肿瘤转移抑制基因Kiss-1和基质金属蛋白酶-9在皮肤恶性黑色

1、肿瘤转移抑制基因Kiss-1和基质金属蛋白酶-9在皮肤恶性黑色素瘤中的表达王琰1,2 ，陈旻静1 ，张娟1,2 ，王大伟1,2(1郑州大学第一附属医院整形外科 河南郑州450052 2河南省高等学校临床医学重点学科开放实验室 河南郑州450052)Expression of Tumor Metastasis-suppressor Gene Kiss-1 and Matrix Metalloproteinase-9 in Cutaneous Malignant MelanomaWANG Yan1,2 ,CHEN Min-jing1 ,ZHANG Juan1,2 ,WANG Da-wei1,2(1

2、 Department of Plastic Surgery, the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou, 450052, Henan Province, China 2 Open Laboratory of Key Discipline of Clinical Medical Sciences, Institutions of Henan Province High Learning, Zhengzhou,450052, Henan Province, China)Abstract BACKGROUND:

3、 Kiss-1 is a recent discovery of a tumor metastasis suppressor, MMP-9 is associated with tumor invasion and metastasis, both with invasion and metastasis in the process of cutaneous malignant melanoma remain poorly understood. OBJECTIVE: To investigate the expressions of Kiss-1 and MMP-9 protein in

4、cutaneous malignant melanoma (CMM), junctional nevus and normal skin. METHODS: The expressions of Kiss-1 and MMP-9 protein were detected in 42 cases of CMM, 20 cases of junctional nevus and 20 cases of normal skin specimens by SP immunohistochemical technique. RESULTS: The positive expression rate o

5、f Kiss-1 protein in CMM was significantly lower than the junction nevus and normal skin tissue(P0.05), MMP-9 protein was higher than the junction nevus and normal skin(P0.05). Kiss-1 and MMP-9 expression in the CMM is related to the depth of tumor invasion and lymph node metastasis. There was a nega

6、tive correlation between Kiss-1 and MMP-9 expression in CMM tissue (rs=-0.342 P=0.026). CONCLUSION: Kiss-1 and MMP-9 in the development of CMM plays an important role, and is associated with CMM invasion and metastasis.Kiss-1 and MMP-9 have negative effects. Joint detection of expression for both tr

7、eatment and prognosis of CMM provides an important reference.Key words: cutaneousmalignantmelanoma; Kiss-1; lymph nodes metastasis摘要 背景：Kiss-1是近年新发现的一个肿瘤转移抑制因子，MMP-9与肿瘤的浸润转移密切相关，两者与皮肤恶性黑色素瘤浸润转移过程中的作用少有报道。目的：研究Kiss-1和MMP-9在皮肤恶性黑色素瘤（CMM）、交界痣及正常皮肤中表达情况，及其与CMM的肿瘤浸润程度，淋巴结转移的关系。方法：应用免疫组化SP方法对42例皮肤恶性黑色素瘤及2

8、0例皮肤交界痣，20例正常皮肤中Kiss-1及MMP-9蛋白进行检测，探讨其与CMM发生发展及浸润转移的关系。结果：CMM中Kiss-1的表达明显低于交界痣及正常皮肤组织（P005)，MMP-9的表达高于交界痣及正常皮肤（P005)，Kiss-1及MMP-9在CMM中的表达与肿瘤的浸润深度、有无淋巴结转移有关。Kiss-1与MMP-9在CMM中的表达呈负相关(rs=-0.342，P=0.026)。结论：Kiss-1及MMP-9在CMM的发生发展中起重要作用，与CMM的浸润转移密切相关，Kiss-1与MMP-9有负相关作用，联合检测两者的表达情况可为CMM的治疗及预后提供重要的参考依据。关键词：

9、皮肤恶性黑色素瘤 ；kiss-1基因；淋巴结转移 皮肤恶性黑色素瘤(cutaneous malignant melanoma,CMM)是一种高度恶性的皮肤肿瘤，其发展迅速，容易沿血液淋巴等途径发生广泛浸润转移，预后差，死亡率高。肿瘤转移抑制基因由于仅抑制肿瘤转移而不影响原发肿瘤的生长而得名，Kiss-1基因是其中之一1，研究发现Kiss-1基因的高表达与食管癌、胃癌及乳腺癌等恶性肿瘤的侵袭转移呈负相关2-4，Kiss-1基因作为新近发现的一个肿瘤转移抑制基因，越来越受到学者们的重视。基质金属蛋白酶-9(Matrix Metalloproteinase-9,MMP-9)是基质金属蛋白酶家族(MM

10、Ps)中最重要的一员，可特异性地降解细胞外基质和基底膜中纤维网架分子中的型胶原，研究表明MMP-9在多种恶性肿瘤中呈现过表达，因此被认为在恶性肿瘤的浸润转移中扮演着重要角色5,6。Kiss-1和MMP-9在CMM中的研究至今少有报道，本实验采用免疫组化方法对CMM组织中Kiss-1及MMP-9进行检测，探讨其与CMM发生发展及浸润转移的关系。1 材料与方法1.1 设计：病例对照，形态学实验。1.2 时间及地点：2010-09/2011-06在河南省高等学校临床医学重点学科开放实验室完成。1.3 标本来源：选取2007-2011年间郑州大学第一附属医院病理科确诊为皮肤恶性黑色素瘤存档蜡块42例，

11、其中男性19例，女性23例，年龄在3579岁之间。按有无淋巴结转移分为: 有淋巴结转移者18例，无淋巴结转移者24例。按浸润深度分为：级（表皮及附属器上皮）10例，-(真皮乳头层)14例，（真皮网状层）10例，级（皮下组织）8例。交界痣20例。收集我院整形外科行全厚皮片移植的非癌患者手术时修剪所剩正常皮肤20例作为正常对照组。所有研究对象均有完备的病史资料，且无其他皮肤病等合并疾病，术前均未行任何治疗。1.4 实验方法及试剂 标本用体积分数为10%甲醛溶液固定，常规石蜡包埋，4m连续切片。实验严格按照SP染色试剂盒说明书进行操作。兔抗人Kiss-1多克隆抗体浓缩型、兔抗人MMP-9多克隆抗体浓

12、缩型、SP免疫组化试剂盒通用型，工作液均购自北京中杉生物制品有限责任公司。Kiss-1、MMP-9工作液浓度为1：100，用PBS液代替一抗作阴性对照，用已知的阳性切片作阳性对照。1.5 结果判定 根据文献7,8的标准进行染色评分， 每张切片在400倍光学显微镜下随机选取5-10个视野，每个视野计数100-200个细胞。Kiss-1或MMP-9蛋白阳性细胞率（%）的计算方法为阳性细胞数/观察细胞数*100%。(1)Kiss-1蛋白的阳性表达结果判定采用综合计分的方法:染色强度：与背景颜色相对比，无色或浅棕色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为 3分；染色范围：阳性细胞率67%为3分。两计分相乘得每个

13、标本的分值（1-9 分），总分=3分为表达缺失或低下，4-9分为阳性表达。(2)MMP-9蛋白的阳性表达结果也采用综合计分的方法：染色强度：与背景颜色相对比，无着色0分，浅黄色为 1 分，棕黄色为2 分，深棕黄色为3分；染色范围：阳性细胞率75%为4分。两项评分之和判断结果，=3分为阳性，3分为阴性。1.6设计、实施、评估者：设计为第一、二作者，实施为第一、三、四作者，评估者为全部作者。1.7主要观察指标：正常皮肤、交界痣及CMM中Kiss-1和MMP-9的表达情况。Kiss-1和MMP-9在CMM中的表达与肿瘤细胞浸润深度及淋巴结转移的关系。CMM中Kiss-1和MMP-9的表达关系。1.8

14、统计学方法 实验数据应用SPSS17.0统计软件包分析处理，各组标本中蛋白阳性表达率的比较用行列表2检验，2分割检验，Kiss-1和MMP-9在CMM中的表达与肿瘤细胞浸润深度及淋巴结转移关系的比较用行列表2检验，CMM中Kiss-1和MMP-9表达关系应用Spearman等级相关分析，检验水准=0.05。2 结果2.1受试者数量分析 所有纳入对象82例全部进入结果分析。2.2 各组标本中Kiss-1和MMP-9的表达kiss-1蛋白和mmp-9蛋白在各组中的阳性表达见表1。Kiss-1、MMP-9均定位于胞浆，阳性细胞呈棕黄色颗粒状染色(图1，图2)，由表可知CMM中Kiss-1 的阳性表达

15、率低于交界痣和正常皮肤，差异有统计学意义（P0.05），而CMM中MMP-9的阳性表达率高于交界痣和正常皮肤，差异有统计学意义（P0.05）。表1 Kiss-1和MMP-9 在各组中表达的阳性例数（）分组nKiss-1蛋白阳性例数（%）MMP-9蛋白阳性例数（%）正常皮肤 2015(75%）6(30%)交界痣 2013（65%)8(40%)CMM 4212(29%)31(74%)X214.47412.866P0.0010.002 注：与交界痣及正常皮肤比较，P0.0172.3 Kiss-1和MMP-9在CMM中的表达与临床病理学特征的关系Kiss-1和MMP-9在CMM中的表达与临床病理学特征

16、的关系见表2。由表可知在CMM中，Kiss-1的阳性表达率随着肿瘤细胞浸润深度增加及淋巴结转移的产生而明显降低，差异有统计学意义（P0.05）。MMP-9的阳性表达率随着肿瘤细胞浸润深度增加及淋巴结转移的产生明显增加，差异有统计学意义（P0.05）。表2 Kiss-1和MMP-9在CMM中的表达与临床病理学特征的关系分组nKiss-1MMP-9阳性（n)阳性率（%）X2值P值阳性（n)阳性率（%）X2值P值浸润深度级（表皮及附属器上皮）-(真皮乳头层)（真皮网状层）（皮下组织）10141086420 6028.620010.0350.01841188 4078.68010010.2870.01

17、6淋巴结转移有无 182421011424.7060.0421714 94587.9780.0122.4 CMM中Kiss-1和MMP-9表达的关系CMM中Kiss-1和MMP-9的表达呈负相关关系(rs=-0.342，P0.05)，见表3。表3 CMM中Kiss-1和MMP-9表达的相关性Kiss-1MMP-9rsP66-0.3420.0262553讨论 浸润和转移是恶性肿瘤最具特征的生物学特性，也是临床诊断治疗工作中的难题。其发生发展涉及到癌细胞及细胞内微环境和基质之间的多个步骤和分子反应，主要包括：肿瘤细胞黏附特性改变，肿瘤细胞周围基质蛋白分子水解, 肿瘤细胞迁移等9。 Kiss-1是L

18、ee10等新近发现的一个肿瘤转移抑制基因, 定位于l号染色体长臂lq32-q41区1，人类正常心脏、脑、胎盘、肝脏、肺、骨胳肌、肾脏和胰腺等组织中均可检测到不同片段长度的Kiss-1mRNA。本实验结果表明在正常皮肤及交界痣中，可见Kiss-1大量表达，而CMM中少量表达，三者差异有统计学意义，且在CMM中，随着肿瘤细胞浸润深度增加，Kiss-1表达明显减少，且伴淋巴结转移者Kiss-1明显缺失，提示Kiss-1表达减低或缺失与CMM的发生发展密切相关。研究表明kiss-1与多种肿瘤的浸润转移有关系1,7，而其抑制肿瘤转移的机制目前还不十分清楚，但最近的研究表明其可能与以下方面有关：Kiss-

19、1可通过诱导细胞的过度黏附而有效的抑制肿瘤移行能力，进而抑制其转移11。还可能是通过Kiss多肽激活其受体GPR54、诱导细胞周期G2-M阻滞和细胞凋亡实现的12,13。另外Kiss-1还可通过抑制肿瘤细胞的集落形成能力和基质金属蛋白酶的活性等抑制肿瘤细胞的转移。MMP-9是MMPs中的重要成员，MMP-9在肿瘤的浸润转移过程中发挥着重要的作用，表现为MMP-9能够降解、破坏细胞外基质及基底膜中的型、V型胶原和弹力蛋白等成分，导致基底膜破坏， 肿瘤细胞浸润结缔组织基质，侵入小血管和淋巴管而发生转移14。文献表明在结肠癌、食管癌、胃癌等多种恶性肿瘤中都有MMP-9的显著增高8,14,15。本实验

20、结果表明CMM中MMP-9蛋白阳性表达率明显高于交界痣及正常皮肤组织,提示MMP-9蛋白过度表达可能与CMM组织的发生发展有关。此外还发现,随CMM中肿瘤细胞浸润深度的增加，MMP-9的表达逐渐增加，且有淋巴结转移组织中MMP-9的表达显著高于无淋巴结转移的癌组织。提示MMP-9的大量表达与肿瘤的浸润转移密切相关。推测具有转移倾向的癌细胞可能引起机体调控MMPs机制破坏，导致MMP-9大量表达，通过上述机制降解细胞外基质，破坏基底膜的完整性。癌细胞沿着缺失的基底膜向周围组织及深部浸润， 最终导致肿瘤向其他部位转移。Yan16等研究结果表明，MMP-9表达阳性的人类纤维肉瘤HT1080细胞转染K

21、iss-1后，MMP-9的表达水平和酶活性都减低，细胞的浸润能力也降低，其机制可能是Kiss-1可使细胞中抑制蛋白IkB含量增加进而封锁NF-kB向核内迁移，使NF-kB与MMP-9启动子结合减少，导致MMP-9转录水平下降，蛋白合成速率显著降低，从而抑制肿瘤细胞的趋化性和侵袭性。本实验通过关联性分析表明Kiss-1与MMP-9在CMM中的表达呈负相关，与Yan的研究结果一致，推测两者可能通过以上途径在CMM中存在着相互拮抗或负反馈调节的关系，其作用机制有待于进一步研究。综上所述，本实验通过对Kiss-1和MMP-9在CMM中异常表达的研究，表明CMM中Kiss-1表达降低或缺失及MMP-9大

22、量表达共同作用促进CMM的发生发展及浸润转移。联合检测Kiss-1和MMP-9可能为CMM临床诊疗及预后评价提供新的重要的途径。4参考文献1LEE JH, Welch DR. Suppression of metastasis in human breast carcinoma MDA-MB-435 cells after transfection with the metastasis suppressor gene,Kiss-1J.Cancer Res,1997,57(12):2384-2387.2 Ikeguchi M,Yamaguchi K,Kaibara N.Clinical sig

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