毒热平注射液对病毒感染巨噬细胞IRAK4表达的影响

1、毒热平注射液对病毒感染巨噬细胞IRAK4表达的影响【摘要】目的研究毒热平注射液对流感病毒感染的小鼠腹腔巨噬细胞株Ana-1表达IRAK4(IL-1reeptrassiatedkinase4,IRAK4)的影响。方法用100TID50流感病毒亚甲型鼠肺适应株A/F/1/47(H1N1)感染小鼠腹腔巨噬细胞株Ana-1后换用10g/l浓度含药维持液继续培养，于12h弃细胞上清液并搜集细胞，提取细胞RNA和核蛋白，进展实时定量PR反响RT-PR和estern-blt实验，分别测定毒热平注射液对病毒感染前后巨噬细胞IRAK4RNA和NF-Bp65蛋白表达程度的影响。结果毒热平注射液可下调病毒感染巨噬细

2、胞IRAK4RNA和NF-Bp65蛋白的表达程度。结论毒热平注射液的抗病毒作用可能与下调依赖yD88的信号传导通路中IRAK4的表达有关。【关键词】毒热平；流感病毒；巨噬细胞；IRAK4固有免疫是机体抵御病原生物侵袭的首道防线，有研究说明，机体针对病毒及其他病原生物等病原相关分子形式(pathgen-assiatedleularpatterns，PAP)的入侵所产生的固有免疫及适应性免疫由形式识别受体(patternregnitinreeptrs，PRR)启动1。其中，TLR7可识别病毒单链RNA，以yD88依赖的信号通路活化免疫细胞，在介导抗病毒免疫应答中发挥重要的作用2。本实验观察毒热平注

3、射液对流感病毒感染后该信号通路中IRAK4信号蛋白的影响。1材料1.1细胞狗肾细胞株DK购自军科院细胞室，由本室传代后使用；小鼠腹腔巨噬细胞株Ana-1购自南京凯基生物科技开展，由本室传代后使用。1.2病毒流感病毒亚甲型鼠肺适应株A/F/1/47(H1N1)，中国中医药研究院中医所提供，本实验室-76保存备用。于九日龄鸡胚尿囊腔连续传代2次后，测血凝滴度为1512。1.3药物毒热平注射液DRP，由黄芩、栀子、灯盏花和猪胆粉4味药物制成的中药复方注射剂，棕色液体，含生药17.4g/L，由广东省康美药业开发提供。1.4试剂DulbesdifiedEagleediu培养基DE培养基和RPI-1640

4、培养基，为GBI公司产品；新生牛血清：民海生物公司产品。生长液：含10%新生牛血清的1640培养液；维持液：不含血清而含2g/l胰蛋白酶的1640培养液；引物及相关试剂由赛百盛生物公司合成提供；RT逆转录试剂盒购自Ferentas公司；SYBRGreenPRasterix试剂盒购自美国应用生物公司。一抗：P65(s-372)，Santaruz产品；二抗抗兔ZB-2301购自北京中山生物技术。2方法2.1小鼠巨噬细胞株Ana-1的培养复苏小鼠腹腔巨噬细胞Ana-1，将细胞混悬于生长液中，375%2培养箱培养，次日换液，3d后传代1次，取生长状态良好的Ana-1细胞，消化液作用5in后，弃去消化液

5、，参加适量生长液，吹打细胞，计数并调细胞浓度为3106/l，移入12孔板,每孔加细胞悬液1l，贴壁培养4h后弃去未贴壁的细胞。2.2药物细胞毒性实验TT比色法待Ana-1细胞生长状态最好时，用0.02%EDTA和0.5%胰酶消化细胞，用生长液调整细胞至所需浓度，将该细胞液参加96孔细胞培养板中，100l/孔，于37、5%2培养箱中培养至致密细胞单层。用维持液将毒热平注射液稀释为不同浓度，参加细胞培养板中，100l/孔，每个药物稀释浓度平行做3个复孔，同时设正常细胞对照。于37、5%2培养箱中培养72h后，用TT终浓度为0.5g/l比色法检测药物对Ana-1细胞的毒性，按Reed-uenh法计算

6、药物最大无毒浓度T0和半数中毒浓度T50。2.3病毒感染性测定TID50的测定用无血清DE培养液对流感病毒F1株行连续10倍递次稀释，将各稀释度的病毒接种于3105/l的DK细胞中，每个稀释度平行做6个复孔，同时设正常细胞对照。37吸附2h后吸弃病毒液换用维持液继续培养，每日在倒置显微镜下观察细胞病变效应，并记录病变程度和孔数，以细胞对照无明显退变，病毒感染细胞病变率达50%及以上的细胞孔为病变孔，细胞病变率小于50%的为非病变孔，按Reed-uenh法计算病毒的TID50ediantissueultureinfetivedsage。流感病毒F1的TID50=10-4.3。2.4毒热平注射液作

7、用于病毒感染的巨噬细胞用维持液稀释100TID50的流感病毒F1株，0.5l/孔于37吸附单层Ana-1细胞1.5h后，吸弃病毒液用温浴的PBS清洗细胞2次后，换用10g/l的含药维持液作为实验药物组，同时设有正常细胞对照组和病毒对照组，每浓度3个复孔。375%2培养箱培养，孵育12h后，吸弃各孔细胞上清液，将12孔细胞培养板用封口膜封闭、标示后迅速放入-76保存。2.5测定IRAK4和NF-Bp65的活性严格按试剂盒说明步骤提取巨噬细胞RNA和核蛋白。采用RT-PR方法引物序列见表1测定IRAK4RNA的表达：PR扩增条件为953in变性，9430s，6030s，7245s；共40个循环，最

8、后是727in延伸。用estern-blt方法测定NF-Bp65蛋白表达程度，-atin作为内参。结果见表1。表1IRAK4的引物序列略2.6统计学方法实验数据采用SPSS软件进展统计分析。结果以s表示，采用t检验，P0.05为差异显著，P0.01为差异极显著。转贴于论文联盟.ll.3结果3.1测定药物对细胞的毒性检测药物的最大无毒浓度T0为1.09g/L，半数毒性浓度T50为2.73g/L。3.2IRAK4RNA扩增产物凝胶电泳分析行实时定量PR反响前，首先要设计引物，因为引物序列适宜与否对于实验有决定性的作用。反响完毕后对荧光定量PR扩增产物行1.5琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下扫描分析结果。见

9、图1。电泳结果说明，扩增的基因长度包括内参-atin均符合设计长度，结果与荧光定量PR一致，说明整个反响体系准确、可靠。3.3毒热平注射液对IRAK4RNA表达的影响以样本DNA稀释后求得的-atin的扩增标准曲线斜率为-3.273，相关系数为-0.998，模板浓度对数值与t值之间呈良好的线性关系。根据标准曲线求出待测样本目的基因RNA的相对拷贝数，与相对应的-atin的相对拷贝数比拟，求出其RNA表达程度。结果如表2所示。表2毒热平注射液对IRAK4表达的影响略结果说明，毒热平注射液能明显下调IRAK4RNA表达的程度。3.4毒热平注射液对NF-Bp65蛋白表达的影响在本实验中我们采用est

10、ern-blt的方法检测核因子NF-Bp65的表达，同时用细胞骨架蛋白-atin为内参，检测样品的内参量和p65蛋白量。将各样品p65蛋白量分别除以其内参-atin含量，即p65/atin灰度值的变化，得到的数值即为内参校正后的各样品中目的蛋白p65相对含量，再用此数值进展样品间p65的比拟和分析，得到p65蛋白含量在不同样品间的实际变化结果。见表3及图2。表3毒热平注射液作用12h后的p65/atin灰度值的变化略毒热平注射液作用12h其p65/atin灰度值的变化显示，病毒对照组与细胞对照组NF-Bp65蛋白表达量差异极显著，10g/l组的毒热平注射液能明显下调流感病毒感染的巨噬细胞NF-

11、Bp65蛋白的表达。4讨论流感病毒常引起下呼吸道感染而致肺损伤，多属于中医的风温肺热玻近年来认为该类疾病气分热盛的同时伴有明显的血分证候，出现肺络受损的病理变化，即“毒损肺络是其深层病机。毒热平注射液是由黄芩、栀子等4味药物制成的中药复方注射剂，具有清热解毒、凉血通络之成效。在前期的研究中我们证实毒热平注射液能抑制小鼠流感病毒性肺炎3，降低流感病毒感染小鼠的死亡率；通过调节细胞因子的活性，纠正Th1/Th2细胞失衡而发挥抗流感病毒作用4。在本研究中，我们讨论毒热平注射液经由依赖yD88信号通路抗流感病毒的分子机制中IRAK4信号蛋白的作用。IRAKs家族在TLRs/IL-1信号通路中起着信号通

12、路连接体和枢纽作用。IRAKs家族包括IRAK-1、2、和IRAK-4四个成员，其中IRAK4是TLR介导的信号通路中的一个重要连接体，在炎症反响的启动和调节中有重要意义5。LTR7与流感病毒结合后促进本身的二聚体化以及与连接蛋白yD88的结合，yD88通过其死亡域(deathdain)与白细胞介素-1受体相关激酶4(IRAK4)结合，两者作用导致IRAK4的自身磷酸化，从而激活肿瘤坏死因子受体相关因子-6IRAF-6，使有丝分裂原激活蛋白激酶(itgen-ativatedprtEinkinase，APK)家族活化，最终活化NF-B，控制炎症因子的分泌：如IL-6、IL-1、TNF-和N等。在

13、本实验中，我们发现流感病毒感染的巨噬细胞内，通路中的信号蛋白IRAK4RNA和NF-B蛋白的表达显著高于细胞对照组，说明病毒感染后IRAK4表达升高可活化NF-B，使其活性增强。NF-B的适度活化对于机体抵抗病原微生物的危害具有重要意义，NF-B调节包括生长因子、转录因子、细胞素、趋化因子、抗凋亡蛋白等在内的基因转录：产生大量的前炎症因子、趋化因子以及/干扰素等，在病毒入侵机体的早期即可通过其介导的信号转导途径引起相关基因的表达，这些基因产物就可启动和调节固有免疫，并诱导适应性免疫的产生，在早期发挥抗病毒作用。但是，炎症因子和趋化因子的过度表达还会损伤组织，加重流感病毒所致的病理改变，如肺损伤

14、，促进病情的进一步开展。毒热平注射液能适度下调IRAK4RNA的表达，从而引致NF-B蛋白表达降低，减轻炎症反响。我们的研究说明，IRAK4在TLR依赖的免疫应答中起关键作用，毒热平注射液可能通过降低IRAK4的表达发挥抗病毒作用。在TLRs/IL-1信号通路中IRAK4的激酶活性对P38和JNK的活化有何影响还有待本实验室进一步研究观察。【参考文献】1SatS,St-Pierre,BhauikP,etal.Galetinsininnateiunity:dualfuntinsfhstslublebeta-galatside-bindingletinsasdaage-assiatedleularpatterns(DAPs)andasreeptrsfrpathgen-assiatedleularpatterns(PAPs)J.IunlRev,2022,230(1):172.2ShhEIKyaa,KenJ.Ishii,HianshuKuar,etal.DifferentialrlefTLR-andRLR-SignalingintheiunerespnsestinfluenzaAvirusinfetinandvainatinJ.Iunlgy,2022,179:4711.3张艳丽，顾立刚，范新生，等.毒热平注射液抗甲型流感