基因组学蛋白组学

1、会计学1基因组学蛋白组学基因组学蛋白组学第1页/共206页第2页/共206页第3页/共206页第4页/共206页第5页/共206页第6页/共206页第7页/共206页获取自身所需的能量获取自身所需的能量合成自身生长所需的原料合成自身生长所需的原料调节自身的酶系统组成及功能调节自身的酶系统组成及功能调节细胞内某种蛋白质的数量调节细胞内某种蛋白质的数量第8页/共206页第9页/共206页第10页/共206页原核基因组类核结构原核基因组类核结构第11页/共206页第12页/共206页第13页/共206页第14页/共206页第15页/共206页第16页/共206页第17页/共206页复制机制复制机制严

2、紧型质粒严紧型质粒松弛型质粒松弛型质粒质粒功能质粒功能F质粒（性质粒）质粒（性质粒）R质粒（抗药性质粒）质粒（抗药性质粒）Col质粒（大肠杆菌素生长因子质粒（大肠杆菌素生长因子）转移方式转移方式结合型质粒结合型质粒可移动型质粒可移动型质粒自传递型质粒自传递型质粒质粒的宿主范围质粒的宿主范围窄宿主谱型质粒窄宿主谱型质粒广宿主谱型质粒广宿主谱型质粒第18页/共206页第19页/共206页第20页/共206页插入序列插入序列转座子转座子可转座的噬菌体可转座的噬菌体第21页/共206页第22页/共206页第23页/共206页第24页/共206页第25页/共206页第26页/共206页第27页/共206

3、页第28页/共206页第29页/共206页第30页/共206页第31页/共206页病毒基因组结构病毒基因组结构第32页/共206页第33页/共206页SV40病毒转录后加工病毒转录后加工第34页/共206页腺病毒基因组：腺病毒基因组： 线状双链线状双链DNA 全长全长36kb 含轻链（含轻链（L链链） 重链（重链（H链），链），5均与蛋白质均与蛋白质结合结合 L链与链与H链可分链可分开自行成环开自行成环第35页/共206页第36页/共206页HBV DNAHBV DNA复制周期复制周期第37页/共206页第38页/共206页第39页/共206页HIV复制过程第40页/共206页第41页/共20

4、6页丙型肝炎病毒基因组：丙型肝炎病毒基因组：单链正链单链正链RNA病毒，链长约病毒，链长约9.5kb 整个基因组只有一个整个基因组只有一个ORF，编码，编码3011或或3010个氨基酸个氨基酸5有一长度和序列非常稳定的保守序列（非编码区有一长度和序列非常稳定的保守序列（非编码区UTR），由），由324341nt组成，是临床诊断的靶序列。组成，是临床诊断的靶序列。第42页/共206页第43页/共206页第44页/共206页真核生物基因结构真核生物基因结构第45页/共206页第46页/共206页第47页/共206页第48页/共206页高度重复序列反向重复序列串联重复序列中度重复序列短分散片段长分散

5、片段低度重复序列单拷贝数个拷贝第49页/共206页第50页/共206页第51页/共206页第52页/共206页第53页/共206页第54页/共206页第55页/共206页主体DNA大卫星DNA小卫星DNA微卫星DNA 第56页/共206页第57页/共206页第58页/共206页第59页/共206页第60页/共206页第61页/共206页第62页/共206页第63页/共206页基因家族的特点基因家族的特点第64页/共206页超基因家族（超基因家族（gene superfamily）第65页/共206页假基因（假基因（pseudogene）第66页/共206页第67页/共206页第68页/共206

6、页第69页/共206页第70页/共206页基因多态性类型限制性片段长度多态性短串联重序列多态性单核苷酸多态性第71页/共206页第72页/共206页第73页/共206页第74页/共206页第75页/共206页第76页/共206页第77页/共206页第78页/共206页母系遗传母系遗传突变率高突变率高遗传密码与通用密码不完全相同遗传密码与通用密码不完全相同mtDNA突变与一些疾病发生密切相关突变与一些疾病发生密切相关第79页/共206页第80页/共206页第81页/共206页第82页/共206页第83页/共206页第84页/共206页（二）人类基因组计划内容遗传图谱物理图谱序列图谱转录图谱第85

7、页/共206页 连锁的遗传标志之间的遗传学距离连锁的遗传标志之间的遗传学距离是通过计算它们的重组频率来确定的，是通过计算它们的重组频率来确定的，一般用厘摩（一般用厘摩（CM）表示）表示第86页/共206页第87页/共206页第88页/共206页第89页/共206页结构基因组学：全基因组测序结构基因组学：全基因组测序功能基因组学：基因功能鉴定功能基因组学：基因功能鉴定第90页/共206页第91页/共206页从整体水平研究基因及其产物在不同时间、空间、条件的结构与功能关系从整体水平研究基因及其产物在不同时间、空间、条件的结构与功能关系及活动规律及活动规律功能基因组学功能基因组学从整体角度分析细胞内

8、动态变化的蛋白质组成成分；表达水平（定量）；从整体角度分析细胞内动态变化的蛋白质组成成分；表达水平（定量）；蛋白质结构及修饰状态（三维结构、活性部位）；蛋白质之间的相互作用蛋白质结构及修饰状态（三维结构、活性部位）；蛋白质之间的相互作用（蛋白质网络）（蛋白质网络）蛋白质组学蛋白质组学通过对核苷酸序列、基因组的大小、基因数量多少、特定基因的存在与缺通过对核苷酸序列、基因组的大小、基因数量多少、特定基因的存在与缺失、基因的位置及排列顺序等进行比较研究，探讨物种的进化、基因功能失、基因的位置及排列顺序等进行比较研究，探讨物种的进化、基因功能演变和基因调控。演变和基因调控。比较基因组学比较基因组学研究

9、人类疾病与环境因素相关的易感基因及其产物，阐明其对环境暴露的研究人类疾病与环境因素相关的易感基因及其产物，阐明其对环境暴露的遗传性反应分子机制。遗传性反应分子机制。环境基因组学环境基因组学人类对药物作用存在个体差异。通过研究疾病相关基因、药物作用靶点、人类对药物作用存在个体差异。通过研究疾病相关基因、药物作用靶点、药物代谢酶谱、药物转运蛋白基因多态性，阐明影响药物作用、药物吸收、药物代谢酶谱、药物转运蛋白基因多态性，阐明影响药物作用、药物吸收、转运、代谢、清除过程中的基因差异。提高药物疗效及安全性转运、代谢、清除过程中的基因差异。提高药物疗效及安全性药物基因组学药物基因组学第92页/共206页

10、第93页/共206页第94页/共206页第95页/共206页DNAmRNA蛋白质蛋白质转录转录翻译翻译基因基因蛋白质蛋白质细胞特细胞特异性基异性基因表达因表达生理状态生理状态蛋白质相互作用蛋白质相互作用温度温度应激应激状态状态培养条件培养条件药物作用药物作用数量有限数量有限结构相对结构相对稳定稳定复杂性复杂性多变性多变性直接直接反应反应生命生命现象现象复复杂杂的的调调控控第96页/共206页第97页/共206页第98页/共206页第99页/共206页第100页/共206页第101页/共206页第102页/共206页第103页/共206页第104页/共206页蛋白质组及其质点的分离与纯化蛋白质组

11、及其质点的分离与纯化一、分离纯化一、分离纯化二、二、分析分析鉴定鉴定第105页/共206页第106页/共206页第107页/共206页第108页/共206页生物体组织细胞生物体组织细胞离心技术离心技术盐析法盐析法亲和层析亲和层析凝胶层析凝胶层析离子交换层析离子交换层析电泳法电泳法纯化蛋白纯化蛋白材料选择材料选择细胞破碎细胞破碎有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法等电点法等电点法第109页/共206页第110页/共206页第111页/共206页（二）盐析法（二）盐析法第112页/共206页（三）电泳技术（三）电泳技术第113页/共206页（四）层析技术（四）层析技术凝胶过滤层析凝胶过滤层析第114页/共

12、206页离子交换层析：离子交换层析：第115页/共206页亲和层析亲和层析：第116页/共206页第117页/共206页（一）（一）Western印迹杂交印迹杂交基本操作步骤：基本操作步骤： 蛋白样品的制备蛋白样品的制备 SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 蛋白质的电转移蛋白质的电转移蛋白质与抗体的结合反应蛋白质与抗体的结合反应 目标蛋白质的显示目标蛋白质的显示western western 印迹基本步骤图示印迹基本步骤图示第118页/共206页第119页/共206页第120页/共206页2-DE 技术原理技术原理第121页/共206页第122页/共206页第123页/共206页

13、第124页/共206页第125页/共206页第126页/共206页 蛋白质蛋白质溶解溶解变性变性还原还原去除蛋白去除蛋白质杂质质杂质利用不同利用不同pKpK固定化固定化电解质配电解质配置不同置不同pHpH范围的凝范围的凝胶胶利用软件利用软件设计配置设计配置 第一相电泳第一相电泳(IPG(IPGIFE)IFE)平衡平衡第二相电泳第二相电泳(SDS(SDSPAGE)PAGE)考马斯亮考马斯亮蓝染色蓝染色银染色银染色铜染色铜染色样品制备样品制备IPGIPG胶制备胶制备双相电泳双相电泳染色染色第127页/共206页第128页/共206页第129页/共206页第130页/共206页第131页/共206页

14、考马斯亮蓝染色考马斯亮蓝染色第132页/共206页银染色银染色第133页/共206页银染色显示蛋白斑点银染色显示蛋白斑点第134页/共206页第135页/共206页第136页/共206页第137页/共206页2-DE2-DE图像分析软件包操作过程：图像分析软件包操作过程：图像采集图像采集斑点检测斑点检测背景消减背景消减获得蛋白质相关信息获得蛋白质相关信息图像内及图像间的比较图像内及图像间的比较第138页/共206页第139页/共206页第140页/共206页第141页/共206页第142页/共206页第143页/共206页第144页/共206页N-末端末端Edman化学降解法化学降解法测序原理

15、测序原理第145页/共206页第146页/共206页第147页/共206页 Ion source Ion separator detector离子资源离子资源: : 底物变成离子气底物变成离子气质量分析质量分析: : 根据质量根据质量/ /电荷电荷 (m/z)(m/z)检测检测: : femtomole attomole ( (10-15 10-18 mole) )第148页/共206页第149页/共206页质谱仪进样装置离子化源质量分析器离子检测器数据分析系统离子化源和质量分析器为两个主要的部件离子化源和质量分析器为两个主要的部件第150页/共206页第151页/共206页第152页/共20

16、6页第153页/共206页MALDI-TOFMatrix Assisted Laser Desorption Ionization Time Of Flight基质辅助激光解吸基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱电离飞行时间质谱ESI tandem MS (with HPLC, LC tandem MS or LC MS/MS)Electro Spray Ionization MS Quadrupole电子喷雾离子化电子喷雾离子化/四极杆质谱四极杆质谱第154页/共206页Microflex , BrukerVoyager DE-PRO, ABIMALDI micro, Micromass第15

17、5页/共206页+pulsedUV or IR laser(3-4 ns)detectorvacuumstrong electric fieldTime Of Flight tubepeptide mixtureembedded in light absorbing chemicals (matrix)cloud ofprotonatedpeptide moleculesaccV第156页/共206页Linear Tim e O f Flight tubeReflector Tim e Of Flight tubedetectorreflectorion sourceion sourcedet

18、ectortime of flighttime of flight第157页/共206页第158页/共206页第159页/共206页trypticdigestionGelProteinDatabase?123compare:? is identical to ?massspectrometrystored data or theoretical peptides第160页/共206页Nano electrospray: 30 min spray time for 1 m mL sampleHighly charged molecules are selected by ac modulatio

19、n of transverse fields第161页/共206页Scanning of measuring range:U (DC voltage)V (peak amplitude of a radio frequency)U and V are variedU + V cos 2 f tU V cos 2 f tac and dc voltagesions withcorrespondingm/z ions collidewith the rodsDetector第162页/共206页第163页/共206页第164页/共206页第165页/共206页Quadrupole 0 Quadru

20、pole 1 Quadrupole 2 Quadrupole 3 DetectorInterface ac onlyfor properion entrance1. ion scanner2. ion scannermultipliercollisionchamberArgon atomsNH2NH2CID: Collision Induced Dissociation for acquiring Molecular weight and Structural information 第166页/共206页第167页/共206页第168页/共206页第169页/共206页API 4000, A

21、PIQ-Tof ultima API, MicromassHCT plus, Bruker第170页/共206页第171页/共206页protein, no sequence informationn (2) results is highly dependent on sample quality. sensitivity n缺点缺点: (1) Lower through putn (2) pricey第172页/共206页第173页/共206页第174页/共206页第175页/共206页蛋白质芯片蛋白质芯片第176页/共206页第177页/共206页第178页/共206页 酵母双杂交系统酵

22、母双杂交系统 DNA-BDDNA-BD具有与报告基因转具有与报告基因转录调控区特异结合的功能，录调控区特异结合的功能，DNA-ADDNA-AD则具有活化转录的功能则具有活化转录的功能。报告基因第179页/共206页第180页/共206页第181页/共206页凝胶滞后试验凝胶滞后试验 蛋白质可以与末端标记的核酸探针特蛋白质可以与末端标记的核酸探针特异性结合，所形成的复合物电泳时在异性结合，所形成的复合物电泳时在凝胶中的泳动速度比未与蛋白结合的凝胶中的泳动速度比未与蛋白结合的游离探针慢，即表现为相对滞后游离探针慢，即表现为相对滞后 该实验可以评价蛋白与核酸结合的特该实验可以评价蛋白与核酸结合的特异

23、性异性第182页/共206页滤膜结合法滤膜结合法 利用硝酸纤维素滤膜不能结合双链利用硝酸纤维素滤膜不能结合双链DNADNA，但可与蛋白质结合的特性，将与蛋白质结合的但可与蛋白质结合的特性，将与蛋白质结合的DNADNA片段与游离片段与游离DNADNA片段分离开。片段分离开。第183页/共206页甲基化干扰甲基化干扰将将DNA DNA 甲基化后与蛋白质进行反甲基化后与蛋白质进行反应，只有在结合位点上未被修饰应，只有在结合位点上未被修饰的的DNA DNA 片段才能与蛋白质结合。片段才能与蛋白质结合。用特殊方法将用特殊方法将DNADNA从被修饰的碱基从被修饰的碱基处进行切割，并经电泳分离。处进行切割，

24、并经电泳分离。未结合蛋白质的未结合蛋白质的DNADNA可在随机修饰可在随机修饰的位点被切割，而结合蛋白质的的位点被切割，而结合蛋白质的DNADNA在结合位点上未被修饰而不能在结合位点上未被修饰而不能被切割，由此可获得蛋白质与核被切割，由此可获得蛋白质与核酸定位结合的信息。酸定位结合的信息。DNADNA探针的末端标记探针的末端标记及探针的甲基化及探针的甲基化蛋白质与甲基化探针的结合及蛋白质与甲基化探针的结合及 DNADNA蛋白质结合探针的分离蛋白质结合探针的分离结合物及对照探针结合物及对照探针的化学切割的化学切割DNADNA片段的序列测定片段的序列测定第184页/共206页DNaseDNase足