实验93RedET同源重组ppt课件

1、Red/ET同源重组技术2021年3月25日 内 容一、 什么是Red/ET同源重组二、 技术的特点三、 作用机制四、 功能元件五、操作流程及关键要素六、在基因工程中的主要运用七、 新技术的开展八、在其他细菌中的运用 遗 传 重 组基因组的可变性和稳定性之间必需维持一个恰到益处的平衡，这样才干使生物体得以生存并能世代相传，繁衍不息。染色体的遗传差别主要由两种 机制产生，一种是突变，一种是遗传重组。 重组可分为四类DNA序列、蛋白质因子 狭义遗传重组：涉及到DNA分子内断裂-复合的基因交流 遗传重组与重组DNA技术 异常广义遗传重组：任何呵斥基因型变化的基因交流过程一、 什么是Red/ET同源重

2、组1. 概念 Red/ET重组是新近出现的一种利用来自E. coli中 噬菌体的重组酶Red/Red 或者是来自 Rac 噬菌体的重组酶RecE/RecT 进展基因同源重组的DNA工程技术。2. 原理 首先重组酶沿53方向消化双链DNA，显露粘性末端15-50bp。随后重组酶介导单链退火修复single- strand annealing，即载体和插入片段的黏性末端15-50bp 互补构成稳定的带缺刻的环状重组质粒，转化大肠杆菌后能自动被修复为闭合的环状质粒3. 特点： Red同源重组技术具有同源序列短(1550bp)、重组效率高、操作简单、快速的特点。4. 运用 这种技术可在DNA靶标分子的

3、恣意位点进展基因敲除、敲入、点突变等操作,无需运用限制性内切酶和衔接酶。此外,这种新型重组技术可直接将目的基因克隆到载体上,目的基因既可来源于细菌人工染色体也可是基因组DNA。Red同源重组技术使难度较大的基因工程实验顺利进展,大大推进功能基因组研讨的开展。g b al phageETRac phage Rac recE/recT 支配子 = red 支配子, 支配子中的重组酶Red/Red 或者RecE/RecT协同配合完成重组作用； recE = red ：53 dsDNA核酸外切酶； recT = red ：ssDNA结合和退火蛋白； red： 防止 E. coli中的核酸酶 RecBC

4、D对外源线性DNA片段的消化。噬菌体的pL支配子表示图 Reda(RecE)Red同源重组原理表示图Single-strand annealingStrand invasion35Digestion Binding35Redb(RecT)Repair/ReplicationSelectionRecE/RecT和Red/Red两重组系统的差别 “线状DNA线状DNA重组，选用RecE/RecT重组酶系统； “线状DNA环状DNA重组，选用Red/Red重组酶系统； 根据需求选择含不同抗生素抗性基因Ampr、Hygr、Tetr和不同的诱导型启动子pBAD、pTet的重组酶系统表达质粒。 质粒: p

5、SC101-BAD-gbaA(amp) pSC101-BAD-gbaA(tet) pSC101-BAD-gbaA(hyg) pSC101-Tet-gbaA(tet) pSC101-BAD-ETgA(tet) pSC101-Tet-ETgA (amp)RecE/RecT和Red/Red两重组系统对不同类型底物重组效率的差别 Red同源重组技术相关文献Nature Genetics (1998)Nature Biotechnology (2000)1. 不依赖RecA蛋白，在重组酶系统Red/Red或RecE/RecT的相互配合下，含短同源臂1550bp的供体DNA分子能直接重组到受体DNA分子上

6、，实现交换、插入、删除、突变等；2. 不受靶标DNA分子大小的限制；3. 不受内切酶切位点的限制；4. 准确性：不依赖RecA蛋白，减少了引入非预期的突变、 缺失、交换等的几率； 5. 简便快捷：省去了中间质粒的构建，减少实验步骤、缩短实验周期。二、Red/ET同源重组技术的特点三、 Red/ET重组的作用机制Red/ET重组链入侵模型1.链入侵方式Red/ET同源重组链退火模型2.链退火模型四、 Red/ET重组中的功能元件1. Red、Red和RedRed：以三聚体的方式构成“漏斗型活性的蛋白， 5-3外切酶活性。Red构造A和与DNA相互作用的方式B图片来自Subramanian et

7、al. 2003 Red：与ssDNA结合构成丝状体，催化与互补ssDNA之间的退火。 Red：抑制RecBCD外切酶和SbcCD外切酶对外源DNA的降解。 2. RecE和RecTRecE：C端39kDa的部分才是5-3外切酶活性必需，对5端为羟基的底物也有活性。 RecT：与ssDNA结合构成丝状体，催化与互补ssDNA之间的退火。3. RecA 个亚基构成有活性的RecA蛋白，细菌中广泛存在且高度保守，有同源重组酶、DNA损伤修复、DNA依赖ATPase活性等功能。 可诱导SOS反响、挽救DNA复制叉等，提高电击后细胞的活力，添加电转化效率。五、 Red/ET重组操作流程引物设计合成线性

8、供体dsDNA底物的制备线性载体的制备重组反响重组产物转化至感受态细胞重组子挑选重组子检测1. 设计合成引物 设计引物时要遵照普通引物设计的根本原那么，但是上下游引物要加上15-20bp的载体同源序列。载体同源序列如何添加主要分以下两种情况：1载体酶切后是5端突出或平末端，那么引物上的同源序列包括5端突出序列的同源序列。2载体酶切后是3端突出，那么引物上的同源序列不包括3端突出序列的同源序列。引物设计方法同源臂长度对Red/ET重组效率的影响数据来自Zhang et al. 1998 同源臂的长度在1550bp时，重组效率就能满足实验要求，重组效率随着同源臂长度的添加而添加。2. 线性供体ds

9、DNA底物的制备 选用保真度高的DNA聚合酶如Phusion、Pyrobest等，减少PCR反响中的突变；扩增GC含量较高的DNA片段时，选用Triplemaster、HotStarTaq 等，用合成的引物PCR扩增获得dsDNA底物； 纯化PCR产物： 1减少模板背景对挑选任务带来的难度； 2降低其剩余引物与靶标DNA片段的结合，提高重组效率； 3去处PCR产物中的盐离子，提高转化效率。 降低模板对挑选任务带来的难度； 1纯化回收PCR产物； 2内切酶消化处置模板； 3运用R6K复制子。 线性化载体可以经过酶切或PCR扩增两种方法获得。1酶切 选取适宜的位点，单酶切或双酶切皆可,质粒的线性化

10、不彻底，将导致阴性克隆的产生，为了提高阳性率，建议经过双酶切进展质粒线性化。2PCR扩增 选取适宜的位点，设计正向和反向引物，引物长度普通在18-20bp左右，建议用高保真的聚合酶扩增。为了防止模板质粒DNA对后续实验的影响，建议用Dpn I内切酶消化PCR产物，降低背景，提高阳性率。 不论采取哪种方法，最终线性化载体的浓度需50ng/ul，高浓度的载体有利于提高效率。 3. 线性载体的制备4. 同源重组反响试剂加量10 x Buffer1ulRecombination Enzyme1ul线性化载体（50ng/ul） 50-100ng插入片段（50ng/ul）150-200ngdd H2O补足

11、至10ul1配置反响体系 将目的DNA片段和线性化载体以一定的摩尔比加到管子中进展重组反响摩尔比可计算方法见附录，10 ul体系(见下表) 留意：1.目的片段与载体的摩尔比在2:1-5:1之间，摩尔比低于2:1效率会降低；2.反响时间在15-30分钟，时间太短不利于重组反响2短暂离心混匀，37孵育15分钟。3反响终了后，取5-10ul反响液立刻进展转化，剩余反响液可在4或-20保管待用。 5.重组产物转化至感受态细胞冰上融化一管100 l的DH5感受态细胞。参与5-10l反响液到感受态细胞中，悄然混匀，冰上孵育30分钟。42水浴中热激45-90秒后，冰浴3分钟。留意：所运用的感受态细胞效率11

12、08cfu/g.参与890l SOC液体培育基，37复苏45-60分钟。6. 重组子挑选 复苏培育物8000rpm离心1分钟搜集菌体，根据需求将一定量的菌体均匀的涂布在含抗生素平板上,37倒置培育12-16h后察看菌落生长情况。 运用抗生素的最低抑菌浓度，有利于获得更多的重组子：在10g/mL的卡那霉素平板上重组子的数目是60g/mL的卡那霉素平板上重组子的数目的6倍。 抗生素运用浓度与Red/ET重组效率的关系 常用抗生素的任务浓度7. 重组子的检测 检测方法：酶切分析、PCR检测、平板双划线、测序等； 普通采用菌落PCR进展阳性克隆鉴定。为防止假阳性结果，鉴定引物选择一条为载体特异性引物，

13、另一条引物为目的片段特异性引物。 高拷贝质粒修饰存在“质粒多聚体 景象； “质粒多聚体问题处理方法： 采用“线性DNA+线性DNA重组方式； 利用RecE/RecT重组酶系统； 减低质粒拷贝数。卡那霉素抗性基因Kan交换pUC19中的氨苄抗性基因Amp“质粒多聚体 景象处理方法： 采用“线性DNA+线性DNA重组方式； 利用RecE/RecT重组酶系统； 减低质粒拷贝数。六、 Red/ET重组技术的主要运用1. 重组质粒的构建 2. 染色体的修饰 3. 亚克隆Subcloning 4. 直接克隆Direct cloning1. 重组质粒的构建 (1) 传统基因克隆技术的缺陷 传统克隆技术依赖限

14、制性酶切位点和内切 酶的消化，当短少适宜的酶切位点或者某个酶切位点在目的片段中大量存在时，利用内切酶消化难以得到相应的产物。 方法看似简单，但实验周期长。 大片段难以与载体正确衔接。 无法同时衔接多个2个以上的DNA片段。限制性内切酶衔接酶步骤1：酶切目的片段步骤2：酶切载体步骤3:目的片段与载体衔接同源重组克隆步骤传统克隆步骤步骤4:重组子转化到感受态细胞同源重组克隆传统克隆克隆片段长度50bp-10kb50bp-2kb一次克隆片段数1-5个1个感受态效率要求1108cfu/ug以上1107cfu/ug以上所用的酶重组酶T4连接酶片段的插入位点任何位点特定位点片段酶切不需要需要载体线性化方法

15、酶切或PCR酶切同源重组克隆与传统克隆比较插入选择标志插入无选择标志的DNA片段2. 染色体的修饰 E. coli染色体上插入抗性基因 传统基因工程技术A和Red/ET重组技术B修饰E.coli染色体实验步骤比较B 不同复制子能承载外源 DNA片段的大小3. 亚克隆Subcloning 4. 直接克隆Direct cloningA亚克隆和直接克隆表示图Red/ET subcloning亚克隆 pGB-15A载体抗性基因簇直接克隆 Myxococcus xanthus中的沉默基因簇3 mg基因组DNA用EcoR V消化Mx unknown PKS gene cluster (36kb)p15A oriCmPKS from other bacteria：Photorhabdus lumineciensPsedumonas flurescencse异源表达七、