核酸转膜、探针标记、-课件

1、实验 八、九核酸转膜、探针标记、分子杂交实验目的学习核酸杂交技术的相关知识及其重要性，掌握点杂交的转膜方法、探针的标记以及分子杂交操作过程。相关知识核酸杂交技术根本上是从Hall等1961年的工作开始的，探针与靶序列在溶液中杂交，通过平衡密度梯度离心别离杂交体。该法很慢、费力且不精确，但它开拓了核酸杂交技术的研究。60年代中期Nygaard 等的研究为应用标记DNA或RNA探针检测固定在硝酸纤维素NC膜上的DNA序列奠定了根底。70年代末期到80年代早期，分子生物学技术有了突破性进展，限制性内切酶的开展和应用使分子克隆成为可能。各种载体系统的诞生，尤其是质粒和噬菌体DAN载体的构建，使特异性D

2、NA探针的来源变得十分丰富。人们可以从基因组DNA文库和cDNA文库中获得特定基因克隆，只需培养细菌，便可提取大量的探针DNA。由于固相化学技术和核酸自动合成仪的诞生，现在可常规制备18100个碱基的寡核苷酸探针。应用限制酶和Southern印迹技术，用数微克DNA就可分析特异基因。特异DNA或RNA序列的量和大小均可用Southern印迹和Northern印迹来测定，与以前的技术相比，大大提高了杂交水平和可信度。目前核酸杂交技术与其它技术相结合广泛应用于特定基因的表达、基因定位、遗传病的检测、组织病理学的研究、生物分类方面。是指将核酸分子固定在纤维膜上的过程。将核酸从电泳后的凝胶中转移到膜上

3、或直接将核酸点到膜上。是核酸杂交过程中的主要步骤之一。转膜探针的标记探针的标记方法：缺口平移、DNA快速末端标记、用T4多核苷酸激酶标记DNA 5末端、随机引物延伸、聚合酶链反响。核酸探针的种类：DNA探针、cDNA探针、RNA探针、寡核酸探针。在选择标记方法时，应考虑实验的要求，如灵敏度和显示方法等。一般认为放射性探针比非放射性探针的灵敏度高。在检测单拷贝基因序列时，应选用标记效率高、显示灵敏的探针标记方法。在对灵敏要求不高时，可采用保存时间长的生物素探针技术和比较稳定的碱性磷酸酶显示系统或过氧化物酶系统。杂交的方法：菌落原位杂交Colony in situ hybridization 、点

4、杂交Dot blot、Southern印迹杂交 Southern blot 、Northern印迹杂交Northern blot、组织原位杂交Tissue in situ hybridization等。菌落原位杂交是将细菌从培养平板转移到硝酸纤维素滤膜上，然后将滤膜上的菌落裂菌以释出DNA。将DNA烘干固定于膜上与32P标记的探针杂交，放射自显影检测菌落杂交信号，并与平板上的菌落对位。菌落原位杂交Colony in situ hybridization点杂交法是将被检测标本点到膜上，烘烤固定。这种方法耗时短，可做半定量分析，一张膜上可同时检测多个样品。为使点样准确方便，市售有多种多管吸印仪ma

5、nifolds，如Minifold I和II、Bio-Dot (BioRad )和HybriDot,它们有许多孔，样品加到孔中，在负压下就会流到膜上呈斑点状或狭缝状，反复冲洗进样孔，取出膜烤干或紫外线照射以固定标本，这时的膜就可以进行杂交。点杂交法Dot blotSouthern blot 是研究DNA图谱的根本技术，在遗传诊断DNA图谱分析、特定基因组的分析及PCR产物分析等方面有重要价值。Southern印迹杂交根本方法是将DNA标本用限制性内切酶消化后，经琼脂糖凝胶电泳别离各酶解片段，然后经碱变性，Tris缓冲液中和，高盐下通过毛吸作用将DNA从凝胶中转印至硝酸纤维素滤膜上，烘干固定后即

6、可用于杂交。凝胶中DNA片段的相对位置在DNA片段转移到滤膜的过程中继续保持着。附着在滤膜上的DNA与32P标记的探针杂交，利用放射自显影术确定探针互补的每条DNA带的位置，从而可以确定在众多酶解产物中含某一特定序列的DNA片段的位置和大小。Southern印迹杂交 Southern blot这是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上的方法。DNA印迹技术由Southern于1975年创立，称为Southern印迹技术。RNA印迹技术正好与DNA相对应，故被趣称为Northern印迹杂交，与此原理相似的蛋白质印迹技术那么被称为Western blot。Northern印迹杂交的RNA吸

7、印与Southern印迹杂交的DNA吸印方法类似，只是在进样前用甲基氧化汞、乙二醛或甲醛使RNA变性，而不用NaOH，因为它会水解RNA的2-羟基基团。RNA变性后有利于在转印过程中与硝酸纤维素膜结合以及保持其单链状态。Northern印迹杂交Northern blot组织原位杂交简称原位杂交，指组织或细胞的原位杂交，它与菌落的原位杂交不同。原位杂交是经适当处理后，使细胞通透性增加，让探针进入细胞内与DNA或RNA杂交。因此,原位杂交可以确定探针的互补序列在胞内的空间位置，这一点具有重要的生物学和病理学意义。例如，与细胞RNA的杂交可精确分析一种RNA在细胞中和组织中的分布。此外，原位杂交还是

8、显示细胞亚群分布和动向及病原微生物存在方式和部位的一种重要技术。组织原位杂交Tissue in situ hybridization实验材料及试剂：用于点样的DNA (质粒DNA)，用于标记的DNAPCR产物)，杂交膜，UV-Cross Linker或烤箱，North2South Direct HRP Labeling and Detection Kit(chemiluminescent detection)该试剂盒包含Northern 和Southern杂交中标记与化学发光所需试剂。操作步骤示意图探针制备：10ng 溶于10l水中的DNA 在95变性5分钟。然后在冰上放置5分钟(为得到好的结

9、果，标记的核酸中不能有蛋白污染，而且应溶解在极纯的水中。如果含盐的浓度大于10mM将影响标记反响);参加10l North2South Direct Stabilized HRP 标记液;参加10l North2South Direct Reaction Buffer。45-50温育15分钟或3730分钟。注意：在参加酶稳定剂前不要用冰冷却探针，否那么将在膜上出现小斑点。参加30l North2South Direct Enzyme Stabilizer, ng/l;稳定剂参加后将探针冻起来或立即使用。未用的探针可以冻存。在再次使用或再次冻存时混匀。杂交前准备：使用前使所有的试剂温度到达室温;

10、将杂交炉和保温装置调到适宜温度;准备洗涤缓冲液： 2X SSC/0.1%SDS：100ml 20X SSC + 10ml 10% SDS +890ml water 加热至杂交温度。 2X SSC: 100ml 20X SSC + 900ml H2ODNA点膜试剂准备: 1N NaOH，2SSC-200mlRT，2SSC/0.1%SDS 200ml55DNA变性pCMV-Myc-T10,250ng/l,5l为单链形式:在无DNAmllDNA和20l无核酸酶的水混合，使终浓度为10ng/l。煮沸5分钟，立即在冰上冷却5分钟。准备杂交膜：注意：带无粉末的手套，用乙醇清洗过的镊子来操作膜a. 用45l

11、 0.1N NaOH稀释 5l 变性DNA，使其浓度为10ng/l，N NaOHng/l。 b.分别将各稀释样品点1l于膜上。虽然干膜也可以得到结果，最好还是预湿膜，在半干的时候点样。c.在1TE中快速10秒润洗。微波炉高热2分钟，紫外交联或干烤固定2小时。注意1：取膜要用镊子小心的夹取膜的角。在各步骤之间最好将镊子在乙醇里浸泡并使其枯燥。杂交之后、洗膜之前换洗膜的容器会使杂交结果更干净；注意2：在杂交、洗膜和检测期间不要让膜枯燥；注意3：杂交缓冲液在杂交期间可能变色。预杂交和杂交室温下， 将等体积的North2South 直接杂交缓冲液成份1与成份2(North2South Direct H

12、ybridization Buffer Component 1,2)混合，配成足以覆盖膜的杂交缓冲液，每cm2ml。混合容器并于55C温育；温育杂交缓冲液至少5分钟后，参加膜并在适当温下预杂交至少15分钟，同时轻柔搅动振荡或翻转。确保膜均匀接触缓冲液。杂交缓冲液包含封闭试剂，因此这步包括封闭和预杂交两步；预杂交步骤2之后，参加HRP标记的探针，每ml杂交液中DNA 探针8ng (5 - 10 ng )；注意：在参加杂交缓冲液之前，不要加热HRP标记的探针。标记探针之后，核酸双链不会复性。不需要加热，否那么将使HRP失活。在适当温度下温育1小时可延长至4小时，同时轻柔搅动振荡或翻转。不要温育超过4小时。洗膜杂交之后，将膜转到一个新的盛有洗膜缓冲液2XSSC / 0.1%SDS的容器中。在与杂交相同的温度下，用40ml约0.5 ml/cm2缓冲液洗膜三次，每次5分钟。在室温下，用2XSSC洗膜三次约0.5 ml/cm2，每次5分钟。底物显色制备化学发光工作液，将等体积North2South发光/增强溶液(North2South Direct Luminol/Enhancer Solution)与North2South稳定过氧化物溶液(North2South Direct Stab