染色体步移步骤复习过程

1、染色体步移步骤染色体步移技术(Genome Walking)是一种重要的分子生物学研究技术，使用这种技术可以有效获取与已知序列相邻的未知序列。染色体步移技术主要有以下几方面的应用：.根据已知的基因或分子标记连续步移，获取人、动物和植物的重要调控基因，可以用于研究结构基因的表达调控。如分离克隆启动子并对其功能进行研究；.步查获取新物种中基因的非保守区域，从而获得完整的基因序列；.鉴定T-DNA或转座子的插入位点，鉴定基因枪转基因法等转基因技术所导致的外源基因的插入位点等；.用于染色体测序工作中的空隙填补，获得完整的基因组序列；.用于人工染色体PAC、YAC和BAC的片段搭接。其主要原理是根据已知

2、DNA序列，分别设计三条同向且退火温度较高的特异性引物(SP Prime。，与退火温度较低的兼并引物，进行热不对称PCR反应。现在有很多Genome Walking Kit,相应的说明书都介绍的很详尽，下面给你发一个原理图：引物设计结合原理：未知序列区n未知序列区I已知序列区AP1 PrimerSP3SP2 SP1第一次巢式PCR反应;（引物为 SP1 和 AP1 Primer）AP1 Primer: =1SP1 Primer: .首先进行五个高退火温度的高特异性反应 然后进行一个极低退火温度的低特异性反应J进行热不对称PCR反应首先进行2个高退火温度（一般65）的高特异性反应共进行15 然后

3、进行1个低退火温度（一般44F）的低特异性反应个大循环第一次巢式PCR反应产物如下;特异性产物一，含量较低 非特异性产物I*含盘较高 非特异性产物11一，含量较高第二次巢式PCR反应:污 I 物为 SP2 和 AP1 Primer）进行热不对称PCR反应AP1 Primer; = SP2 Primer:首先进行2个高退火温度（一般65七）的高特异性反应一共进行15 然后进行1个低退火温度（一般44 C）的低特异性反应个大循环第二次翼式PCR反应产物如下;特异性产物-含吊很高 非特异性产物I含量很低 非特异性产物H,含量很低第三次巢式PCR反应；（引物为 SP3 和 AP1 Primer）进行热

4、不对称PCR反应首先进行2个高退火温度（一般65七）的高特异性反应扶进行15然后进行1个低退火温度（一般44C）的低特异性反应一个大循环AP1 Primer特异性产物-含量非常高 三T二二SP3 Primer图1. Genome Valking Kit的实验原理图大致的原理是这样的，依据 TaKaRa的试剂盒，具体的操作步骤如下:1.基因组DNA的获取。基因组DNA的质量是侧翼序列获取成功与否的关键因素之一。建议不要使用只经过简单处理的基因组DNA （例如：只进行细胞热处理或蛋白酶处理）作为模板，而要使用经过充分纯化的完整的基因组DNA。止匕外，由于本方法灵敏度极高，模板 DNA 一定不要污染

5、，所需的DNA量不要少于3仙名.已知序列的验证。在进行PCR实验之前必须对已知序列进行验证，以确认已知序列的正确性。具体方法为：根据已知序列设计特异性引物（扩增长度最好不少于 500 bp）,对模板进行PCR扩增，然后对PCR产物进行测序，再与参考序列比较确认已知序列的正确性。.特异性引物的设计。根据验证的已知序列，按照前述的特异性引物设计原则设计三条特异性引物，即：SP1、SP2、SP3o. 1st PCR 反应。基因组DNA经OD测定准确定量后，取适量作为模板（不同物种的最佳反应DNA量并不相同，实际用量参考下面的注*1）,以AP Primer （四种中的任意一种，以下以API Prime

6、r为例）作为上游引物，SP1 Primer为下游引物，进行1st PCR反应。按下列组份配制1st PCR反应液。Template (基因组 DNA ) x ng *1dNTP Mixture (2.5 m M each 8 口 TOC o 1-5 h z 10LA PCR Buffer II (Mg2+ plus)5 lTaKaRa LA Taq ? (5 U/ 位 10.5 a lAPI Primer (100 pmol/ X 11 plSP1 Primer (10 pmol/ X 11 ldH2Oup to 50 口1st PCR反应条件如下：94 c 1 min98 c 1 min94

7、 c30 sec6068 c *2 1 min5 Cycles72 c 24 min*394 c30 seq25 c3 min；72 c24 min*394 c30 seq6068 c *21 min；72 c24 min*394 c30 seq6068 c *21 min；72 c24 min*315 Cycles94 c30 seq44 c1 min；72 c24 min*3 72 c 10 min. 2nd PCR 反应。将1st PCR反应液稀释11000倍后，取1仙祚为2nd PCR反应的模板，以AP1 Primer为上游引物，SP2 Primer为下游引物，进行2ndPCR反应按下

8、列组份配制2nd PCR反应液。Template （1st PCR反应液）1 仙 l *4 dNTP Mixture (2.5 m M each) 8 l TOC o 1-5 h z 10LA PCR Buffer II (Mg2+ plus)5 lTaKaRa LA Taq ? (5 U/ 位 10.5 lAPI Primer (100 pmol/ X 11 plSP2 Primer (10 pmol/ X 111dH2Oup to 50 口2nd PCR反应条件如下：94 c 30 sec6068 c1 min*2 ;72c 24 min*394 c 30 sec6068 c1 min*2

9、；72 c 24 min*3 15 Cycles94 c 30 sec 44 c1 min ;72 c 24 min*372 c 10 min. 3rd PCR 反应。将2nd PCR反应液稀释11000倍后，取1仙祚为3rd PCR反应的模板，以AP1 Primer为上游引物，SP3 Primer为下游引物，进行3rdPCR反应。按下列组份配制3rd PCR反应液。Template （2nd PCR反应液）1 仙 l *4dNTP Mixture （2.5 m M each）8 l TOC o 1-5 h z 10LA PCR Buffer II (Mg2+ plus)5 口TaKaRa L

10、A Taq ? (5 U/ 位 10.5 口API Primer (100 pmol/ X 11 仙 lSP3 Primer (10 pmol/ X 111dH2Oup to 50 p l3rd PCR反应条件如下：94 c30 sec6068 c *21 min；72 c24 min*394 c30 sec6068 c *21 min；72 c24 min*315 Cycles94 c 30 sec 44 c 1 min；72 c 24 min*372 c 10 min.取 1st, 2nd, 3rdPCR反应液各5口使用1 %的琼脂糖凝胶进行电泳。.切胶回收清晰的电泳条带，以 SP3 Pr

11、imer为引物对PCR产物进行DNA测 序。染色体步移的注意事项* UMLEK 甲现号QTAUCIW）引物跣计（力特异嵌套弓I物与筒并引物的退火泡更要求至少相差10嗖以h简并引物：按照物种普姻存在的蛋白段的保守狐基酸序列设认一痴峋并引物；筒并引物相对较 &长度为14 bp退火温雌） ,要考虑倒谶并性口为了勒晌井引物与目标序列间退火的可能临除 了3端的S个碱基以外，其它位置的嵋包含他井核甘酸.（5）特异性引物的设计；特异性引物设计示意图（以兼取5,序列为例）未就区域已知序列区AP Frif Blrtdinc Sit* * SP3 SFW SF1特异性引物根据经过验证的已知序列区（最好不少于500

12、 bp）设计三个的性引物（虹图）：设计方向为需要扩增 的未知区域方向，SP2的位置底设计在SP1的内网SP3位于$屋的内掠每两4sl物之间的距离没有严格 规定，f 以66100bp为宜n引物设计原则：引物的长度为2226瓶GC含量将55狗Tm（帧70七， 引物Th也il篁公式:TmW83+0.41CGC 如100-65。儿引物城基数在设计卷异性引物时,SP3用 而 不理用离未知序列区域太远，TR以100用为宜，以增M糊味知序引物设计列的有效长度.其他要 求和普迪PCR反I、眺引物相也1PCTO引物相为电福已将算引物应领较低硒工而新并引物的浓胭疏，T&为2. 5-5. OprnML以满 足引物的

13、结合妓串.龄横*的鞫邦格敷根据需要格上一 wo诚胸液稀帮 Torn 辰 取1西为榄札地悄先建被使腓（尔反攻原就甲 作为模ft进行PCR反瓦如果PCR扩增效果不理想.可遍与稀附GR反/那涵酗加7PGR反麻 适洋内可以摸索一个情择微fit的梯蜃来硝定最佳的稀释（辙二鹿#精异性引聊储浴I物的选择直谶响扩酗效果.加味不黜脚鬻意的扩峭果，具峋读在预备实 验巾重新设“特册用物或者突用其它的胸井物.EJLPCR反应中，后将发#1循环的退火温1克设为65七左右.鼓低将件件循环的退火温度设为44c T d断寺异性循环的退火温度说在庙严糕的W坏中,四火温度强尽可能高，tWHlWlTm 世嘤高1图虻可根掷需要恍提延

14、伸忖间，延侧向长可以疑取今受长的DNAT段，但是容易产生，的舁榭PCRT增： 推荐延伸时间为2 min.TAILPCR产物分析在多教情况下，第T反应有较多的非特异性产物场图9与图1Q所示兀由卬1和AD为闻物犷用出的神异性片段在第轮反就中由于量小而不一映出蒸当唧2替代甲晦行但啦阳3, T1附 异性和踊失，播异性的产物粒选雌地历增而显凰欲增加嶙嘛麻肆第可期肥置海砂设黄为反力产期的热不对称的瑜也由于秋阚铝I物胜第T反鹿中TM、能护造到可施检遍的水王田比可以省第 嘀黑胶屯泳分析，仅仅松u倒n&和第二:而狗来振得特异性的目标片段,取第第 二和.第三轮反应，.物成批占博.南,他舁弓I檄是嵌套的，国此阵异均

15、坐拙赭峰二施曲犷物小F 驾一轮反扁产班不同的AD引物的犷物蟀不同.有黑的俄IFCR犷喇I的目标片段的大小闹蜥250bp2kk出皿引物在特算性引物的下的谆小鼠幽M同心标I网有时会产生4以上不同即你鼬舁性片段他阍10所云），这时可以滋择地强爆BJ片堰边行后唉/脸处用IHind m digest1atpcR:扩增产物2nd PCR扩增产物: 3rd PCR扩增产物5i DL2.000 DNA Marker朋 TA1LB& 看见忖分新1W三次P6扩增结果均显示蒯磔花 是由M潞三囱渊条带郃诳TONAI的回收观咛？格 不涮鼠后一饰扉性产物集比前N施6go0 bp节dPCRP物比2ndpcR户械短时 可以

16、同PORT物皿计J和P引物的白犷产物或SP1引物的T图异性仁增结果，粕敏回收触网2）扣果四种AP引懒骰有苗增留苗睛晰条带.惊阚是什么,嫡弥什么解决措施了16httpy/hlxnei aVbbs/fonni(ll8plsy.php?fld=55HeiiMWt.cr 版加14 堂船如果后随gRT增都没有得刎渊断条带，可以昼世格上班的PCR/M蝴行适当而酿解 碗再进行PCR向通电厂党志成i&l,.蛆DW哽生用存的*峋PCRI方相i,脑而此忖可以找M陵征:SA恒IDI5的用新轴化翳因组6n总将异性引物的也计时副序列趣撷期i至美重要的伟肋当使用四架AP引辘抚理想球时，醒考 虑克湿用弱异性引物,恃异性引物

17、设计时应严格理守说娜由关于监异椎引物晚计的原则.可以餐试适当增山吗nd PCR反府的循环阐敢.箫 我取的AM 例柳M,套峰,是什么原因?答: 酬可能是1附异性F堪 或PCM物例 也将可能也*A本身结构归杂。可t国新设H测序引 物.或考虑君酬师.4）第一次和第用25Ml体系？船用2印度回体科操拜不皿il体朗想*所/蜗研50U邸琳科口妙干扰闲霓5）足;*?可以使用 哪呢1能代替Mafia5鼻?料：用其它Tar雨缩果不iiTWKaRa5T明哂急上要我取较即跑转产物.最好!槌箕KsRaLATaq0 . ndl-ta其成植物姻同具停美取方帙可学考EMD酷：将踊的部谢船市而火前后，僦上旭f ,最后用港氮燃

18、而耗辆群产品.0培格E睁I瞰培卿画静檄，取1_5E的培养物驾心6 mlm嫌塌体，将莉甘的水吸山，班磨至粉末状倒入1.5ml日喷露 加入的即_球顶冷的基因提麻液（50 mMTrisa 80）. lOOrrl EDT岫箕闻50mMMaCI加虑浦i）,搬混见iUl3OpL1O%SDS和3 PL/0洲半白酹匕 混勾京7演育1 h（4） MM12K5M MaCl：在BOOH代I密解沏MMaCl加水定容至1 U充分眄后，4M1XM 依6PLeW州ad赭激榴04点耀机WMgNaCI.娜枷入10g CT即（H电钻白遍溟化 快），同时加热并热胖，如果需要，可加热至6s（根 定偿体积至100制打泡匀后6s七温箔3

19、0rrin5巾LX等徘谢酬氯的尚J漉（25241）.泥翅IMGpm黑心lOnin,将蹄浏1八一Hli管巾， 啾骗积的筑仰期通侬:。翔匀，1M00rpmS1（Wa格居睇入一支斯管中二7）力【人等体积异K雷，髓混合直到DN咫流下.焉室温螃（lOmin, 120丽离心10Em 族 睢. S）用60aL 70%乙髓镣沉淀两犯耳空冷醐丁后，加无矗雄解，s）所幽山闻明.阴麻掘制渊:分析，紫外般他照及与已特序列的验证的施PCR玄蛾前必则已知/例肺粒证，即认己赳序列的醐性口具体楸如慨驯1 列设押除性号瞅酰敏好秒于500bp） .对蜥新PC用门#,器后对RCR产物曲潮（序，耳 与零考序列触睢认己却序列的正砒1S

20、） 异性弓【物的设th根据验证的函序列，按嶷前述的特异性引物设“惊则选汁三条骄兵性弓物,即t SP1. SP2、SPiXgKKMMS ffi耳体,单为幡可为CTABSDfitt,（1）物碑用画解阚帝灭曲后,在冰!漱置T.最后用颛值净E席茶国同界居， g翔恪足旨翻增姆幽则脯，取1，b的鞫朗乳5由收融圾格表面的水破干后就胪丽就引入1时国管也 加小函融的幽翻液丽町闭8办100 nW 日K厢H&0山16CTTWM3的程篇）, 鹤湿%.（3）皿网410判508襦以20由M批自JfiK.漏劣后3roM加帆14）加入112 5pL到NaCl（阳外醴水中油靴袈2ghlaa如点定学至1L）先械匀后一当加人施批

21、的6印LCT阳Nad溶液使80R蒸绸次喻静枷如10口CT距，?六煽舄一，耳制匕 酸）*悚枷捌廨拿柴林可加塞睁14100畤期而C5C蜩0E（6）旅也体豳翩氧饰T的WS滋力混用120gpm帆JMirh格卜制i铸AT伸1 - 1IIM的职的氢伽兄比愣维1），湖风！aOOQrpNt心1曲面.柳靖溃将AFO腑四/LM琳班异傅懿混音附I剂幅解下悠宽社放置lOntb 第00甲23画面，触 瞄（用打或怔取乙超孤注两编真空的细千氏加上脚睡海田）所时刑期扎（T舫方概Wi脐分甑赛外.励瞰蜴&心已制呼随证，在说尚*烟曲朔蚓己知密曲搬运队已如捋帕斑砒生“舱取必星期,已知审 列窗陶册弓酒rw援购不HWbpj,硼曦瞪/曲明

22、 熟的PC椁喇?再 与明域网认改月明的海琳.S）带鼻性引物的世计工幡验证的改序列.搠蛹谕康腓性引撕蜘鼠*卜三架得州引翱即：SP1、SP2、SP1试剂盒13:12:37这个 lOOtmig 300我 13:12:43哦试剂流13:1246sigma P6556原装CTAB 提取 DNA试和小4) 2KC1B 矍取渔(PH S.0)： 2% CTAB 1.4MNd. 0,C2MEDTA. a.lMTrit-d. 筵他心 髀.即称取 CIAB 2 g 瓜球揣水 40M.加 IMTrixl .将装有CTAB知料根的EP管一施入65 V水浴.的lh31冷却后*加入602的幽1班仿工异戊静|25:24懂-

23、300:288:1 混为，12000rpm.周心 ISrmin.吸土清，装入一新的EP管, 加入 6003 遍怕：I 24-11-576:24 J. 1?OOCrpm %- 15 min 品 吸上请.转入一新的离心管巾，加入皿体板的WHk Cmal/D 九 川入1 El立。工预冷的无水乙肿，混耳历理20匚 2-4h 3, 12000+av lOmih 他上油9.向离心管中加入了5K的己而洗镰基3次，置于噪水瓶上倒置注干 10、加入 d*20 (l&ZDul)溶靴善*代Tks WU被It酸、EDTANa2,2H2O, N箱H、NaCL CTAB、的、敏装、异皮醉、无水乙 醇f NaAc*触氢*端

24、始乙整 砌林、忸淑水浴.离心机、儒心班戈丁 CMR江货取郎冈乳DKA.原理、B 刃界 （TA Eh般词eeylir imeihylaniiDoniunn Iwinide,十六烷半三甲基 ffift it .是一 科对禺子去污利品门从低富子曲型辨泄中沉谑帙靛与酸性多维幅峋精性.在高离子强度的 痛液中向（g|/tNM5CTAB与蛋门需和多整幅解成复合精只是不能沉淀林谶口港过 有机落制抽醍.上除赤白.多也卜龄券解杂质府加入乙理沉淀即可使核酸分离出来.CTaRKL取跳N俄的拜典配月liis-HCI :画注Uj提供 个暧冲扑境，历什栈粒枝破耳：EDTA胡合M露+或M n2+国+抑制DNase活性；KaC

25、I枇/ 个高祖环境.使LWP充分谓解.村泄相中；CTAB溶解细胞腱，井结合核酸,他植酸便先高；I麓基乙酵掾抗氧化剂，有藏地Ml匕酎氯化成限，谶如褐文.使除容易去除PVP（辕乙脆毗唯儒耐卜是爵的爵告物.能与多雕形成一种不善的整合物质，有效去除多的， 减少DNA中的的河里；同时它的能和多的砧合，仃虫去除名曲。用凿油摊如施DNN时，有什么祚用?使蛋白质变性.同时抑制了 DNi侬的附餐作用.用蒙醋处理可第视虫由于叠Ei】jDNA戏 结犍己甑:白介子表肉兄含有很多极性基圉与笨酶相但粕溶.蛋自分南.的相.向DMA 希丁水招.小用醐的忧力I金效变性蛋白演*二排制DK的即解作用.蟒如I堆溶界10J59的 求，从而解楣一陋分polAlRNAo 2不fig完全抑疆RNaw峋窑性黑仇的作用?收仿：克服的的蚁且：加速有机粕与泄利分层.能后用发壬抽促二去除依曜溶液中的就廿%* I府马褚丁虹侪中:用的氧油抽提翱的基国蛔：DMA时,通渊婆在酷.鼠脑中如少许异戊解.为什么?邪J骗：减少蛋门妞费怪算作过程中产生的气泡,弁比曲时以降怅衣面也力.从北减少二泡 产僦为外，外虎辞有助丁分相使离心后的I上层含DNN的水