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1、第四课哺乳动物总RNA提取及RNA琼脂糖凝胶电泳1第一部分 哺乳动物总RNA提取2实验原理异硫氰酸胍可将哺乳动物组织匀浆中蛋白质变性，十二烷基肌氨酸钠可使细胞裂解，并释放RNA，同时保持RAN的完整。苯酚也是蛋白质变性剂，加入氯仿后离心，溶液分为水相和有机相。酸性条件下DNA同蛋白质一起变性被离心下来，绝大部分RNA则保留于水相。水相的RNA可经异丙醇沉淀。3实验试剂裂解液（4M异硫氰酸胍，25mM柠檬酸钠 Ph7.0，0.1M-巯基乙醇，0.5%十二烷基肌氨酸钠）2M醋酸纳，pH4.0水饱和苯酚，pH5.0氯仿75%乙醇（用DEPC处理的去离子水配置）DEPC处理的去离子水4实验步骤取3克组

2、织，加30ml裂解液，匀浆。吸取500ul匀浆液于1.5ml微量离心管中.加50ul2M醋酸纳（pH4.0），500ul水饱和苯酚，100ul氯仿，震荡1分钟。冰上放置15分钟。13000rpm，4，5分钟。将上清转移至1.5ml无酶微量离心管中，加等体积的苯酚/氯仿（1:1），震荡1分钟。13000rpm，4，5分钟。将上清转移至1.5ml无酶微量离心管中，加等体积的氯仿，震荡1分钟。13000rpm，4，5分钟。将上清转移至1.5ml无酶微量离心管中，加等体积的异丙醇。0放置20分钟。13000rpm，4，10分钟。去上清。用1ml75%乙醇洗管壁。尽量去处乙醇。室温干燥。将RNA沉淀溶于

3、10ul经DEPC处理的去离子水中。-20保存。 5第二部分 RNA琼脂糖凝胶电泳6实验原理常用的变性剂甲醛或戊二醛可使蛋白质变性，也可破坏RNA分子的二、三级结构。因此在含有变性剂的琼脂糖凝胶中电泳，可防止RNA被降解，同时可以避免RNA高级结构对电泳结果的影响。7实验试剂琼脂糖10X MOPS（吗啉代丙烷磺酸 ）(0.2M MOPS, 50mM NaAc, 10mM EDTA, Ph 7.0)37%甲醛RNA上样缓冲液（50%甲酰胺，1X MOPS，6%甲醛，7%甘油，0.3%溴酚蓝） 8实验步骤称取0.5克琼脂糖，加40ml去离子水。加热将琼脂糖充分融解。当溶液温度降至60左右，加5ml10X MOPS，5ml37%甲醛，2ulGoldView，混匀。倒入制胶板，室温静置至胶完全凝固。除去梳齿，将凝胶板放入电泳槽，加入1X MOPS至液面超过凝胶约2mm。取5ulRNA与10ulRNA上样缓冲液混匀。6510分钟，立即置冰上2分钟。上样，100V电泳40-50分钟。在紫外灯下观察电泳结果。9思考题如何处理玻璃器皿及金属器械，使之无RNA酶？如何配制DEPC水？如何配制无RNA酶试剂？在提取RNA的实验中，你认为操作上应注意那些地方能有助于防止R

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