复旦大学基因诊断与基金治疗教案02基因诊断的发展历程

1、第二章 基因诊断的发展历程基因诊断的发展历程 基因诊断技术的发展，经历了间接基因诊断、直接基因诊断、动态基因诊断三个主要阶段。1 间接基因诊断间接基因诊断是利用遗传标志，推测某一疾病基因的存在与否，从而辅助疾病诊断。遗传标志经历了三代发展，简述如下：第一代多态性标志：限制性片段长度多态性（RFLP）restriction fragment length polymorphisms该技术由Grodzicker等于1974年创立。特定生物类型的基因组DNA经某一种限制性内切酶完全酶解后，会产生分子量不同的同源等位片段，或称限制性等位片段。RFLP标记技术的基本原理就是通过电泳的方法分离和检测这些片

2、段。凡是可以引起酶解位点变异的突变，如点突变（新产生和去除酶切位点）和一段DNA的重新组织（如插入和缺失造成酶切位点间的长度发生变化）等均可导致限制性等位片段的变化，从而产生RFLP。第二代多态性标志：1985 年Jeffreys 发现重复序列及其多态性VNTR(variable number of tandem repeat)可变数串联重复序列(Variable Number of Tandem Repeat,VNTR)通常由二个核甘酸组成的单元如胞嘧啶+腺嘌啉(CA)经过若干次重复组成,由于重复的次数(即n值)是可变的,因而构成一种多态类型.在非严格定义的情况下,也称为微卫星重复多态,然而

3、VNTR是从多态自身的结构特点来命名的,而微卫星重复多态是从此类DNA在梯度离心分离时所表现的特性提出来的.VNTR是近年提出的概念,因其在基因组中分布极为丰富,故应用日趋广泛.就某一VNTR而言,通常重复单元可以表现出几次到几十次不同的重复,并由此决定不同的长度类型,因而其蕴含的多态信息量(PIC)较大.STR(short tandem repeat)人类基因组DNA有3109bp，其中10%是串联重复序列，称为卫星DNA。按重复单位的长短，又可分为大卫星、中卫星、小卫星和微卫星。其中重复单位仅由2-6bases组成的叫微卫星（microsatellite analysis），又称它为短串联

4、重复序列(Short Tandem Repeat. STR)，STR是存在于人类基因组DNA中的一类具有长度多态性的DNA序列，不同数目的核心序列呈串联重复排列，而呈现出长度多态性，通常多态性片段长度在100-300bp。一般认为，人类基因组DNA中平均每610kb就有一个STR位点，其多态性成为法医物证检验个人识别和亲子鉴定的丰富来源。不同人体基因组卫星DNA重复单位的数目是可变的，因此， 形成了极其复杂的等位基因片段长度多态性。第三代多态性标志：单核苷酸多态性SNP(single nucleotide polymorphism)单核苷酸多态性(SNP)主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变

5、异所引起的DNA序列多态性。1.1 第一代多态性标志基本步骤： DNA提取用DNA限制性内切酶消化 凝胶电泳分离限制性片段 将这些片段按原来的顺序和位置转移到易操作的滤膜上 用放射性同位素或非放射性物质标记的DNA作探针与膜上的DNA杂交（称 Southern杂交） 放射性自显影或酶学检测显示出不同材料对该探针的限制性酶切片段多态性。 例：EcoR酶切示意图5 AG-GAATTC-GAATTC-GAATTC-CG 33 TC-CTTAAG-CTTAAG-CTTAAG-GC 5AG-G AATTC-G AATTC-G AATTC-CG TC-CTTAA G-CTTAA G-CTTAA G-GC5

6、 AG-GAATTC-GAATCC-GAATTC-CG 33 TC-CTTAAG-CTTAGG-CTTAAG-GC 5AG-G AATTC-GAATCC-G AATTC-CG TC-CTTAA G-CTTAGG-CTTAA G-CGRFLP标记的主要特点：（1）遍布于整个基因组，数量几乎是无限的；（2）无表型效应，不受发育阶段及器官特异性限制；（3）共显性，可区分纯合子和杂合子；（4）结果稳定、可靠；（5）DNA需要量大，检测技术繁杂，难以用于大规模的育种实践中。限制性片段长度多态(RFLP)分析在人群中，不同个体之间，其DNA碱基序列存在着DNA多态性。据估计，大约每100200个碱基中就有

7、一个发生中性替代而出现多态性。尽管这种多态性并不引起疾病，但却可影响到限制酶的切点改变。由于RFLP呈孟德尔式遗传，因此可用为染色体上疾病基因座位的遗传标记，通过RFLP的连锁分析，对疾病进行间接诊断，来推测一个家庭成员和胎儿是否携带有遗传病。我国在20世纪80年代中期已应用这一技术成功地进行了地中海贫血病、苯丙酮尿症等遗传病的基因诊断。RFLP连锁分析是一种十分有用的遗传病诊断技术，适用于诊断任何一种单基因遗传病。由于DNA多态性基因座普遍存在于人体基因组中，即使突变的遗传病基因序列或基因产物还不清楚，但只要找到和突变基因连锁的RFLP基因座，就可以利用RFLP连锁分析进行遗传病的基因诊断和

8、产前诊断。有人提出如果建立起一套以20cM间隔的平均分布于整个基因组的RFLP基因座，并选用合适的探针，就有可能对所有的遗传病进行基因诊断。第一代多态性标志的应用 （1） 1978年YW Kan 首次利用RFLP对镰刀形细胞贫血实现了产前基因诊断 Hpa I珠蛋白基因片段（kb） Hb基因型 总 计 13.0kb片段的频率 7.6/7.6 7.6/7.0 7.0/13.0 7.6/13.0 13.0/13.0 白人AS 5 1 1 9 0 16 0.31 SS 0 0 0 4 11 15 0.87 AA 12 0 0 0 0 12 0 黑人AA 8 6 0 1 0 15 0.03 亚洲AA 1

9、5 0 0 0 0 15 0 镰形红细胞贫血症基因诊断示意图：限制酶Mst所识别的DNA碱基序列是CCTGAGG，而这是正常珠蛋白基因(A)第6个密码子及其前后的碱基序列。经Mst切开，形成1.15kb和0.2kb两个片段。但当正常珠蛋白基因突变为镰形细胞贫血基因(S)时，第6个密码子GAG突变为GTG，于是CCTGAGG变成 CCTGTGG，而不能被Mst所识别，以致酶切时产生1.35kb的DNA片段。据此，可以对镰形细胞贫血病进行基因诊断。（2） X连锁的RFLP以血友病A的诊断为例，血友病A是一种X连锁隐性遗传病。用V因子基因的cDNA片段作为探针对待检者DNA酶切片段进行杂交，就可检出

10、V因子基因部分缺失的男性患者和女性携带者。家系-1患有严重的血友病A，经V因子治疗后产生V因子抑制物。用两种不同的内切酶和探针组合对家系成员作RFLP分析。应用Bcl I/探针B（V因子基因）V因子基因部分缺失所致血友病A的基因诊断探针A是V因子基因1.7kb Kpn I cDNA 片段，包括112外显子。探针B是V因子基因4.7kb EcoR I cDNA 片段，包括1425和部分26外显子。A、B、C、D代表X染色体。患者无Bcl/探针1.2和4.4bk,但有Sst I/探针A14.5kb、4.7kb EcoR I cDNA片段，包括1425和部分26外显子，患者不见1.2kb和4.4kb

11、。应用Sst I/探针A（因子基因1.7kb Kpn I cDNA片段，包括112外显子），患者和他的母亲（必然杂合子）出现异常的14.5kb。这一实验结果表明，V因子基因3端部分缺失后，其5端残留部分可由Sst I/探针A检出。杂合子兼有Bcl I/探针B检出的1.2kb和4.4kb与Sst I/探针检出的14.5kb。1.2 第二代多态性标志 串联重复多态性的类型 类 别 重 复 单 位 的 大 小 主 要 染 色 体 区 域卫星DNA（100kb） 1（AT） 2548 着丝粒等异染色质区 2 和3 5 大部分染色体中 alphoid DNA 171 Sau3A family 68 1/

12、9/13/14/15/21/22/Y的 着丝粒等异染色质区小卫星DNA（0.120kb） 端粒家族 6 端粒 超变家族 924 端粒附近微卫星DNA （小于150bp） 26 所有染色体中（1） 串联重复多态性的遗传短串联重复序列（short tandem repeat, STR）又称微卫星 DNA,是基因组中广泛存在的一种重复结构 ,它的核心序列一般有26 碱基构成 ,核心序列重复次数构成了遗传多态性。它散布于整个基因组中 ,平均每15kb就存在一个 STR 基因座，具有分布广泛 ,易于检测 ,信息量大 ,由高度多态性并遵循孟德尔共显性遗传等优点。它不仅可以用作绘制基因组遗传图谱和遗传连锁分

13、析的标尺 ,而且可用于法医学中的个体识别和亲权鉴定。右图：用串联重复多态性方法可检测高变常染色体DNA多态性的共显性遗传。等位基因1-4是彼此相关的短小DNA序列。通过限制酶消化能区分多态性片段的大小。 1.3 第三代多态性标志SNP是指由单个核苷酸替代、插入或缺失而形成的分子多态，有时也包括由多个核苷酸插入或缺失造成的点突变，它是人类基因组中数量最多的一种多态形式。人类基因组中总共有300万个SNP，平均每1000个碱基中就有一个。SNP是一种双等位基因（biallele）形式，是基因组中某位点要么突变，要么正常的多态。单个SNP所携带的信息量比不上多等位基因形式的微卫星多态，但在人类基因组

14、中，SNP的数量远远多于微卫星多态。大量SNPs总体所具有的信息量十分可观，大约700900个SNP提供的信息量相当于300400个微卫星提供的信息量第三代多态性标志SNP数量众多、分布广泛、密度大，适于大规模自动化分析。相当一部分SNP还直接或间接与个体间的表型差异、人类对疾病的易感性或抵抗能力相关，这使得SNP在构建第3代高密度的人类基因图谱、阐明个体差异的分子机理方面得到了越来越广泛的应用。目前已有多种方法可用于SNP检测，如根据DNA列阵的微测序法；动态等位基因特异的杂交；寡聚核苷酸特异的连接；DNA芯片以及TaqMan系统等。但不管哪一种方法，首先必须进行靶序列的扩增，然后才能进行其

15、它检测。SNP用作遗传标记的优点(1) SNP在人群中是二等位基因性的，在任何人群中其等位基因频率都可估计出来。(2)它在基因组中的分布较微卫星标记广泛得多。(3)与串联重复的微卫星位点相比，SNP是高度稳定的，尤其是处于编码区的SNP(cSNP),而前者的高突变率容易引起对人群的遗传分析出现困难。(4)部分位于基因内部的SNP可能会直接影响产物蛋白质的结构或基因表达水平，因此，它们本身可能就是疾病遗传机制的候选改变位点。(5)易于进行自动化分析，缩短了研究时间。SNP的意义、致病SNP、疾病易感性SNP、具有诊断价值的SNP、疾病的SNP谱、人表型相关SNP、药物作用与不良反应的SNP、药物

16、剂量SNP未来SNP的发展(1) 进行简单和复杂疾病的遗传连锁分析(linkage analysis)及关联分析(association analysis),用于疾病易感基因定位；而且其定位的精度将比微卫星标记精细得多，可直接用于指导易感基因克隆。(2) 在“药物基因组学”(pharmacogenomics)研究中，可通过检测SNP的遗传多态性标记揭示人群中不同个体对不同药物的敏感性差异的根本原因。从基因水平上深入认识疾病及药物作用的个体差异的机理，指导和优化临床用药。并有可能在此基础上发展个体化医疗(3) 也可用于法医研究的罪犯身份的鉴别、亲子鉴定等，此外在器官移植中供体和受体间的配对选择及

17、物种进化的研究中都将具有重要意义。2 直接基因诊断直接检测致病基因本身的异常。通常使用基因本身或邻近DNA序列作为探针，进行Southern 杂交，或通过PCR 扩增产物，以检测基因点突变、缺失、插入等异常及性质。主要适用于已知基因异常疾病的诊断。2.1 突变型遗传病的直接基因诊断以镰形细胞贫血的Gene诊断为例（1）Southern blot珠蛋白链基因第6位密码子发生突变 GAGGTG 谷氨酸缬氨酸已知限制酶Mst 1识别序列 （CCTNAGG） CCTGAGG CCTGTGG突变后不能识别，则酶切位点消失，限制酶切片段长度发生变化。见右图（2) ASO探针诊断已知突变Gene部位和性质，

18、合成寡核苷酸探针，32P标记，进行斑点杂交。 Normal Gene Probe与正常Probe 杂交稳定 Mutation S Gene Probe与异常S杂交 稳定 右图：上：等位基因特异性寡核苷酸探针（ASO Allele-specific-oligonucleotide ）诊断镰形细胞贫血下：某家系的ASO探针诊断结果2.2 缺失型遗传病的直接基因诊断地贫的Gene诊断珠蛋白基因两侧有pst1酶切位点， pst1酶切正常可得到4.4kb片段珠蛋白基因缺失0.7kb片段， pst1酶切则得到3.7 kb片段为0 右图：地贫的Gene诊断3 动态基因诊断已有的研究表明某些基因表达的变化与特

19、定疾病的发生、发展和转归密切相关，而针对于基因表达变化的检测在一定程度上为疾病的诊断、分类提供了证据。疾病的发生、发展和转归是一个动态变化的过程，而对此过程中特定基因的表达改变检测为疾病所处阶段的界定提供了依据，可以动态的了解疾病的状态。本节从蛋白质、miRNA两方面来阐述基因的表达、调节异常如何导致疾病，以及相应的诊断方式。3.1 蛋白质方面：3.1.1 基因结构改变导致蛋白质的结构或量变化引起疾病基因突变的类型：点突变、缺失、插入、倒位、基因突变和配子突变、动态突变等不同的基因突变类型引起不同的遗传效应1. 基因突变引起遗传密码的改变错义突变（missense mutation）：DNA分

20、子中碱基的取代经转录产生的mRNA后，相应的密码子发生了变化，所编码的氨基酸也发生了变化，翻译成蛋白质后，突变前的氨基酸被突变后的另一种不同的氨基酸取代，使突变蛋白质的氨基酸组成和排列顺序都发生了改变。无义突变（nonsense mutation）：碱基的取代，缺失或插入，使原来编码某种氨基酸的密码子变成了终止密码子，以这种mRNA为模板合成蛋白质时，翻译过程就会被提前终止，mRNA中的遗传信息不能全部翻译成蛋白质，形成一条切短了的，不完全的多肽，使蛋白质的生物活性和功能发生改变。同义突变（same sense mutation）不一起蛋白质氨基酸组成和排列顺序发生任何改变的基因突变。移码突变

21、（frame-shifting mutation）：使阅读框移动的基因突变。基因的碱基序列中发生单个核苷酸，数个核苷酸的缺失或插入，或核苷酸片段的缺失或插入，导致突变区域之后的三联体密码子阅读框以为，突变区以后碱基序列所编码的多肽链的氨基酸序列与突变前的不同氨基酸。2. 基因突变影响hnRNA的剪接结构基因改变导致蛋白质的结构或量变化引起疾病1结构基因的突变会改变蛋白质的一级结构，进而改变蛋白质的空间结构，造成蛋白质功能紊乱甚至丧失，引起相应的疾病。2结构基因的突变还可影响蛋白质合成的量，进而造成蛋白质功能紊乱，引起相应的疾病。3.1.2 基因调控序列变异导致表达水平变化引起疾病细胞间信号异常

22、导致基因表达异常引起疾病 人体的各种细胞间通过激素，神经递质，旁分泌信号等保持细胞间的联系。通过这些细胞间信号调节彼此的代谢。正常的细胞间信号能保证基因表达的正常时间特异性，空间特异性以及正常的表达水平。相反，错误的细胞间信号，会破坏基因表达的时间特异性和空间特异性使培太后的细胞合成胚胎型蛋白，或使一种细胞合成另一种细胞特有的蛋白质，还会使基因的表达水平过高或过低，这些都会导致疾病的发生。3.1.3 细胞内因素导致基因表达异常引起疾病异常的细胞内信号导致基因表达异常引起疾病异常的DNA甲基化模式导致基因表达异常引起疾病3.1.4 不同的病原生物基因通过不同的方式引起疾病。 外源性基因也就是病原

23、生物的感染引起。3.1.5 检测方法：通过结构分析确定基因变异在疾病发生中的作用(1)通过核糖核酸酶切分析找到基因突变的位置(2) 通过杂合双链分析检测基因突变(3)采用化学切割错配检测基因突变(4)采用酶促切割错配检测基因突变通过基因表达水平分析确定基因在疾病发生中作用基因表达分析的主要方法:1.Northern杂交法2.差异显示法3. 消减杂交技术4. 定量RT-PCR5. 基因表达芯片6.基因表达系列分析技术3.2 RNA方面3.2.1 miRNA 与人类疾病miRNAs在发育和分化过程中对基因表达调控起到了广泛而至关重要的作用，目前的呀就发现miRNA和疾病的发生间有一定的联系：如：慢

24、性淋巴性白血病（CLL）病人通常在染色体13q14异常。在这一位点并不存在已知的抑癌基因，然而有两个miRNA基因miR-15和miR-16处于这一位点并且在大部分CLL病人中缺失。人类结肠粘膜中发现了二十八个同的miRNAs。对十二个结肠癌病人肿瘤和癌旁组织中比较发现其中有两个miRNAs在肿瘤中表达量有明显下调。同时这两个miRNAs在胰腺癌中表达下降。随着对于miRNA作用机理的进一步的深入研究，以及利用最新的例如miRNA芯片等高高同量的技术手段对于miRNA和疾病之间的关系进行研究，将会使人对于高等真核生物基因表达调控的网络理解提高到一个新的水平。不同的基因突变类型会引起不同的遗传效应，结构基因改变、细胞间信号异常、外源性基因（也即病原生物的感染）都会引起疾病。通过检测相应基因突变、mRNA表达、蛋白的表达、miRNA的调控，可了解特定疾病的发生、发展和转归，