欧洲药典系统适应性测试

1、105Volufne(V2.2.46色谱分离技术色谱分离技术是一种多级分离方法，样品在固定相和流动相之间多次分配，达到动态平衡。固定相一般是附在硅胶或者其它固体载体上的固体或液体，可填充在层析柱上或铺在薄层版/薄膜上，流动相町以是气体、液体或者超临界流体。分离原理包括吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱、分子排阻色谱等，也可根据样品分子的人小、空间体积、质量等物理化学性质来分离。本章介绍了系统适应性测试涉及的参数定义及计算方法，分析方法和仪器介绍等已分别在以下章节做了介绍：纸色谱12.26薄层色谱2.2.27气相色谱2.2.28液相色谱2.2.29排阻色谱2.2.30超临界流体色谱12.45该方法

2、做适当调整以符合药典规定。色谱图反应检测器的响应信号、洗脱剂浓度或体积与时间的关系等。理想的色谱图是在平稳的基线上各色谱峰彼此分离，呈高斯分布。色谱峰色谱柱中洗脱的单个组分或者未分离的多个组分在检测器上的响应信号，是色谱图的一部分。一般用峰面积、峰高h和半高峰宽Wh、峰高h和峰宽旳等参数来描述色谱峰。高斯峰有如卜关系（图2.2.46-1）：Wfl.lSw】保留时间tR组分从进样到出现最人峰所需时河保留体积Vr组分从进样到出现最人峰所需的流动相体积，可用保留时间乘以流速F。Vr=IrXF死时间切不被固定相滞留的组分，从进样到出现最人105Volufne(V105Volufne(VPeak1Pea

3、k2VolumeV)Time(f)105Volufne(V105Volufne(VFigure2.2.46.-1.105Volufne(V定义下面分别介绍系统适应性和验收标准的相关参数定义。有些仪器的软件系统包含了一些特定参数的计算方法（例如性噪比、分离度）。操作人员有责任确认该计算方法是否符合欧洲药典要求，如果有差别，应对峰所需时间死体积VM不被固定相滞留的组分，从进样到出现最人峰所需流动相体积。VM=twXF排阻色谱中用V。表示（见下面）。保留因子k有时用容量因子0或者分配比Dm表示，计算公式如下：_固定相中的组分就士心一一流动相中的组分奩凤表示分配常数，也叫平衡分配系数V,表示固定相体积

4、Vm表示流动相体积在色谱系统中某组分的保留因子也可按F式计算：K%_切加流动相总时间tt,当组分粒径小于固定相胶体孔径的最小尺寸时，该组分从进样到出现最大峰所需时间(图2.2.46-2)流动相总体积vt,当组分粒径小于固定相胶体孔径的最小尺寸时，该组分从进样到出现最大峰所需流动相体积，可按下式计算Vt=UXF滞留时间to：当组分粒径人于固定相胶体孔径的最人尺寸时，该组分从进样到出现最大峰所需时间滞留体积Vo：当组分粒径人于固定相胶体孔径的最人尺寸时，该组分从进样到出现最大峰所需体积，可按下式计算Vo=toXFKo%trt0分配常数ko：表示排阻色谱中某一组分的洗脱能力，也叫分配系数，可用下式计

5、算：105Volufne(V105Volufne(VLGandGC105Volufne(V105Volufne(VSize-exclusionchromatography105Volufne(V105Volufne(VSSEE00202WO5L111Time(f)Figure2.246.-2.1XJ%50-滞留因子rf：在平面色谱中也叫保留因子Rr，表示组分在板上的点到原点之间的距离与溶剂前沿到原点的距离的比值（图2.2.46-3）oA.mobilephacfrontB.spotC.lineofapplicationFigure2246.3B是分析物的移动距离A是溶剂前沿的移动距离塔板数N：可

6、反映柱效，又叫理论塔板数,计算公式如下：NS4等如是组分的保留时间，Wh是该物质的半高峰宽色谱柱类型、柱温、流动相以及化合物类型都会影响理论塔板数的值滞后体积D：也叫梯度延迟体积，指从流动相混合点至柱头的系统体积，可用以下方法计算：色谱柱:用适当的毛细管（如lmX0.12mm）代替流动相：A相是水，B相是0.1%（V/V）的丙酮水时间minA相体积百分比B相体积百分比0-20100-00-10020-300100流速F：能达到足够的反压为准（如2ml/min）检测器：检测波长265nm记录吸光度到达最大值的50%时的时间tos（图2.2.45-4）/(05TimeFigure2.2.46.4D

7、岂XF切丸亍怙，to预设为20minF为流速，单位为ml/min对称因子A色谱峰的对称因子（图2.2.46-5）按卞式计算W0.05表示在二十分之一峰高处峰宽d表示二十分之一峰高处到峰顶点投射到水平线之间的距离兀值为1表示峰绝对对称，人于1则为拖尾峰，小于1则为前置峰分离度&两组分之间的分离度（12.46-1）计算公式如下R5=1.18切2切1whlrh2tR2tRl如1和tR2是色谱峰的保留时间Whi和Wfa2是半高峰宽在定量平面色谱中，用移动距离代替保留时间来计算两组分之间的分离度，计算公式如下：=1.183Wh1+Wh2Rfi和Rk是色谱峰的阻滞因子Will和Wh2是半高峰宽a是溶剂前沿

8、到基线的距离峰谷比(p/v)做有关物质的系统适应性测试时，如果两峰之间的基线分离效果不好，可以用峰谷比作为评价依据(图2.2.46-6)oHp表示基线以上最小峰的最高点到基线的距离Hr表示基线以上最小峰和主峰之间的最低点到基线的距离相对保留因子r相对保留因子的计算公式如卞：tRst+tM阮表示待测峰的保留时间氐七表示参照峰的保留时间切表示滞留时间未调整相对保留因子2计算公式如下:除非另有规定，相对保留因子和未调整的相对保留因子的值基本一致在平面色谱中,用滞留因子Rfh和R/代替保留时间和上比信噪比(S/N)小的噪音峰会影响定量分析的精密度。信噪比计算公式如下：S/N=ftH表示组分的峰高，在参

9、比溶液的色谱图中,测量从信号峰的最高点到基线之间的距离。该信号峰的峰宽至少人于半高峰宽的5倍(图2.2.46-7)oh表示色谱图中噪音峰的最高点到最低点之间的距离系统重现性系统重复性表示至少连续进样三次后，所得相对标准偏差的百分数。计算公式如下：；(%)琴国至y7n-lyi表示内部标准方法中的峰面积、峰高或者面积比的值y表示平均值n表示值的个数系统适应性用于测试的成分应该明确，能满足系统性能和含量测定的要求。系统适应性测试反映了色谱系统的性能，是建立分析方法不可或缺的一部分。柱效、保留因子、分离度、相对保留因子和对称因子等参数用来描述柱子的性能。这些参数可能从以下方面影响色谱行为：流动相的组成

10、、离子强度、温度和pH值流速、色谱柱尺寸、柱温和柱压固定相特性，包扌舌填充剂类型、填充剂粒径、孔径、比表面积反相材料类型或者对固定相表面进行其它的结构修饰除非另有规定，还需满足以卞要求：在相关物质测定或含量测定中，用于定量的参照色谱峰，其对称因子取值范鬧必须在0.8到1.5之间如果某成分的纯度为100%,则可容许的参比溶液的相对标准偏差最人值计算公式如下：片（）nux.翎匸90%n-1K是常数0.349,由公式咅乂畔计算而来，捋表示当B=1.0时，六次进样后的相对标准偏差百分数B表示方法中规定的含量上限减去100%n表示进样次数（3n6）*1表示双侧检验、置信度为90%、自由度为n-1时的t值

11、除非另有规定，可允许的相对标准偏差最大值不能超过卞表（表2.2.46-1）的值，此规定不适用于有关物质测试。表2.2.46-1重复性要求进样次数3456B(%)最人容许标准偏差2.00.410.590.730.852.50.520.310921.063.00.620.891.101.27测试有关物质时，定量限度与此表相等或小于表中数值测试员要根据一些致变因素来选择合适的方案验证色谱系统，以保证在测试过程中色谱系统的适应性不受影响。色谱条件的调整为满足系统适应性，在不对分析方法做根本改变的情况下，可对色谱参数做适当调整。在梯度洗脱时，改变洗脱条件会导致基线漂移，不利于色谱峰的划分识别，甚至会出现

12、假峰和延长洗脫时间。因此要改变梯度洗脫的条件时，需重新验证方法的有效性。系统适应性是定性分析或含量测定结果的有效保障。市售液相色谱柱的固定相材料类型多样，可满足不同色谱行为需要，为满足系统适应性要求，可对色谱条件做适当调整。但是在反相色谱系统中，调整色谱参数不能总是达到既定要求，这时可选择替换色谱柱。网站EDQM上有各种柱子的性能信息，可根据分析需要选择合适的色谱柱。一般文件会明确规定一些重要参数以满足系统适应性。薄层色谱和纸色谱展开剂的组成：对其中较少的组分，调整范I制为相对差值30%或绝对差值2%,可选其中较大的一种，但任何组分的绝对差值不得超过10%。例如含量为10%的组分，按相对差值3

13、0%计算其可调范I韦I在按绝对差值2%计算可调范|制在8%-12%,固可按相对差值计算的范I制来调整。假如一组分含量为5%,按相对差值计算其可调范I制在35-6.5%,按绝对差值计算其可调范閑在3-7%,此时可按绝对差值范I制调整，但是改变范围绝对不能超过10%。除非另有规定，流动相水相pH值可调范I制在0.2个单位，非离子溶剂可调范围在1个单位。缓冲溶液中的盐浓度可调范I制在10%。点样体积：如果薄层板或层析纸的粒度良好（2-lOm）,点样体积可为规定的10-20%液相色谱：等度洗脱流动相组成：对其中较少的组分，调整范閑为相对差值30%或绝对差值2%,可选其中较人的一种，但任何组分的绝对差值

14、不得超过土10%。除非另有规定，流动相水相pH值可调范|韦|在0.2个单位，非离子溶剂可调范围在1个单位。缓冲溶液中的盐浓度可调范I制在10%。流速：一般可在50%范围内调整，如果改用人尺寸的柱子，调整范围可适当加大。色谱柱参数固定相：不能改变固定相填料类型（例如不能用C8柱替换C18柱）粒径：最多可将粒径减小到原来的50%,但是不能增加填料粒径色谱柱尺寸：长度：可调范围50%内径：可调范围25%如果色谱柱尺寸改变，流速也需按以下公式做适当调整：F：方法中规定的流速，单位ml/minF2：改变后的流速，单位ml/min11：方法中规定的柱长，单位mmb：改变后的柱长，单位mmdi：方法中规定的

15、柱内径，单位mmd3：改变后的柱内径，单位mm柱温：10C,除非另有说明，操作时的柱温需明确规定检测波长：不能改变进样体枳：在满足检测限和重现性的情况下可减少进样体积，但不能增加进样体枳液相色谱：梯度洗脱梯度洗脱不像等度洗脱，要改变洗脱条件的话需要慎重考虑流动相：只有在满足卞列条件时才可对流动相组成做微小调整：满足系统适应性要求主峰的洗脱时间改变范闱不超过方法中规定的15%改变后的流动相洗脱能力不能比方法中规定的差如果改变条件不能满足系统适应性要求，则需考虑滞留体积和换色谱柱滞留体枳：实验仪器的布局能显著改变分离度、保留时间和相对保留时间等。如有此情况，可能是滞留体积过人。在开始梯度洗脫程序之

16、前，会有一段等度洗脱过程。考虑到规定的方法与实际使用方法中的滞留体积有差异，可在等度洗脱时调整开始梯度洗脫的时间。测试员有责任使等度洗脱时间适应所用的分析仪器。如果方法中规定了滞留体积，梯度洗脫的开始时间可根据卜面公式换成实际开始时间：D：滞留体积，单位mlDo：实际滞留体积，单位mlF：流速，单位ml/min如果没有等度洗脫这个步骤也不影响数据的有效性，那么此步骤可以省略流动相pH,不能改变缓冲液盐浓度：不能改变流速：色谱柱尺寸改变时可改变流速（公式见前面）色谱柱参数固定相：不能改变填料类型不能改变粒径大小色谱柱尺寸：长度：可调范围70%内径：可调范围25%如果色谱柱尺寸改变，流速也需按以下

17、公式做适当调整：Fi：方法中规定的流速，单位ml/minF2：改变后的流速，单位ml/min11：方法中规定的柱长，单位mm4：改变后的柱长，单位mm山：方法中规定的柱内径，单位mmd2：改变后的柱内径，单位mm柱温：5C,除非另有说明，操作时的柱温需明确规定检测波长：不能改变进样体积：在满足检测限和重现性的情况卞可减少进样体积，但不能增加进样体积气相色谱色谱柱参数固定相：粒径：（填充柱）最多可减少50%,不能增大粒径尺寸薄膜厚度：（毛细管柱）可调范I制从-50%到+100%色谱柱尺寸：长度：可调范围70%内径：可调范围50%流速：50%柱温：10%进样体积和分流体积：在满足检测限和重现性的情

18、况下可做适当调整超临界流体色谱流动相组成：填充色谱中，对其中较少的组分，调整范闱为相对差值30%或绝对差值2%,可选其中较大的一种，但是毛细管色谱系统不能调整流动相。色谱柱参数固定相：粒径：（填充柱）最多可减少50%,不能增大粒径尺寸色谱柱尺寸：长度：可调范围70%内径：可调范围525%（填充柱）可调范围50%（毛细管柱）流速：一般可在50%范围内调整柱温：5C,除非另有说明，操作时的柱温需明确规定进样体枳：在满足检测限和重现性的情况F可减少进样体积，但不能增加进样体枳定量分析定量分析中，流动相中各溶剂或者试剂产生的色谱峰可以忽略。检测器灵敏度。检测器灵敏度是指单位浓度或质量的物质在检测器上的信号输出。相对检测响应因子，一般叫响应因子，表示某组分与标准物质的绝对响应因子之比，也称作校正因子外标法。通过比较待测物质和参考物质的色谱峰面积来计算待测物浓度内标法。将一定重量的纯物质作为内标物加到分析样品混合物和参照物中的分析方法。内标物的选择要符合一些要求：不与待测物发生化学反应，性质稳定，能与其它杂质有效分离，该物质色谱峰不会与杂质或待测物质色谱峰重合。通过比较测试液中待测物与内标物的峰面积/峰高比和参比液中待测物与内标物的峰面积/峰高比来计算待测物浓度标准化程序。某物质的百分含量为该峰的峰面积占所有峰的峰面积的比例，计算时应排除溶剂峰