安徽乌菜游离小孢子培养及植株再生体系建立

1、安徽乌菜游离小孢子培养及植株再生体系建立摘 要：以 6 份安徽乌菜为试材，研究基因型、 6-BA 、AG 对乌菜小孢子胚状体发生的影响及6-BA 对植株再生的影响。试验结果表明，不同基因型乌菜的小孢子胚诱导率具有明显差异， 6 份乌菜材料中有3 份诱导出胚状体， H-4 出胚率最高，平均每花蕾诱导 8.76 个胚； NLN-13 培养基中添加 0.2 mg/L 6-BA 和 AG 10 mg/L 均能促进胚状体发生， 后者促进作用更明显； MS 培养基中添加 1 mg/L 6-BA 可提高乌菜胚状体成苗率。关键词：乌菜；小孢子培养；诱导率；胚状体；植株再生中图分类号： S634.4 文献标识码

2、： A 文章编号：1001-3547 （2017） 06-0029-04安徽乌菜是安徽省名优特产，是十字花科芸薹属白菜亚种的一个变种，杂种优势明显，常规杂交法育种年限较长，结合现代生物技术进行乌菜育种对提高育种水平和效率至关重要。游离小孢子培养是育种中最有效的生物技术之一，在大白菜、不结球白菜、菜菜等十字花科蔬菜作物上多有报道 14 ，而对于乌菜的小孢子培养研究较少，存在胚状体诱导率低的问题。本试验选用 6 份不同基因型的安徽乌菜为试材， 进行游离小抱子培养，探讨6-BA （6-节氨基喋吟）和AG （阿拉伯半乳聚糖）对乌菜游离小孢子培养胚状体诱导率的影响及 6-BA 对胚状体植株再生的影响，为

3、建立优化乌菜游离小孢子培养技术体系提供参考。材料与方法?验材料选用安徽地方乌菜材料6份， 材料编号1403、1404、1408、1416、 1418、 H-4。试验材料于 2015 年 9 月 6 日播种， 10 月 4 日定植，露地栽培，常规管理。 2015 年 12 月，每份材料选取10 株移植到塑料大棚。2016年34月初花期至盛花期选取适宜大小的花蕾进行游离小孢子培养。试验方法胚诱导培养小孢子培养基本操作流程参照申书兴等5 大白菜游离小孢子培养方法。在初花期至盛花期，于晴天8: 0010: 00,选取健壮、大小适宜的花蕾（花瓣与花药长度比例1 ： 23 ： 4,多数小抱子处于单核靠边期

4、），以主枝和一级侧枝上的花蕾为宜。放入25 mL 无菌小烧杯中，首先用70%酒精消毒30 s,其次用2.5% NaClO溶液消毒5 min,然后用无菌水冲洗3 次；加入 B5 无菌液体培养基，用玻璃棒轻轻挤压使小孢子游离出来，经 350 目滤网过滤，收集滤液于 15 mL 旋盖离心管中，于 1 000 r/min 离心 3 min ，弃上清，重复 2 次，得游离纯化的小孢子。将分离纯化后的小孢子分别附加0、 0.2、0.4 mg/L 6-苄氨基嘌呤（ 6-BA ）或 0、 5、 10、 20 mg/L阿拉伯半乳聚糖（ AG ）的 NLN-13 培养基制成悬浮液，添加活性炭0.1 mg/mL ,

5、调整小胞子密度约1 X 105个/L ,分装于直径 60 mm 的无菌培养皿中， 以 Parafilm 膜封口， 每份材料取花蕾 25 个，分装于4 皿培养，重复3 次。 33黑暗热激培养 24 h 后，转入 25 黑暗条件下培养，有肉眼可见的胚出现时，转移到转速60 r/min 的摇床上继续暗培养至形成子叶型胚状体，3周后统计胚状体数目。胚状体植株再生利用附加浓度为0、 1 mg/L 6-BA ， 10 g/L 琼脂， 30 g/L 蔗糖的 MS 固体无菌培养基作为胚状体成苗培养基，将获得的乌菜成熟胚状体转接入成苗培养基中， 3 周后统计成苗率。结果与分析供体基因型的影响在 6 份乌菜材料游

6、离小孢子培养中，有3 份诱导出胚状体（ H-4 、 1404、 1408） ，占参试材料的50%。其中 H-4 产胚能力较强， 在添加 10 mg/L AG 的 NLN-13培养基中，平均每花蕾可诱导 8.76 个胚； 1408 次之，平均 每花蕾可诱导 2.91 个胚； 1404 平均每花蕾可诱导 1.16个胚。 而 1403、 1416、 1418 则没有胚状体产生。可见，不同基因 型乌菜材料的小孢子培养胚状体诱导率存在差异。6-BA 对乌菜小孢子胚状体诱导的影响在 NLN-13 诱导培养基中加入不同浓度的 6-BA ， 胚状体诱导率统计结果见图 1。对于能诱导出胚的 3 份材料， 6-B

7、A浓度对胚状体诱导率的影响均呈单峰变化，低浓度的 6-BA对乌菜小孢子胚诱导有一定的促进作用。 当 6-BA 浓度为 0.2mg/L 时，胚诱导率达到最高，乌菜1404、 1408、 H-4 平均每花蕾诱导胚状体数目依次为 3.64、 1.16、 0.68 个。AG 对胚状体诱导的影响在 NLN-13 诱导培养基中加入不同浓度AG ， 25暗培养 20 d ，统计结果表明（图 2） ，低浓度的 AG 对乌菜小孢子胚诱导有一定的促进作用，高浓度的 AG 则有抑制作用。当AG 浓度为 10 mg/L 时， 胚诱导率达到最高， 3 份供试乌菜的胚状体诱导率随浓度变化趋势表现一致。6-BA 对胚状体成

8、苗的影响选择成熟的乌菜胚状体转接入成苗培养基（图 3） ，表 1中结果表明，在MS 培养基中加入1 mg/L 6-BA 可提高乌菜试材 1408 和 H-4 的胚状体成苗率， 且促进作用显著， 但 1404的胚状体并未形成双单倍体植株， 说明在培养基中添加 6-BA 并不是对所有基因型的乌菜胚状体成苗具有促进作用。结论与讨论小孢子胚胎发生能力受基因调控。在白菜小孢子培养研究中发现， 不同基因型间小孢子胚状体诱导率差异很大1 ， 6，7。本试验中 6 份供试乌菜有3份可诱导出胚状体，成功率为 50% ，不同基因型乌菜出胚率差异较大，与前人在其他作物上相关研究结果一致。适量的 6-BA 可显著提高

9、白菜小孢子胚状体或愈伤组织诱导率24;蒋武生等8则认为加入 6-BA和NAA抑制大白菜小孢子胚发生。 AG 对小麦、大白菜和普通白菜小孢子培养胚发生和直接成苗有促进作用 9 ， 10 。本试验结果表明，在 NLN-13 培养基中分别添加 6-BA 和 AG 可大大提高乌菜小孢子胚状体诱导率，促进小孢子细胞发育由配子体途径向孢子体途径转变。在一定程度上解决乌菜胚状体诱导率低的问题，但是本试验中 6 份供试材料仅3 份诱导出胚，并不能解决所有乌菜难诱导出胚的问题，所以针对其他乌菜材料胚诱导条件以及胚胎发生机理还需要进一步试验摸索，以优化乌菜小孢子培养技术体系。 本 ?验乌菜小孢子培养过程中， 在

10、MS 培养基中附加 1 mg/L 6-BA 有促进乌菜 1408和 H-4 的胚状体再生植株的作用，而1404 胚状体则未形成植株，可能由试材1404 的胚状体本身生活力弱和其对6-BA的应答反应不同2 种原因共同导致。通过改变6-BA 的浓度或加入一定浓度AG 是否能进一步提高胚状体成苗率尚待研究。参考文献陈晓峰，张明培，徐榕雪，等.影响大白菜游离小孢子培养胚胎发生因素的研究J. 吉林农业科学， 2014 ， 39（ 5 ） ：76-79.付文婷，张鲁刚，胥宇建，等.大白菜游离小孢子胚诱导及植株再生J. 西北农业学报， 2010， 19 （3） ： 139-143.姜凤英，冯辉，王超楠.小白

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13、小白菜) 小孢子胚状体诱导及成苗的影响 J. 中国 蔬菜， 2012 ( 4) ： 62-66.Dissociative Microspore Culture of Anhui Porphyra haitanensis andEstablishment of Plant Regeneration SystemQIN Yanmei ， WANG Mingxia ， JIANG Haikun ， YAN Congsheng，WANG Yan ， TIAN Hongmei ， ZHANG Qian ， FANG Ling( Horticultural Institute ， Anhui Academ

14、y of Agricultural Sciences， Hefei 230031 )Abstract ： The microspore embryogenic impact factors including genotypes ， 6-BA and AG the effect of 6-BA on plantregeneration were studied using the six Anhui Porphyra haitanensis cultivars as the materials. The results showed that the frequency of microspore-induced embryos varied remarkably among the different genptyes cultivars ， and embryos wereincluded from three cultivars. H-4 had the highestinduction rate with the frequency of 8.76 embryos per bud.Adding0.2 mg/L 6-BA or 10 mg/L AG to NLN-13 medium couldpromote the embryos induction ，