学习手册-浊度法

1、学习手册情境：浊度法引导文单元设计-实训指导书子情境：引导文浊度法七.阅读材料二材料一、浊度法浊度法：可用来测量菌浓度其原理是发酵罐中的发酵液按照一定的流速进 入流通式比色皿中，用500-600nm的波长检测发酵液的光密度然后发酵液再流 回发酵罐中所测的OD值与细胞浓度成正比。浊度法:可用来测量菌浓度.其原理是发酵罐中的发酵液按照一定的流速进 入流通式比色皿中，用500-600nm的波长检测发酵液的光密度.然后发酵液再流 回发酵罐中.所测的OD值与细胞浓度成正比.也常用于免疫测定，基本原理是：抗原抗体在特殊缓冲液中快速形成抗原抗 体复合物，使反应液出现浊度。当反应液中保持抗体过量时，形成的复合

2、物随抗 原量增加而增加，反应液的浊度亦随之增加，与一系列的标准品对照，即可计算 出受检物的含量。免疫浊度测定法按照仪器设计的不同可以分为两种，即比浊仪测定 (turbidimetermeasure)和散射比浊仪测定(nephelomitermeasure)。比浊仪 测定是测量由于反射、吸收或散射引起的入射光衰减，其读数以吸光度A表示。 A什反映了入射光与透射光的比率(A=2 log10T，T代表浊度百分比)。散射比 浊仪测定是测量入射光遇到质点(复合物)后呈一定角度散射的光量，该散射光 经放大后以散射值表示。，完成以下信息！学*浊度法的原理是。.材料二、微生物群体生长规律微生物细胞数量的增加称

3、为微生物群体生长。由于微生物个体微小 的特殊性，难以针对单个微生物细胞或个体的生长繁殖的研究进行，故除特定的 研究目的外，一般所言的微生物生长是指群体生长。如将少量细菌纯培养物接种入新鲜的液体培养基，在适宜的条件下培养，定 期取样测定单位体积培养基中的菌体（细胞）数，可发现开始时群体生长缓慢， 后逐渐加快，进入一个生长速率相对稳定的高速生长阶段，随着培养时间的延长， 生长达到一定阶段后，生长速率又表现为逐渐降低的趋势，随后出现一个细胞数 目相对稳定的阶段，最后转入细胞衰老死亡期。如用坐标法作图，以培养时间为 横坐标，以计数获得的细胞数的对数为纵坐标，可得到一条定量描述液体培养基 中微生物生长规

4、律的实验曲线，该曲线则称为细菌的生长曲线（growth curve， 见图3-1）。图3-1细菌生长曲线从图3-1可见，细菌生长曲线可划分为四个时期，即：延迟期， 对数生长期，稳定期；衰亡期。生长曲线表现了细菌细胞及其群体在新的 适宜的理化环境中，生长繁殖直至衰老死亡的动力学变化过程。生长曲线各个时 期的特点，反映了所培养的细菌细胞与其所处环境间进行物质与能量交流，以及 细胞与环境间相互作用与制约的动态变化。深入研究各种单细胞微生物生长曲线 各个时期的特点与内在机制，在微生物学理论与应用实践上都有着十分重大的意 义。材料三、生长与繁殖与细胞生长量测量意义I,微生物在适宜的环境条件下，不断地吸收

5、营养物质，并按照自己的代谢方式 进行代谢活动，如果同化作用大于异化作用，则细胞质的量不断增加，体积得以 加大，于是表现为生长。简单地说，生长就是有机体的细胞组分与结构在量方面 的增加。单细胞微生物如细菌，生长往往伴随着细胞数目的增加。当细胞增长到一定 程度时，就以二分裂方式，形成两个基本相似的子细胞，子细胞又重复以上过程。 在单细胞微生物中，由于细胞分裂而引起的个体数目的增加，称为繁殖。在一般 情况下，当环境条件适合，生长与繁殖始终是交替进行的。从生长到繁殖是一个 由质变到量变的过程，这个过程就是发育。微生物处于一定的物理、化学条件下，生长发育正常，繁殖速率也高；如果 某一或某些环境条件发生改

6、变，并超出了生物可以适应的范围时，就会对机体产 生抑制乃至杀灭作用。细菌纯培养的群体生长规律：大多数细菌的繁殖速度都很快，大肠杆菌在适 宜条件下，每20分钟左右便可分裂一次，如果始终保持这样的繁殖速度，一个 细菌在48小时内，其子代群体将达到无法想象的数量。然而，实际情况并非如 此。将少量单细胞纯培养接种到一恒定容积的新鲜液体培养基中，在适宜的条件 下培养，定时取样测定其细菌含量，可以看到以下现象：开始有一短暂时间，细 菌数量并不增加，随之细菌数目增加很快，既而细菌数又趋稳定，最后逐渐下降。 如果以培养时间为横坐标，以细菌数目的对数或生长速度为纵坐标作图，可以得 到一条曲线，称为繁殖曲线，通常

7、又称为生长曲线。生长曲线代表了细菌在新的 适宜的环境中生长繁殖直至衰老死亡全过程的动态变化。根据微生物的生长曲线可以明确微生物的生长规律，对生产实践具有重大的 指导意义。故根据对数期的生长规律可以得到培养菌种时缩短工期的方法:接种 对数期的菌种，采用最适菌龄，加大接种量，用与培养菌种相同组成的培养基。 有如，根据稳定期的生长规律，可知稳定期是产物的最佳收获期，也是最佳测定 期，通过对稳定期到来原因的研究还促进了连续培养原理的提出和工艺技术的创 建。材料一、微生物生长量的测定微生物特别是单细胞微生物，体积很小，个体生长很难测定，意义也不大。 通常测定微生物的生长是测群体的生长，而测定繁殖则都要建

8、立在计数这一基础 上。1测生长量测定生长量的方法有许多种，适用于一切微生物。1.1直接法1.1.1测体积它是一种较为粗放的方法，通常用于初步比较用。例如将待测培养液放在刻 度离心管中作自然沉降或进行一定时间的离心，然后观察沉降物的体积。1.1.2称十重采用离心法或过滤法测定，一般干重为湿重的10%-20%。如用离心法，将待 测培养液离心，再用清水洗涤离心1-5次后干燥，可用105C、100C或红外线 烘干，也可在较低的温度（80C或40C）下进行真空干燥，然后称干重。如细 菌一个细胞一般重10-12-10-13g。如为丝状真菌可用滤纸过滤，细菌可用醋酸纤维 膜等滤膜进行过滤。过滤后，细胞可用少

9、量水洗涤，再真空干燥（40C以下）， 称干重。以乳酸菌为例，在液体培养基中，细胞的浓度大约为2X108个/ml。100 ml培养物可得10-70mg干重的细胞。1.2间接法1.2.1生理指标法与生长量相平行的生理指标很多，它们均可用作生长测定的相对值。1）测定细胞总含氮量来确定细菌浓度大多数细菌的含氮量为干重的12.5%, 酵母菌为7.5%，霉菌为6.0%。总氮量与细胞粗蛋白的含量（因其中包括了杂环 氮和氧化型氮）的关系可用下式计算：粗蛋白总量二含氮量X6.25含氮量的测定方法有很多，常用凯氏定氮法。此法适用于细胞浓度较高的样 品，同时操作过程也较麻烦，主要用于科学研究中。2）含碳量的测定微生

10、物新陈代谢的结果，必然要消耗或产生一定量的物质， 以表示微生物的生长量。一般生长旺盛时消耗的物质就多，或者积累的某种代谢 产物也多。将少量生物材料混入1ml水或无机缓冲液中，用2ml 2%重铭酸钾溶 液在100C下加热30分钟，冷却后，加水稀释至5ml，在580nm波长下测定光密 度值（用试剂作空白对照，并用标准样品作标准曲线），即可推算出生长量。3）其它磷、DNA、RNA、ATP和N-乙酰胞壁酸等的含量，以及产酸、产气、 产CO2 （用标记葡萄糖作基质）、耗氧、粘度和产热等指标，均可用于生长量的 测定。1.2 .2比浊法微生物在液体培养基中生长，由于原生质含量的增加，引起培养物混浊度的 增高

11、。最古老的比浊法是采用McFarland比浊管，用不同浓度的BaCl2与稀H2SO4 配制成的10支试管，其中形成的BaSO4有10个梯度，表示10个相对的细菌浓 度（预先用相应的细菌测定）。某一未知浓度的菌液在透射光下用肉眼与某一比 浊管进行比较，如果两者的浊度相当，即可目测出该菌液的大致浓度。精确的测定，要用分光光度计进行。在可见光的450650nm波长内均可测定。2计数法计数法即是计算微生物繁殖出的个体数目，此法适宜于单细胞状态的微生物 或丝状微生物所产生的孢子。2.1直接法直接法即是在显微镜下直接观察细胞并进行计数的方法，其计数结果是包括 死细胞在内的总菌数。2.1.1比例计数法是一种

12、粗放的计数方法。将已知颗粒（例如霉菌的孢子或红细胞等）浓度的 液体与待测细胞浓度的菌液按一定比例均匀混合，然后镜检各自的数目，求出未 知菌液中的细胞浓度。2.1.2血球计数板法计数一定容积中的细胞总数的常用方法，此法对细胞较大的酵母菌较为适 用。详细方法见实验指导书。2.2间接法是一种活菌计数法，其原理是活菌在液体培养基中生长繁殖使液体混浊，在 固体培养基表面形成菌落，然后计数活菌的方法。2.2.1平板菌落计数法是一种常用的食品中细菌总数的计数法，有标准方法将待测样品稀释，然后 取适宜的稀释度样品与固体培养基混匀，凝固后培养，然后计数平板上出现的菌 落数乘以样品的稀释度，即可计算出样品的含菌数

13、。也可用涂布法将稀释样品接 种在凝固的平板培养基上，后续方法同前。此法的优点是检测的结果较为精确， 缺点是方法烦琐，获得检测结果的时间长。2.2.2液体稀释法对未知样品作10倍系列稀释。选适宜的3个连续的10倍稀释液各取5ml， 接种到3组共15支液体培养基试管中，每管接入1ml，培养一定的时间后，计 录每个稀释度出现生长的试管数，然后查MPN （most probable number ,最近 似数）表，根据样品的稀释倍数可计算出其中的活菌含量。例如：某一细菌在稀释计数法中的生长情况如下:稀释度10-310-410-510-610-710-8重复数555555出现生长的管数555410根据上

14、述结果，其数量指标为“541”，查统计表（表7-2）得近似值为17。然后乘以第一位数的稀释倍数（10 -5）。那么原液中的活菌数=17X 100000=1.7X 10 -6。根据重复次数不同，可将统计表分为3次、4次和5 次重复测数统计表（又称5管最大或然数表）。表3-2 5次重复测数统计表数量指标近似值数量指标近似值10。10 -10 -210。10 -110 -20100.185002.31000.205013.11100.405103.30000.455114.60010.685204.90100.685217.00200.935229.53000.785307.93011.153111

15、.03101.153214.03201.454013.04001.354117.04011.754222.04101.754328.04112.155024.04202.255135.04212.655254.04302.755392.04554160.0在实践中，通常以5管重复为一个组，故这里仅列出5次重复测数统计表。只要知道了数量指标，就可查知近似值。方法应用直接法涂片染色法血球计数板法比浊法可同时计数不同类型的微生物数量，常用于牛奶、土壤中的细菌计数可用于不同类型微生物的计数微生物学分析，肉汤培养物或水悬浮液中的细菌数估计间接法平皿菌落计数法液体稀释法薄膜过滤计数法食品、水、土壤、医学、

16、卫生以及培养物中的细菌计数 因某种原因而不能用琼脂平皿活菌计数时被采用，如牛奶等 适用于量大而且含菌数很低的材料，如空气、水等测定细胞物质量定氮法测DNA法测定细胞干重法生理指标测定法主要用于代谢研究，适于细胞浓度高的样品同上用于调查研究，适用于细胞浓度高的材料微生物学分析研究从上表中可以看出，每种方法都各有优点和局限性。只有在考虑了这些因素同需要着手解决的问题之间的关系以后，才能对具体的方法进行选择。正如前面 说过的，平皿菌落计数法是微生物学中应用最多的常规方法，掌握这一方法的原 理和实际操作，很有必要。此法在理论上能反映活菌数。另外当用两种不同的方 法测量细菌的生长量时，其结果不一致是完全

17、可能的。测定微生物的生长量，在理论和实践上都十分重要。当我们要对细菌在不同 培养基中或不同条件下的生长情况进行评价或解释时，就必须用数量来表示它的 生长。例如可以通过细菌生长的快慢来判断某一条件是否适合。生长快的细胞， 最终的总收获量可能没有另一些条件下的收获量大。在另一些条件下，生长速率 虽然较低，但它却可在一段时间内不断增加。因此，只有具备了有关生长的定量 知识，才能在实际应用中作出正确的选择，以利于科研和生产活动的进一步开展。随着科学技术的发展，出现了一些快速测定的方法，其形式有小型纸片（1-10cm2）,圆形或长方形等。原理是在滤纸上有适宜的培养基和活菌指示剂2, 3， 5-氯化三苯基

18、四氮唑（triphenyl tetrazolium chloride, TTC,无色）。用 刻度吸管取一定的样品液于滤纸上或浸取样品液，置于密封包装袋中，经短期培 养，在滤纸上就会出现一定密度的玫瑰红色微小菌落。计数小红点可计算出样品 的含菌量。此外还有DNA指纹技术和PCR扩增等快速测定方法。材料二、浊度法测定菌体量（一）实验仪器、材料和用具实验材料:大肠杆菌及平板；培养基:牛肉膏蛋白胨葡萄糖培养基实验仪器:取液器（5000ul, 1000ul各一支）；培养箱，摇床，722s分光光度 计；实验用具:无菌1000ul吸头80个;无菌5000ul吸头2个；比色皿9个+共用 参比杯一个.（二）步骤

19、准备菌种：将细菌接种到牛肉膏蛋白胨葡萄糖三角瓶培养基中，37C振荡培 养18h，另外准备单菌落平板1块分为三个小组：取1.0ml大肠杆菌菌液接种到100ml培养基，37 C 200rpm取3.0ml大肠杆菌菌液接种到100ml培养基，37 C 200rpm取5.0ml大肠杆菌菌液接种到100ml培养基，37 C 200rpm每培养一小时取样一次（2.5h,3.5h加测1次）.对照组测量起始pH,所有瓶 子测量发酵9h结束测pH.测量：选用600nm波长，以蒸馏水作为参比，开始培养前测定每组培养液的OD值作为起始点。开始培养后，每小时吸取测定一次OD值。作图：以时间-菌体。值做出生长曲线图完成以

20、下信息!1.为什么要测定生物生长量?2、为什么可用比浊法来表示细菌的相对生长状况?单元设计学习领域课程名称食品应用微生物基础总学时72学习情境名称浊度法使用学时2学习目标：知识目标浊度法的基本概念微生物生长量的测定方法及原理能力目标专业能力通过本情境的学习训练，使学生掌握利用细菌悬液混浊度间接测定细菌 生长的方法学习液体培养基的配制以及接种方法反复练习无菌操作技术能够熟练操作722分光光度计、摇床方法能力查阅资料及阅读操作标准的能力自主学习新技术、新知识的能力动手实践能力分析问题、解决问题的能力数据记录、处理分析能力社会能力团队工作能力。与人沟通能力。工作安全和保护能力3.素质目标培养规范意识

21、树立严谨、科学的态度加强安全意识教学内容及组织过程教学方法1.浊度法的概念2.微生物生长量的测定方法3.722分光光度计的使用引导教学法，多媒体教学法任务组织（10分钟）分配任务（发放生产指令），发放引导文； 组织几个学习小组；每组各选出一名组长讲述法、引导教学法任务策划（20分钟）通过教师示范和分组讨论，制定浊度法测定 菌体生长量的方案，在方案中要标明各项操 作时步骤以及操作过程的注意事项。讨论法、可视化报告 法、互动交流教学法产品试制（50分钟）每个学习小组依次完成大肠杆菌菌液接种 到到 100ml培养基每个学习小组分别每培养小时取样次 （2.5h,3.5h加测1次），测量发酵9h结束 选

22、用600nm波长，以蒸馏水作为参比，开始 培养前测定每组培养液的OD值作为起始 点。开始培养后，每小时吸取测定一次OD 值。做出生长曲线图建立经验交流制度：每完成一次学习任务， 同学及小组间可进行经验交流，教师可针对 共性问题在课堂上组织讨论。实践教学法，引导教学法，示范教学法任务评价（10分钟）各组组长综合评价小组成员在任务完成中 的表现，同时总结任务完成过程中所欠缺和 需要改善的方面；各组成员对任务的组织、策划、实施过程进交互评价法、旋转交 换讨论法、教师归纳 法行自评与互评教师就各组在不同操作过程中的表现情况 进行评价教师根据学生反馈提出问题，学生通过讨论 方式尝试给出解决方法，教师总结归纳解决 方法。教学环境 与资源：生物发 酵实训室校级精 品课网站 资源教师知识与能力要求：具有微生物及相关专业的专业背景；具备熟练的无菌操作接种技术；具备熟练的分光光度计的使用能力；具有观察力及课堂的把控能力；具有与学生合作，沟通的能力。学生知识与能力准 备：掌握微生物基本 和分析仪器操作 技术；具备查阅资料等 基本技能；具备阅读和学习 仪器使用说明书；具备一定的自学 能力和分析问题 能力。成果形式：OD值测定曲线。考核评价：评价方式：过程性考核评价作业考核评价内容：过程评价考核指标 基础知识问题备注：由于在进行此教学情 境之前，