethds:TheexpressinfPTENandylinD1in58asesfhuanlretalarinasand14aseftur-sidenraltissueeredetetedbyiunhistheialtehnique;DNAntentaseasuredbyflytetry.Results:T

4、hepsitiveexpressiveratefPTENinthelretalarinaas65.52%，hihaslerthan93.10%fthetur-sidenraltissue,(P0.01).ThepsitiveexpressiveratefylinD1inthelretalarinaas60.34%,hihashigherthan1.72%fthenraltissue.TheexpressinfPTENandylinD1shedanegativerrelatinitheahther(r=-0.71).TheDNAindex(DI)andsphasefratin(SPF)inthe

5、psitivegrupfPTENerelerthanthseinthenegativegrup，andtheDIinthepsitivegrupfylinD1ashigherthanthisinthenegativegrup(P0.05).TheexpressinfPTENandylinD1inlretalarinaereassiatedithdegreefdifferentiatinfarina,Dukesstageandlyphndeetastasisftheturs;theaneuplidratiandSPFinlyphndeetastasispsitivepatientserehigh

6、erthanthseinthenegativepatients(P0.05).nlusin:TheabnralexpressinfPTENandylinD1partiipatethealignantnversinpressfthelretalusaell;DNAntentisrelatedtlyphndeetastasis;theexpressinlevelsfPTEN、ylinD1andtheDNAntentaybetheiprtantindiatrtevaluatethepathlgibilgybehavirandtheprgnsisfthelretalarina.【KEYRDS】lret

7、alarinangenesDNA,nepla大肠癌是常见的消化道恶性肿瘤之一，其发病机制一直是根底和临床研究的热点。目前的研究发现，细胞周期调控的紊乱、抑癌基因的失活与大肠癌的发生、开展关系亲密。PTEN是一种具有磷酸酶活性的多功能蛋白，通过作用于PI3K/AKT、FAK/P130、ERK/APK等途径抑制细胞周期和促进细胞凋亡1;ylinD1是G1期中含量最高、活性最强的细胞周期素，其过度表达可以导致细胞周期异常2。PTEN对细胞周期的调节需要与ylinD1发生作用3。本研究通过检测大肠癌及癌旁正常组织中两种蛋白的表达及细胞DNA的含量，讨论它们互相之间及与肿瘤分级、临床分期的关系，以帮助临

8、床诊断治疗和判断预后。1资料与方法1.1一般资料选择2022年10月2022年9月于我院手术切除、经临床和病理组织学确诊的58例大肠癌组织及癌旁正常黏膜组织(距肿瘤边缘2)的石蜡标本。所有患者术前均未承受化学治疗、放射治疗和免疫治疗。其中男35例，女23例;年龄3179岁，平均57.9岁;高分化腺癌15例，中分化腺癌23例，低分化腺癌20例。临床Dukes分期：A期14例，B期25例，期15例，D期4例。1.2主要试剂与仪器鼠抗人PTEN和兔抗人P27单克隆抗体工作液、SP-9000HiststainT-PlusKits免疫组织化学试剂盒、DAB显色剂SP试剂盒均购自福州迈新生物技术开发公司。

9、R2135切片机(LEIAGerany);LYPUSX71三色荧光显微镜及照相系统(日本);美国Bekanulter流式细胞仪(EpisXL型)。1.3检测方法及断定标准1.3.1免疫组织化学染色采用SP法免疫组织化学染色，用PTEN染色阳性的前列腺组织切片及P27阳性的胃癌组织切片作阳性对照，以PBS代替一抗做阴性对照。PTEN蛋白阳性表达在细胞质;P27蛋白阳性表达主要在细胞核，但也有局部在细胞质，两者均为棕黄色颗粒。每张病理切片随机选取10个高倍镜视野，每个视野计数100个细胞，共1000个，计算PTEN蛋白和p27蛋白阳性细胞所占比例，10%为(-)，10%为(+)。1.3.2流式细胞

10、检测50厚度切取所有组织蜡块各4张，经二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，PBS漂洗后置于0.01l/L柠檬酸缓冲液(pH=6.0)中加热至90，保温1h;冷却至室温后弃柠檬酸，参加0.1%胶原酶及0.1%中性蛋白酶的混合溶液，37孵育1h，以单纯RPI1640培养液终止酶作用;加适量PBS液，800r/in离心5in，弃上清;加PBS制成单细胞悬液，经400目滤网过滤，调整细胞浓度为106L-1;0.1%Rnase37作用1h，离心后加0.02%PI，暗处放置30in后上机。DNA倍体测定：流式细胞仪线性采集约10000个细胞，ultiyle软件分析结果。以DNA指数(DNAindex,DI)表示DN

11、A的相对含量;以正常人淋巴细胞DNA含量G0/G1峰均道值为二倍体细胞的标准。DI=样本G0-G1峰均道值/正常对照G0-G1峰均道值，变异系数(V)8%。1.0-2VDI1.0+2V时，确定样本为二倍体;DI1.0+2V时，为异倍体。异倍体率=异倍体样本数/(二倍体样本数+异倍体样本数)100%;同时计算S期细胞比值(S-phasefratin,SPF)=S/(G0-G1+S+G2-)100%。1.4统计学处理应用SPSS13.0统计软件，蛋白阳性率比拟及互相关系分析用2检验及spearan等级相关分析;DI及SPF均值比拟用t检验。P0.05为差异有统计学意义。2结果2.1PTEN、yli

12、nD1的表达及DNA含量分布PTEN蛋白在大肠癌组织中的阳性表达率(65.52%)显著低于癌旁正常组织(100%，P0.01，表1，图1);ylinD1蛋白在大肠癌组织中的阳性表达率(60.34%)显著高于癌旁正常组织(3.45%，P0.01，见表1，图2)。大肠癌组织的DNA异倍体率、SPF均高于癌旁正常组织(P0.05，图34，见表1)。2.2PTEN、ylinD1的表达与DNA含量的关系PTEN表达阳性组的DI及SPF均低于阴性表达组，(P0.05);ylinD1表达阳性组的DI及SPF均高于阴性表达组(P0.05，表2)。2.3PTEN及ylinD1在大肠癌中表达的相关性对58例大肠癌

13、组织中PTEN及ylinD1的表达进展相关分析，结果显示：r=-0.7135，P0.01，说明PTEN在大肠癌组织中的表达与ylinD1呈负相关。2.4PTEN、ylinD1的表达及DNA含量与临床病理特征的关系PTEN及ylinD1的表达在不同性别、年龄及肿瘤的部位、大孝浸润深度的大肠癌患者间差异均无统计学意义(P0.05);但在不同肿瘤病理分级、Dukes分期及有无淋巴结转移患者间存在统计学差异(P0.05);DNA异倍体率、SPF与患者的性别、病理分级和临床分期等无明显关系(P0.05);但与淋巴转移有关(P0.05，表3)。3讨论3.1PTEN和ylinD1在大肠癌组织中的表达及意义P

14、TEN作为重要的抑癌基因，其缺失或(和)突变与子宫内膜癌、黑色素瘤、前列腺癌、肺癌及胃癌等多种肿瘤的发生开展有关1。Zhu等4研究发现PTEN基因突变是大肠癌发生开展中的早期事件。Khaleghpur等5发如今结肠癌细胞中PTEN明显缺失。本研究发现大肠癌肿瘤分化程度越低、Dukes分期越晚和出现淋巴结转移时，PTEN表达缺失越明显，提示PTEN在大肠癌的发生和开展中发挥重要作用。转贴于论文联盟.ll.ylinD1是细胞周期素家族最重要的成员之一，为目前公认的癌基因。正常人体组织中ylinD1呈低程度表达。当ylinD1过表达时将引起细胞增殖周期失调，显著缩短G1期，促使细胞提早进入S期，引起

15、细胞生长失控、转化和癌变。Bahnassy等6发现ylinD1过表达与肿瘤组织学类型、分化程度、淋巴转移状况亲密相关，且过表达者预后较差。本研究发现ylinD1蛋白在大肠癌组织中的阳性表达率显著高于癌旁正常组织，且ylinD1蛋白在低分化和有淋巴结转移、分期晚的肿瘤中阳性表达率明显增高，提示ylinD1的过表达与大肠癌的发生开展有关。Leslie等3发现PTEN可以通过调节p27与ylinD1-DK4/6复合物的结合、抑制ylinD1-DK4/6的活性并下调视网膜母细胞瘤蛋白磷酸化程度来抑制G1期细胞增殖。本研究结果说明PTEN与ylinD1在大肠癌组织中的表达呈负相关，说明PTEN表达的缺失

16、促进了ylinD1表达的上调，并最终促使黏膜上皮细胞向肿瘤细胞转化，但二者的作用机制有待于进一步研究和讨论。3.2细胞DNA含量与大肠癌组织的关系细胞DNA含量异常代表其染色质数量和构造的改变，此种改变不仅促进细胞分裂增殖，同时导致细胞内特异性多肽及蛋白合成失败，使细胞不能从增殖状态转变为分化状态7。以往流式细胞术检测DNA含量时，考虑到石蜡标本固定时使用的甲醛对PI染料结合DNA链产生抑制作用等不利因素，多采用新颖的组织标本，给标本的采集保存和临床诊断带来了诸多不便。本研究采用ille等8的改进F方法检测组织，以增加预热处理及胶原酶的消化作用，进步可供检测的细胞数量，减少细胞碎片的产生，消除

17、甲醛的影响。本研究发现大肠癌组织细胞的DI值、DNA异倍体比率均高于癌旁正常组织，且发生淋巴结转移癌组织的DI和DNA异倍体比率高于未发生淋巴结转移的癌组织，提示DNA含量与大肠癌淋巴结转移有关。SPF是反映细胞增殖活性的指标，Rey等9发现肾癌细胞DNA倍体和SPF值均与患者预后有关，异倍体患者及高SPF值者预后较差。本研究结果说明癌组织SPF明显高于癌旁组织，提示大肠癌细胞具有较高的增殖活性;有淋巴结转移患者SPF值明显高于无淋巴结转移患者，提示SPF值与大肠癌转移有关，DNA含量和SPF可能与大肠癌患者预后有关。3.3PTEN、ylinD1表达与DNA含量的关系Berrak等10发现畸胎

18、瘤组织中PTEN表达的下调伴DNA倍体数、SPF值的过度上调。Zhu等11研究说明ylinD1的表达和DNA含量在食管癌中的检测具有相关性，其结合检测可作为评价肿瘤预后的有用指标。本研究发现PTEN表达阳性组的DI值及SPF值均低于阴性表达组(P0.05);ylinD1阳性表达组的DNA含量高于阴性表达组(P0.05)，说明PTEN和ylinD1表达的变化与DNA含量的变化存在相关性。总之，PTEN表达缺失和ylinD1表达过度参与了大肠癌的发生和开展过程;细胞中DNA含量相关指标的变化与上述变化存在一致性;三者的结合检测对评估大肠癌病理生物学行为和判断预后有一定意义。【参考文献】1Diunz

19、G，AngelettiS，GariaF，etal.lretalarinasandPTEN/A1geneutatinsJ.linanerRes，2001，7(12):4049-4053.2DnnellanR,hettyR.ylinD1andhuanneplasiaJ.JlinPathllPart,1998,51:1-7.3LeslieNR,DnessP.PTENfuntin:hnralellntrlitandturellslseitJ.BiheJ,2022,38(2):1-11.4ZhuXP,KuisanenS,NystrLahti,etal.DistintPTENutatinalspetrai

20、nhereditarynn-plypsislnanersyndre-relatedendetrialarinasparedtspradiir-satelliteunstableturs.HulGenet,2002,11(4):445-450.5KhaleghpurK,LiY,BanvilleD,etal.InvdveentfthepI3-kinasesignalingpath-ayinprgressinflnadenarinaJ.aringenesis,2022,25(2):241.6BahnassyAA,ZekriAR,HussinisEL,etal.ylinAandylinD,assignifiantprgnstiarkersinlretalpatientsJ.BGastrenteral,2022;4(1):22.7JiaYF,SugaiT,Suzuki,etal.AppliatinftheryptislatintehniquettheflytetrianalysisfDNAntentingastriarinaJ.HuPathl,2022,35(5