2012外源基因表达与基因工程药物1

1、第十章外源基因表达与基因工程药物12005年全世界约有糖尿病患者1.8亿,我国约6000万。治疗糖尿病特效药胰岛素。每100kg 猪或牛的胰腺中仅可提取45g。1979年，美国将人的胰岛素基因重组到大肠杆菌内，实现了细菌生产胰岛素，大大降低了生产成本。2基因工程方法生产蛋白质药物的优势是非常明显的23 万美元 / 病人 200300 美元 / 病人3胰岛素人生长激素干扰素白细胞介素2粒细胞集落刺激因子粒细胞巨噬细胞集落刺激因子红细胞生成素 EPO组织纤溶酶原激活剂生长激素促生长素抗血友病因子脱氧核糖核酸酶葡糖脑苷脂酶鼠单克隆抗体4基因工程的产物：多彩小鱼转基因小鼠转基因小猪辣椒香蕉蓝色玫瑰黑籽

2、番茄5DNA(基因)mRNA 蛋白质(性状)转录翻译思考：基因的表达与基因的什么过程有关？密码子在生物界是的！通用6基因表达指基因通过转录和翻译而产生其蛋白产物，或转录后直接产生其RNA产物的过程。外源基因表达利用细胞内相关酶系及其调控系统，将外源基因转录成mRNA，进而翻译成肽链或加工成活性蛋白质的过程。7学习要求掌握：基因表达的基本原理，外源基因表达的基本过程。熟悉：外源基因表达的基本类型，外源基因表达载体的基本组成与功能。了解：外源基因表达在生产基因工程药物中的应用。8指在生物体外，通过对DNA分子进行人工“剪切”和“拼接”，对生物的基因进行改造和重新组合，然后导入受体（宿主）细胞内使之

3、持续稳定繁殖，目的基因扩增、表达，获得人类所需的产品的工程。（一）外源基因表达（基因工程）的概念基因工程又叫基因拼接技术或DNA重组技术。又称为基因克隆（gene cloning）或分子克隆（molecular cloning）。克隆（ cloning ）：指无性繁殖系，即由一个细胞经过无性繁殖后所形成的子代群体。9外源基因表达基本类型根据宿主细胞不同：原核细胞表达系统；真核细胞表达系统。根据表达产物在宿主细胞生成的部位不同：胞内表达、定位表达、分泌表达。根据表达产物的溶解状况不同：可溶性表达、包涵体表达。根据表达产物的结构状况不同：非融合表达；融合表达。10目的基因基因载体重组体分切接转筛表

4、总体技术路线11外源基因表达（基因工程）的基本过程：（1）分离：提取和获得目的基因和载体DNA；（2）切割：分别对目的基因和载体DNA酶切；（3）连接：用DNA连接酶连接目的基因与载体，形成 新的重组DNA分子；（4）转化：用重组DNA分子转化受体（宿主）细胞；（5）筛选：重组体在受体细胞中复制和遗传；对转化 子筛选和鉴定；（6）表达：对获得外源基因的细胞或生物体通过培 养，获得所需的遗传性状或表达出所需要 的产物。12 基因工程的重大意义1) 重组DNA技术填平了生物种属间不可逾越的鸿沟。 跨越天然物种屏障，将原核和真核生物、植物和动物，造福人类，在过去人们难以置信的事情，现在已成为现实。1

5、3（2）利用重组DNA技术可以在体外大量扩增、纯化人们感兴趣的基因，研究其结构、功能及调控机制，从而拓宽了分子生物学的研究领域。 14（3）医学上应用更为广泛，涉及各领域正常人类生命活动的分子机制；人类各种疾病发生的分子机理；人类各种疾病如遗传性疾病、肿瘤、肥胖、心血管疾病、传染病等病因的 查明、诊断、治疗和预防。药物的研发和生产；疾病模型的建立；人类的营养、健康、长寿和保健（亚健康）15 本章节的地位：现代科技革命高新技术生物技术（生物工程）基因工程基因克隆16 分子遗传学理论上的六大进展解决了生命现象的遗传物质基础（均是核酸）结构模型（同类构件、双螺旋）复制方式（相似的机制）遗传信息流动方

6、向（共同的中心法则）遗传密码（共用一套相同的密码）表达和调控的机理（类同的方法）基因突变机理、意义（变异与进化） 为基因工程技术的诞生典定了理论基础。 理论上的可行性。 17科技探索之路：基础理论和技术发展催生了基因工程早期基础理论孟德尔提出基因的分离定律和自由组合定律18科技探索之路：基础理论和技术发展催生了基因工程早期基础理论摩尔根证明基因在染色体上， 并提出基因的连锁互换定律。19科技探索之路：基础理论和技术发展催生了基因工程早期基础理论艾弗里证明DNA是主要遗传物质，DNA可从一种生物个体转移到另一种生物个体。20科技探索之路：基础理论和技术发展催生了基因工程早期基础理论 沃森、克里克

7、提出DNA的双螺旋结构模型。21科技探索之路：基础理论和技术发展催生了基因工程早期基础理论梅塞尔松、斯塔尔证明DNA的半保留复制22科技探索之路：基础理论和技术发展催生了基因工程早期基础理论克里克等提出中心法则DNARNA蛋白质转录翻译逆转录复制23科技探索之路：基础理论和技术发展催生了基因工程早期基础理论1963年尼伦伯格和马太破译编码氨基酸的遗传密码，1966年霍拉纳用实验加以证明。24二、分子遗传学新方法是基因工程的技术基础首当其冲的是要解决： 如何自如地得到目的基因； 如何在体外改造基因，得到重 组体； 在体外转移重组基因；直到20世纪70年代中期，相继出现了 几项关键性技术，梦想成真

8、。25基因操作的工具基因的剪刀限制性核酸内切酶基因的针线DNA 连接酶运载体 （如质粒、噬菌体和动植物病毒等） 基因的运输工具26一把特殊的剪刀限制性内切酶的发现阿尔伯(Arber)、史密斯(Smith)和内森斯(Nathans)，获1978年诺贝尔生理学和医学奖27限制性核酸内切酶(restriction endonuclease, RE) 是一类由细菌产生的能专一识别双链DNA中的特定碱基序列、并由此切割DNA双链结构的核苷酸内切酶，简称限制酶或切割酶。 根据酶的功能、大小和反应条件，及切割的特点，可以将限制性内切酶分为三类： 型酶、型酶、 型酶28限制酶（型）特异识别及切割48个bp长度

9、且具有回文序列的DNA片断回文序列：是指该部位的核苷酸序列呈180O旋转对称;29限制性内切酶能识别特定的碱基序列30限制性核酸内切酶命名：大肠杆菌：Escherichia coli；EcoR(E：属名；co：种名；R：株；：发现次序)；流感嗜血菌：Haemophilus influenzae; HindIII312.同裂酶(异源同工酶)：凡来源不同但识别和切割同样的核苷酸序列的限制性酶。3.同尾酶：来源、识别顺序、切割方式不同，但所生成的限制性片段是相同的粘性末端32限制酶切出的末端粘性末端（sticky end）:两条链上的断裂位置是交错的、但又是围绕着一个轴线对称排列，其结果产生两个互补

10、的单链末端，这种单链末端由于可以互补成双链结构，所以称为粘性末端。平末端（blunt end）: 在识别序列内同一位置上的核苷酸处进行切割，产生的DNA片段不带粘性末端而是没有单链突出的平齐末端。33作用特点断开磷酸二酯键EcoR黏性末端黏性末端34 作用特点断开磷酸二酯键Sma平末端 平末端35限制性内切酶造成粘性末端有利于重组DNA 分子的构建36“分子缝合针” DNA连接酶1种类 ： Ecoli DNA连接酶 T4 DNA连接酶2作用：恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间 的磷酸二酯键。3作用原理：催化磷酸二酯键形成371.Ecoli DNA连接酶或T4DNA连接酶恢复被限制酶切开的两个核苷

11、酸之间的磷酸二酯键382.T4DNA连接酶T4 DNA连接酶还可把平末端之间的缝隙“缝合”起来，但效率较低T4DNA连接酶393.连接酶类型总结EcoliDNA连接酶T4DNA连接酶来源功能大肠杆菌T4噬菌体恢复磷酸二酯键只能连接黏性末端能连接黏性末端和平末端(效率较低)相同点差别40比较：DNA连接酶与DNA聚合酶1)只能将单个核苷酸连接到已有的核酸片段上，形成磷酸二酯键形成磷酸二酯键1)在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键2)以一条DNA链为模板，将单个核苷酸通过磷酸二酯键连接成一条互补的DNA链2)将DNA双链上的两个缺口同时连接起来，不需要模板41DNA限制酶和连接酶的发现使基因工程从理

12、论走向了实验室4243 大多数的DNA片段不具备自我复制能力，为了能够在寄主细胞中进行繁殖，就必须将DNA片段连接到一种具有自我复制能力的DNA分子上，这种DNA 分子就是载体。44载 体（Vector） 载体(vector)是将外源DNA(目的DNA)片断引入宿主细胞进行扩增或表达的运载工具，其化学本质为DNA 。常用的载体分为3类：质粒、噬菌体和病毒45作为载体的条件 能独立复制具备多个限制酶的识别位点(多克隆位点)具有遗传表型或筛选标记有足够的容量以容纳外源DNA片段。表达型载体还应具备与宿主细胞相适应的启动子、前导序列、增强子等调控元件。载体DNA中均有一段非必需区，将外源基因插入 该

13、非必需区，而载体本身不受影响。46 常用的载体有：1. 质粒（plasmid ）是存在于细菌染色体外的、能自主复制的环状双链小分子DNA，适于做小片断基因的载体。2. 噬菌体DNA线状双链DNA，适于做大片断基因的载体。47大肠杆菌的质粒载体氨苄青霉素抗性基因：ampr；四环素抗性基因：tetr；DNA复制起点：ori 48返回用质粒构建重组DNA分子49噬菌体 组成特点： 双链线状DNA分子， 全长50kb， 含65个基因， 在其分子两端各含有12个碱基的互补单链，是天然的粘性末端，被称为COS位点。50用噬菌体DNA构建重组DNA分子51克隆载体以扩增DNA片断为目的，并不需要得到目的基因

14、所编码蛋白质的载体，适用于外源基因的重组、克隆、复制与保存；克隆载体常带有一个松弛型复制子，一个多克隆位点、筛选标记52分类：质粒、噬菌体、黏性质粒、M13噬菌体、酵母载体、真核细胞病毒载体1.常用的克隆载体质粒和噬菌体常用于原核细胞为宿主的分子克隆，病毒则使用于真核细胞为宿主的克隆53（二）表达载体能使外源基因在宿主细胞 中转录和表达的功能性载体。54itemClick to edit textClick to edit text1.很强启动子，能被宿主RNA聚合酶识别2.很强终止子3.启动子只有在诱导状态时才能启动转录4.起始密码和SD序列处在合适距离5.需复制原点，在载体内插入人工组成的

15、多克隆位点具备条件55宿主（host）能接纳重组子并实现重组子的外源基因转录、扩增或表达的受体细胞。原核细胞：大肠埃希菌、芽胞杆菌等。属于原核细胞表达系统。真核细胞：酵母细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞。属于真核细胞表达系统。56 1972年，美国斯坦福大学Berg博士领导的一个研究小组，率先完成了世界上第一次成功的DNA体外重组实验，基因工程从此诞生。57目的基因基因载体重组体分切接转筛表总体技术路线58基因工程的主要步骤1. 从生物有机体的基因组中，分离出带目的基因的DNA片段-目的基因的获得。2. 将带目的基因的外源DNA片段，连接到能自我复制的载体分子上，形成重组DNA分子- DNA分子重

16、组。3. 将重组DNA分子转移到适当的受体细胞内-导入。4. 筛选获得了重组DNA分子的受体细胞进行克隆-分子克隆。5. 克隆基因的表达，产生出人类所需要的物质-基因表达。591.目的基因制备和常用分离方法目的基因：指已被或者准备要被分离、改造、扩增或表达的特定基因或DNA片段。通常是人们需要的生物活性物质的编码基因。60目的基因的获得1. 人工化学合成概述：1979年采用化学方法合成基因；只要合成出具有特定序列的寡核苷酸片断，通过DNA连接酶的作用，可使其 按照一定的顺序进行共价连接而成61PCR扩增技术聚合酶链式反应，体外扩增特定基因序列的方法。是有引物介导的特定DNA序列的酶扩增，能将p

17、g水平的DNA特异扩增100万倍(ug)。据碱基配对原理，在DNA聚合酶催化和dNTP的参与下，引物依赖于DNA模板特异性引导DNA合成；包括变性、退火、延伸三步组成的循环。PCR基 本原 理62“I do my best thinking while driving”1993 Nobel prize 63 聚合酶链式反应:利用酶促反应在体外大量、特异性扩增DNA片段。把寻找目的基因和扩增目的基因两步操作并成一步。64three steps:How PCR worksDenaturation (变性): 9097Annealing (退火): 4555Extension (延伸): aroun

18、d 72655Primer 15Primer 2Cycle 2Cycle 155 55 5 5Template DNA55 555 5 55662530 次循环后，模板DNA的含量可以扩大100万倍以上。Cycle 355 555 5 555 5 55 555 5673. 外源DNA片断导入受体（宿主）细胞 构建好的重组 DNA 分子进入宿主细胞的过程，称为转化。如果接受异源 DNA 的细胞不是细菌，而是动物细胞或植物细胞，常常称为转染。68 重组DNA导入大肠杆菌细胞 氯化钙转化法 转染法 重组DNA导入哺乳动物细胞 显微注射法 DNA磷酸钙转染法感受态细胞：经处理能吸收重组DNA分子的敏感

19、状态宿主细胞694. 筛选目的基因目的基因导入受体细胞后，还需要经过筛 选， 才能确定真正所需要的目的基因。根据载体的选择性标记基因的生物活性表现状况进行初步的甄别和筛选。用PCR技术扩增进一步检测。通过基因测序分析确证。70标记的DNA探针715. 基因的表达 克隆基因表达的三个条件： 基因的编码区不能被插入序列所中断; 基因转录要有启动子，而启动子必须能被宿主细胞的RNA多聚酶有效地识别; mRNA必须相当稳定，并有效地被翻译，产生的外源蛋白质必须不被宿主细胞的蛋白酶所降解.72小结 基因工程主要包括几个过程：1、目的基因的制备；2、选择合适的载体，将目的基因与载体相连 接生成重组DNA分

20、子；3、将重组DNA片段导入宿主细胞；4、筛选目的基因；5、目的基因的表达73基因工程的应用基因工程药物制备疫苗基因治疗转基因动物转基因植物工程菌741、 基因工程药物 生产基因工程药物的基本方法是，将目的基因用DNA重组的方法连接在载体上，然后将载体导入靶细胞（微生物，哺乳动物细胞或人体组织靶细胞），使目的基因在靶细胞中得到表达，最后将表达的目的蛋白质提纯及作成制剂，从而成为蛋白类药或疫苗。75762、制备基因工程疫苗 基因工程疫苗可以帮助解决传统技术难以解决的 一些特殊的病原体疫苗。如，（1） 乙型肝炎病毒疫苗（HBV）、丙型肝炎病毒疫 苗（HCV）等；（2） 有诱发致癌或产生免疫病理作用

21、的疫苗，如人 T细胞免疫缺陷病毒（HITV-1）等；（3） 常规效果较差的疫苗，如霍乱和痢疾疫苗等（4） 制备一些多价疫苗等。77常见的基因工程药物干扰素系列，肝炎病毒复制抑制、肿瘤治疗 白细胞介素系列 肿瘤、免疫增强 EPO（促红细胞生成素） 促进红血球增生、治疗贫血 G-CSF 促进粒细胞增生 TPO 促进血小板生长 EGF 促进表皮细胞生长 NGF 促进神经细胞生长 单克隆抗体系列 基因工程疫苗78基因工程的安全性和社会伦理问题 科学技术 是一把双刃剑，带来巨大利益，同时也带来了潜在威胁和社会伦理问题。 基因工程的发展离不开社会伦理道德的制约。79思 考 题 1.名词解释：基因工程、克隆载体 、表达载体 2.基因工程的内容和步骤是什么？ 3.基因工程的载体具有哪些特点？ 80Thats AllThank you!81哈哈， 下 课