第6章食品的卫生细菌学检验

1、第6章食品的卫生细菌学检验第一节食品中菌落总数的测定一、菌落总数 是指食品检样经过处理，在一定条件下培养后,所得1mL(g)或1cm2面积检样中所含菌落的总数。 二、菌落总数测定的意义1、判定食品被细菌污染的程度及卫生质量。2、预测食品存用的期限长短。3、了解细菌在食品中的繁殖动态。三、菌落总数测定的方法 平板倾注法平板表面涂布法平板表面点滴法四、平板倾注法测定菌落总数检验步骤(程序)： 检样稀释处理做平板培养菌落计数报告结果（一）、样品稀释及做平板1ml1ml1ml1ml1:101:10001:1001:100001ml1ml1ml加入46营养琼脂1215ml25g/ml样品生理盐水 检样从

2、开始稀释到倾注最后一个平皿所用时间不宜超过20min，以防止细菌有所死亡或繁殖。 （二）培养普通食品:37 48h 倒放平板清凉饮料、调味品、糕点、酒类： 37 24h 水产品: 30 48h（三）计数和报告 到达规定培养时间，应立即计数。如果不能立即计数，应将平板放置于04，但不得超过24h。1、菌落的选择（1）、单个菌做一个菌落计（2）、呈链状生长的菌落之间无任何明显界限，作为一个菌落计，如存在有几条不同来源的链，则每条链均应按一个菌落计算。（3）、如片状菌落不到平板一半，而另一半又分布均匀，则可以半个平板的菌落数乘2代表全平板的菌落数。2、平板菌落计数的选择 （1）、选取菌落数在3030

3、0之间的平板（SN标准要求为25250个菌落），若有二个稀释度均在30300之间时，比值小于或等于2取平均数，比值大于2则其较小数字。（2）、如均大于300，则取最高稀释度的平均菌落数乘以稀释倍数报告（3）、如均小于30，则以最低稀释度的平均菌落数乘稀释倍数报告（4）、如菌落数有的大于300，有的又小于30，不在30300之间，以最接近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数报告（5）、如所有稀释度均无菌落生长，则应按小于1乘以最低稀释倍数报告。 3、菌落数的报告菌落数在1100时，按实有数字报告，如大于100时，则报告前面两位有效数字，第三位数按四舍五入计算。固体检样以克（g)为单位报告，液体检

4、样以毫升（ml）为单位报告，表面涂擦则以平方厘米（cm2）报告。 (四)、检验注意事项1、对照平板出现几个菌落时，要追加对照平板；2、吸管进出瓶子或试管时，吸管口不得触及瓶口、管口的外围部分；3、吸管插入试样液内的深度不得小于2.5cm,调整时要使管尖与容器内壁紧贴;4、进行稀释时,吸管口不得与稀释液接触;5、检样从开始稀释到倾注最后一个平皿所用时间不宜超过20min.6、稀释倍数愈高菌落数愈少，稀释倍数愈低菌落数愈多。如出现逆反现象，不可作为检样计数报告的依据。复习题1、什么是菌落总数？2、测定食品、饮料等产品的菌落总数有什么意义？3、画出平板倾注法测定菌落总数的示意图。4、在测定菌落总数时

5、，如何选择菌落进行计数？5、在菌落总数的检验中，要注意哪些事项？6、在菌落总数的检验中，如何根据样品的特性选择培养温度和时间？第二节 食品中大肠菌群的检验一、大肠菌群 1、 什么是大肠菌群？指一群需氧及兼性厌氧，在37能分解乳糖产酸、产气的革兰氏染色阴性无芽胞杆菌。2、大肠菌群的组成:大肠埃希氏菌发属、柠檬酸杆菌属、产气克雷伯氏菌属和阴沟肠杆菌。属代表种致病性埃希氏菌属 （Escherichia） 大肠埃希氏菌 (E.coli) 肠道外感染， 急性腹泻 志贺氏菌属 （Shigella） 痢疾志贺氏菌 (Sh.dysenteriae) 细菌性痢疾爱德华氏菌属 （Edwardsiella） 迟纯爱

6、德华氏菌 (E.tarda) 蛇类等血动物的正常肠道寄居菌，偶见于健康人或腹泻者粪便内沙门氏菌属 （Salmonella） 伤寒沙门氏菌 (S.typhi) 肠热症、急性肠炎、败血症枸橼酸杆菌属 (Citrobacter) 弗劳地氏枸橼酸杆菌 (C.freundii) 条件致病菌，引起继发性感染克雷伯氏菌属 (Klebsiella) 肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae) 肺炎，泌尿系、创伤感染 败血症等 阴沟肠杆菌(Enterobacter) 产气杆菌 (E.aerogenes) 很少引起原发性感染哈夫尼亚菌属 (Hafnia) 蜂窝啥夫尼亚菌 (H.alvei) 对人无致病性沙雷氏菌属

7、 (Serrati) 粘质沙雷氏菌 (S.marcescens) 条件致病菌，引起泌尿系， 呼吸道及创伤感染 变形杆菌属 (Proteus) 普通变形杆菌 (P.vulgaris) 食物中毒，泌尿系、呼吸道感染 等耶尔森氏菌属 (Yersinia) 鼠疫耶尔森氏菌 (Y.pestis) 鼠疫欧文氏菌属 (Erwinia) 草原居民欧文氏菌 (E.herbicola) 植物寄生菌，曾从人体肠道及化脓扁桃体中分离到1、粪便污染的指标菌：大肠菌群或大肠杆菌二、大肠菌群的测定意义2、以大肠菌群作为粪便指标菌原因在粪便中数量最大；在外环境中存活的时间与致病菌大体相同；检测方法简便容易。3、大肠菌群的测定

8、意义（1）、判断食品中否受到粪便污染。（2）、有利于控制肠道传染病的发生和流行。（3）、有利于控制食品在生产加工、运输、保存等过程中的卫生状况。三、大肠菌群的生物学特性1.形态与染色：革兰氏染色阴性，无芽胞杆菌。2.发酵乳糖产酸产气 3.培养特性：在琼脂上的典型菌落:呈深紫黑色或中心深紫色，圆形，稍凸起，边缘整齐，表面光滑，常有金属光泽；在麦康凯琼脂上的典型菌落:呈桃红色或中心桃红、圆形，扁平，光滑湿润。EMB平板照片及原理麦康凯琼脂平板Age of culture is 24 h大肠杆菌、大肠菌群选择性显色培养基-COLI ID用于在37下对食品中大肠菌群和大肠杆菌进行检测、计数及大肠杆菌的

9、鉴定本培养基含有两种显色物质，可以直接识别大肠菌群（coliforms）和鉴定大肠杆菌（Escherichia coli）,而不需附加任何试剂。菌落颜色 玫瑰红 蓝色 透明.-葡萄糖苷酶 + - - .-半乳糖苷酶 + + - .大肠杆菌 其它大肠菌群 其它革兰氏阴性菌 .-半乳糖苷酶（+）大肠菌群存在 -半乳糖苷酶（+）大肠菌群存在-葡萄糖苷酶（+）大肠杆菌存在 -葡萄糖苷酶（-）无大肠菌群存在大肠杆菌平板菌落照片肠杆菌扫描电镜照片.四、大肠菌群检验方法及操作方法国家标准：三步法：乳糖胆盐发酵试验分离培养证实试验(乳糖发酵试验) 行业标准：两步法：推测试验证实试验检样稀释处理EMB等革兰氏染

10、色乳糖发酵管革兰氏阴性无芽胞产气革兰氏阳性大肠杆菌阴性大肠杆菌阴性报告不产气乳糖胆盐发酵管产气不产气大肠杆菌阴性报告报告报告大肠杆菌阳性1:1001:10各加入1ml各加入10ml各加入1ml单料乳糖胆盐发酵管单料乳糖胆盐发酵管双料乳糖胆盐发酵管初发酵检样稀释检样量1g/ml检样量0.1g/ml检样量0.01g/mlEMB分离培养证实试验乳糖发酵管镜检查MPN表报告结果表1 粪大肠菌群在几种常用分离培养上的菌落特征培养基菌落特征伊红兰培养基(EMB)紫黑色、有金属光泽，紫黑色、不带或略带光泽，淡紫红色、中心紫黑色、黑红或深紫红色品红亚硫酸纳(远藤氏平板)紫红色、有金属光泽，深红色、不带或略带金

11、属光泽，淡红色、中心较深中国兰平板深蓝色，浅蓝色、中心深蓝色麦康凯平板(Mac C)桃红色，粉红色、中心桃红色MPN法简介The Most Probable Number Method1g/ml检样中最近似值(MPN)表以1、0.1、0.01、各用3管。阳性管数MPN个/100 g/ml1g/ml30.1g/ml30.01g/ml300030001300026000390010300116001290013120020600219002212002315003090031130032160033190五、粪大肠菌群的检验粪大肠菌群：系一群需氧及兼性厌氧，在44.5培养24h内能发酵乳糖产酸产气

12、和分解色氨酸产生靛基质的革兰氏阴性无芽胞杆菌。检验方法检样产酸产气查MPN表报告EMB 分离靛质基试验阳性反应方法一：45 EC肉汤发酵稀释44乳糖胆盐发酵方法二：检样稀释36乳糖胆盐发酵产酸产气产酸产气EMB 分离查MPN表报告1、从制备样品匀液至稀释完毕,全过程不得超过15min。2、对产酸但未看到气泡的乳糖发酵，用手轻打动试管，如有气泡沿管壁上浮，应考虑可能有气体产生，应作进一步试验。 3、挑选菌落进行证实试验时，最少要挑2个以上的典型菌落或非典型菌落进行接种。4、不可用其他胆盐代替指定的胆盐。六、检验注意事项EMB平板照片及原理靛基质试验原理及照片七、大肠菌群快速检验食品大肠菌群快速检

13、验方法：TTC显色法；DC试管法；纸片法。（一）食品饮料大肠菌群快速检验纸片使用方法：1.样品稀释同国标法2.接种： 饮料和饮用水采用原液、1:10、 1:100三个稀释度，固体食品采用1:1 、1:10和1:100三个稀释度。用1亳升灭菌吸管吸取1亳升同一稀释度的稀释液均匀涂布到袋中的纸片上，做三个重复。3.培养：将接种好的纸片轻轻压平（可叠放），在36下培养1524h观察结果。4.结果判定:纸片上出现紫红色斑点,其周围有黄圈者,为阳性.纸片为一种着色,无菌落生长者为阴性.纸片呈紫兰色,有紫红色斑点，其周围地黄圈者阴性.酸性食品接种后,纸片变黄,经培养后无紫红色斑点为阴性（二）餐具大肠菌群快

14、速检验(纸片法)使 用 方 法 ：1. 采样610份。碗、盘、杯等每份贴纸片两张，用无菌生理盐水湿润纸片后，立即贴于食具内侧表面，30秒后取下，置于原塑料袋内。筷子以5只为一份样品，用吸管吸取生理盐水湿润纸片后，立即将筷子进口端（约5cm）抹拭两张，放入原塑料袋内。2.将已采样的纸样置于37C培养15小时.纸片在黄色背景上出现红色斑点为阳性，纸片在紫兰色背景上呈现红色斑点，但周围没有黄晕均为大肠菌群阴性。同一份样品两张纸片均是阴性为合格。食品冷饮大肠菌群检验纸片冷饮、乳制品和调味品等大肠菌群的测定食品饮料大肠菌群快速检验纸片饮料、食用纯水和糕点的大肠菌群测定餐具大肠菌快速检验纸片餐具卫生消毒效

15、果检测大肠菌群测试片适用于需要对大肠菌群准确计数的样品，如消毒牛乳、冷饮和调味品等。 八、水的大肠菌群检验大肠菌群MPN/100mL细菌总数 CFU/mL 生活饮用水 3 /L100 瓶装饮用纯净水 3 20 饮用天然矿泉水罐装产品 050地面水质量标准 10000个/L 准备加氯消毒后供饮用的水 1000准备加氯消毒后供饮用的水 10000游泳池水 1001000（一）、水样的采集 1、自来水（未含氯）：龙头火烧灭菌，畅流510后取样。2、地面水源水：江湖河，水库，水池等。浸入水下20cm下取样。水井50cm下取样。3、漂白粉处理的水样：自来水，游泳池水，应在瓶内加入0.03g硫代硫酸钠/5

16、00ml，或2ml 1.5%硫代硫酸钠液/500ml，除氯。4、运送：2小时内送到检验室。610，6h,立即检验.5、检验前：将水样振摇510分钟。（二）、生活饮用水或食品生产用水的检验（大肠菌群 ） 各加10ml各加100ml水样初发酵三料乳糖胆盐50毫升装三料乳糖胆盐5毫升装EMB分离36培养 24h复发酵乳糖发酵镜检36培养 24h大肠菌群检索表（饮用水） 100ml阳性管数10ml阳性管数012每L水中大肠菌群数03411138182713273111838414245251830706223692727431208315116193660230104069230（三）、瓶装矿泉水的检验（大肠菌群 ） 原水样双料乳糖胆盐发酵管10毫升装37培养 24h产酸产气者亮绿乳糖胆盐发酵管37培养 48h产酸产气者查表报告各加入