限制性核酸内切酶的命名和类型学习教案

1、会计学1第一页，共74页。核酸酶：通过切割相邻的两个核苷酸残基之间的磷酸二酯键，从而(cng r)导致核酸分子多核酸链发生水解断裂的蛋白酶。基本概念及其生物基本概念及其生物(shngw)功能功能特异水解断裂特异水解断裂(dun li)RNA分子，核糖核酸酶（分子，核糖核酸酶（RNase）特异水解断裂特异水解断裂(dun li)DNA分子，脱氧核糖核酸酶（分子，脱氧核糖核酸酶（DNase）非专一性酶，底物或者为非专一性酶，底物或者为DNA或者为或者为RNA从核酸分子末端逐个降解核苷酸，叫从核酸分子末端逐个降解核苷酸，叫外切核酸酶外切核酸酶从核酸分子内部切割磷酸二酯键使之断裂形成小片段，叫从核酸分

2、子内部切割磷酸二酯键使之断裂形成小片段，叫内切核酸酶内切核酸酶 按水解断裂核酸分子的方式按水解断裂核酸分子的方式: 根据作用的核酸底物不同根据作用的核酸底物不同:第1页/共73页第二页，共74页。基因工程的操作，是在分子水平上的操作基因工程的操作，是在分子水平上的操作，是依赖一些酶，是依赖一些酶( (如限制性核酸内切酶，连接如限制性核酸内切酶，连接酶，酶，DNADNA聚合酶等聚合酶等) )作为作为(zuwi)(zuwi)工具对基因进工具对基因进行人工切割，拼接和扩增等操作。所以把这些行人工切割，拼接和扩增等操作。所以把这些酶称之为酶称之为“工具酶工具酶”。 工具工具(gngj)(gngj)酶酶

3、 第2页/共73页第三页，共74页。1 1、限制、限制- -修饰系统修饰系统2 2、限制性核酸内切酶的命名和类型、限制性核酸内切酶的命名和类型3 3、IIII型限制性核酸内切酶的基本特性型限制性核酸内切酶的基本特性4 4、影响限制性内切酶活性的因素、影响限制性内切酶活性的因素5 5、限制性内切酶对、限制性内切酶对DNADNA的消化的消化(xiohu)(xiohu)作用作用 第一节第一节 限制性核酸限制性核酸(h sun)(h sun)内切酶内切酶第3页/共73页第四页，共74页。 限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶(Restriction (Restriction endonuclease)en

4、donuclease)是一类能够识别是一类能够识别(shbi)(shbi)双链双链DNADNA分子中的某种特定核苷酸序列分子中的某种特定核苷酸序列(4-8bp)(4-8bp)，并由此处切割并由此处切割DNADNA双链的核酸内切酶。双链的核酸内切酶。 限制性核酸限制性核酸(h sun)(h sun)内切酶概念内切酶概念第4页/共73页第五页，共74页。2. 2. 性质性质(x(xnngzgzhh) )内切酶内切酶主要主要(zhyo)(zhyo)来源于原核生来源于原核生物物即在核酸分子链的内部即在核酸分子链的内部(nib)(nib)制造切口的酶。制造切口的酶。形成形成5 5-P-P和和3 3-OH

5、-OH末端末端 自我保护作用自我保护作用3. 3. 功能功能细菌的限制和修饰系统（细菌的限制和修饰系统（R/MR/M体系）体系）任何一种生物体都存在防御外界物质进入的机制任何一种生物体都存在防御外界物质进入的机制第5页/共73页第六页，共74页。大肠杆菌大肠杆菌(d chn (d chn n jn)Bn jn)B大肠杆菌大肠杆菌(d chn (d chn n jn)Kn jn)Kphage (B)phage (B)EOP=10-4EOP=10-4（限制（限制(xinzh)(xinzh)作用）作用）EOP=10EOP=10-4-4（限制作用限制作用）EOP=1EOP=1（修饰作用修饰作用）修饰的

6、修饰的phage (K)phage (K) 人们发现侵染大肠杆菌的噬菌体都存在着一些功能性障碍。即所谓人们发现侵染大肠杆菌的噬菌体都存在着一些功能性障碍。即所谓的寄主控制的的寄主控制的限制与修饰现象限制与修饰现象简称（简称（R/MR/M体系体系）。）。 细菌的细菌的R/MR/M体系类似于免体系类似于免疫系统，能辨别自身的疫系统，能辨别自身的DNADNA与外来的与外来的DNADNA，并能使后者降解掉。，并能使后者降解掉。 寄主的限制与修饰现象寄主的限制与修饰现象E.O.P E.O.P 成斑率成斑率efficiency of platingefficiency of platingEOP=1EOP

7、=1第6页/共73页第七页，共74页。 限制性内切酶将侵入限制性内切酶将侵入(qnr)(qnr)细菌体内的外源细菌体内的外源DNADNA进行分解，切成小片断。进行分解，切成小片断。 限制作用限制作用: :实际就是限制性内切酶降解外源实际就是限制性内切酶降解外源DNADNA，维护宿主遗传稳定的保护，维护宿主遗传稳定的保护(boh)(boh)机制。机制。第7页/共73页第八页，共74页。 细菌自身细菌自身(zshn)(zshn)的的DNADNA碱基被甲基化酶甲基化修饰碱基被甲基化酶甲基化修饰所保护，不能被自身所保护，不能被自身(zshn)(zshn)的限制性内切酶识别切割的限制性内切酶识别切割。

8、Dam Dam甲基化酶甲基化酶( (DNA Adenine MethylaseDNA Adenine Methylase) )GATC GATC 腺嘌呤腺嘌呤N6N6位置位置(wi zhi)(wi zhi)引入甲引入甲基基 Dcm Dcm甲基化酶甲基化酶( (DNA cytosine MethylaseDNA cytosine Methylase) )C CC CAGGAGG或或C CC CTGGTGG序列在第二个序列在第二个C C上上C C5 5位置上引位置上引入甲基入甲基 修饰作用修饰作用: :宿主细胞通过甲基化作用达到识别自宿主细胞通过甲基化作用达到识别自身遗传物质和外来遗传物质的目的。

9、身遗传物质和外来遗传物质的目的。第8页/共73页第九页，共74页。第9页/共73页第十页，共74页。 hsd R: hsd R: 编码编码(bin m)(bin m)限制性限制性内切酶内切酶 hsd M: hsd M: 编码编码(bin m)(bin m)限制性限制性甲基化酶甲基化酶 hsd hsd S: S: 编码限制性内切酶和甲基化酶的协同表达编码限制性内切酶和甲基化酶的协同表达这类酶能识别这类酶能识别DNADNA分子上的特定位点，并将双链分子上的特定位点，并将双链DNADNA切断切断这类酶使这类酶使DNADNA分子特定位点上的碱基甲基化，即起分子特定位点上的碱基甲基化，即起修饰修饰 DN

10、A DNA的作用。的作用。作用是协同上述两种酶识别特殊的作用位点。作用是协同上述两种酶识别特殊的作用位点。第10页/共73页第十一页，共74页。2.2.入噬菌体长期生长在大肠杆菌宿主细胞入噬菌体长期生长在大肠杆菌宿主细胞 K K株，株，B B株株 中，中， 1 1）宿主细胞甲基化酶，将染色体）宿主细胞甲基化酶，将染色体DNADNA和噬菌体和噬菌体DNADNA特异性保护特异性保护. . 2 2）封闭自身所产生）封闭自身所产生(chnshng)(chnshng)的核酸内切酶的的核酸内切酶的识别位点识别位点-（修饰）（修饰）1.1.大肠杆菌宿主细胞大肠杆菌宿主细胞 K K株，株，B B 株株 ，有各

11、自的限制和修饰，有各自的限制和修饰(xish)(xish)系统。系统。限制和修饰限制和修饰(xish)(xish)作用的分作用的分子机制子机制第11页/共73页第十二页，共74页。3. 3. 外来外来(wili)DNA(wili)DNA入侵时，遭到宿主限制性内切酶的特异入侵时，遭到宿主限制性内切酶的特异降解降解 - -（限制）（限制）4. 4. 由于降解不完全，外来少数由于降解不完全，外来少数DNADNA分子在宿主细胞分子在宿主细胞(xbo)(xbo)中繁殖过程中被宿主细胞中繁殖过程中被宿主细胞(xbo)(xbo)的甲基化酶修饰，虽的甲基化酶修饰，虽然是外来却不被降解。然是外来却不被降解。 5

12、 5接受了新宿主菌甲基化修饰的同时，丧失了原宿主菌修接受了新宿主菌甲基化修饰的同时，丧失了原宿主菌修饰的标记，丧失在原宿主细胞饰的标记，丧失在原宿主细胞(xbo)(xbo)中的存活能力。中的存活能力。基因工程中，应采用缺少基因工程中，应采用缺少(qusho)限制作用的菌株作为受体。限制作用的菌株作为受体。第12页/共73页第十三页，共74页。1 1、限制、限制- -修饰系统修饰系统2 2、限制性核酸内切酶的命名和类型、限制性核酸内切酶的命名和类型3 3、IIII型限制性核酸内切酶的基本型限制性核酸内切酶的基本(jbn)(jbn)特性特性4 4、影响限制性内切酶活性的因素、影响限制性内切酶活性的

13、因素5 5、限制性内切酶对、限制性内切酶对DNADNA的消化作用的消化作用 第一节第一节 限制性核酸限制性核酸(h sun)(h sun)内切酶内切酶第13页/共73页第十四页，共74页。19731973年年H.O SmithH.O Smith和和D. NathansD. Nathans提议的命名提议的命名(mng (mng mng)mng)系统，命名系统，命名(mng mng)(mng mng)原则如下：原则如下：1.1. 用属名的第一个字母和种名的头两个用属名的第一个字母和种名的头两个(lin (lin )字母组成字母组成3 3个字母的略语表示寄主菌的物种个字母的略语表示寄主菌的物种名，组

14、成酶的基本名称。名，组成酶的基本名称。大肠杆菌（大肠杆菌（E Escherichia scherichia cocolili）用）用EcoEco表示；表示；流感嗜血菌（流感嗜血菌（H Haemophilus aemophilus ininfluenzaefluenzae）用）用HinHin表示表示第14页/共73页第十五页，共74页。2. 2. 如果酶存在于一种特殊的菌株中，则将该菌株名的第如果酶存在于一种特殊的菌株中，则将该菌株名的第一个字母加在基本名称后，若酶的编码基因位于噬菌体（一个字母加在基本名称后，若酶的编码基因位于噬菌体（病毒）或质粒上，则用一个大写字母表示病毒）或质粒上，则用一个

15、大写字母表示(biosh)(biosh)此染此染色体外遗传成分。色体外遗传成分。如如 HinHind d ：d d菌株菌株 Eco EcoR R I I ：抗药性：抗药性R R质粒质粒 第15页/共73页第十六页，共74页。3. 3. 如果一种特殊的菌株内有几种如果一种特殊的菌株内有几种(j zhn)(j zhn)不同不同的限制与修复系统，用罗马字母表示该菌株中发现的限制与修复系统，用罗马字母表示该菌株中发现某种酶的先后次序。某种酶的先后次序。 如如Hind Hind ：d d菌株中发现的第二个酶菌株中发现的第二个酶4. 4. 所有的限制酶，除以上名称外还要冠以系统所有的限制酶，除以上名称外还

16、要冠以系统(xtng)(xtng)名称。限制性内切酶的系统名称。限制性内切酶的系统(xtng)(xtng)命名为命名为R R，甲基化酶为，甲基化酶为M M。如如 R.Hind R.Hind 表示限制性内切酶表示限制性内切酶 M.Hind M.Hind 表示相应表示相应(xingyng)(xingyng)的甲基化酶的甲基化酶实际应用中，实际应用中，R R常被省略。常被省略。第16页/共73页第十七页，共74页。 EcoR IEscherichia属名属名Coli种名种名Ry13株系株系编号编号(bin ho) 若种名头若种名头(mn tu)2(mn tu)2个字母相同则其中一个可用种名的第个字母

17、相同则其中一个可用种名的第一和第三个字母。一和第三个字母。第17页/共73页第十八页，共74页。 目前鉴定出四种不同类型的限制性内切酶目前鉴定出四种不同类型的限制性内切酶。据限制性核酸内切酶的识别。据限制性核酸内切酶的识别(shbi)(shbi)切割切割特性、催化条件及是否具有修饰酶活性，可特性、催化条件及是否具有修饰酶活性，可分为分为、型。型。 第18页/共73页第十九页，共74页。二、限制性内切酶的类型二、限制性内切酶的类型(lixng) 据限制性核酸内切酶的识别切割特性、催化条件及据限制性核酸内切酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰酶活性，可分为是否具有修饰酶活性，可分为、型。型。

18、主要特性主要特性型型型型型型限制修饰限制修饰 蛋白结构蛋白结构 辅助因子辅助因子 识别序列识别序列 切割位点切割位点双功能（具甲基化）双功能（具甲基化） 异源三聚体异源三聚体 ATP Mg2+ SAM 距识别序列距识别序列1kb处处 随机性切割随机性切割单一功能单一功能 同源二聚体同源二聚体 Mg2+ 4-6bp回文序列回文序列 识别序列内或附近识别序列内或附近特异切割特异切割双功能（具甲基化）双功能（具甲基化） 异源二聚体异源二聚体 ATP Mg2+ 距识别序列下游距识别序列下游24-26bp处处 随机性切割随机性切割基因工程(jyn gngchng)中使用注：注： SAM为为S腺苷甲硫氨酸

19、腺苷甲硫氨酸第19页/共73页第二十页，共74页。首先由首先由M.MeselsonM.Meselson和和R.YuanR.Yuan在在19681968年从大肠杆菌年从大肠杆菌(d chn n jn) B(d chn n jn) B株和株和 K K株分离的。株分离的。（1 1）识别）识别(shbi)(shbi)位点位点序列序列EcoB： TGA(N)8TGCT EcoK：AAC(N)6GTGC如如 EcoEcoB B和和 EcoEcoK K。未甲基化修饰的特异序列。未甲基化修饰的特异序列。N：表示任何一种核：表示任何一种核苷酸苷酸第20页/共73页第二十一页，共74页。需需ATP、Mg2+和和S

20、AM（S-腺苷甲硫氨酸）腺苷甲硫氨酸）（3）辅助因子辅助因子在距离特异性识别在距离特异性识别(shbi)位点约位点约10001500 bp处随机切开一条单链，不产生特异片断，应用不处随机切开一条单链，不产生特异片断，应用不大大Recognize sitecut1-1.5kb第21页/共73页第二十二页，共74页。 首先由首先由H.O. SmithH.O. Smith和和K.W. WilcoxK.W. Wilcox在在19701970年从流感年从流感嗜血菌中分离出来。嗜血菌中分离出来。 分离的第一个酶是分离的第一个酶是Hind Hind 未甲基化修饰的双链未甲基化修饰的双链DNADNA上的特殊靶

21、序列（多数上的特殊靶序列（多数(dush)(dush)是回文序列），与是回文序列），与DNADNA的来源无关。的来源无关。 A B C C B A A B C C B AA B N B AA B N B A 或或型限制性内切酶的基本型限制性内切酶的基本(jbn)(jbn)特性特性 （1 1）识别）识别(shbi)(shbi)位点位点序列序列第22页/共73页第二十三页，共74页。 识别位点处。 切开双链DNA。形成(xngchng)粘性末端（sticky end）或平齐末端（blunt end）。如： EcoR I 5-GAATTC-3 3-CTTAAG-5 Pst I 5-CTGCAG-3

22、3-GACGTC-5 产生粘性末端产生粘性末端 EcoR V 5-GATATC-3 3-CTATAG-5 产生平齐末端产生平齐末端 （2）切割）切割(qig)位位点点第23页/共73页第二十四页，共74页。A A G C T TT T C G A A A A G C T TT T C G A A ABCDDNADNAHindHind切割(qig)位点核酸(h sun)内切酶Hind对双链DNA分子的切割作用第24页/共73页第二十五页，共74页。 在完全肯定的位点切割在完全肯定的位点切割DNA(DNA(识别位点下游识别位点下游24-26bp)24-26bp)，但不，但不是是(b shi)(b

23、shi)对称的回文顺序，且在识别序列旁边一定数目核对称的回文顺序，且在识别序列旁边一定数目核苷酸的位置切割。苷酸的位置切割。 反应需要反应需要ATPATP、 Mg2+ Mg2+和和SAMSAM（S-S-腺苷蛋氨酸）。腺苷蛋氨酸）。 EcoP1: AGACC EcoP15: CAGCAG 在基因工程操作在基因工程操作(cozu)中用途不大。中用途不大。 型限制性内切酶的基本型限制性内切酶的基本(jbn)(jbn)特性特性 第25页/共73页第二十六页，共74页。 IV型限制性内切酶型限制性内切酶 新鉴定出来的一类限制新鉴定出来的一类限制(xinzh)酶。只切酶。只切割碱基已被甲基化、羟甲基化、葡

24、糖羟甲割碱基已被甲基化、羟甲基化、葡糖羟甲基化的基化的DNA序列。序列。 除除EcoKMcrBC外，识别外，识别(shbi)序列尚未确序列尚未确定，目前尚无应用。定，目前尚无应用。第26页/共73页第二十七页，共74页。核酸限制性内切酶的类型及主要核酸限制性内切酶的类型及主要(zhyo)特性特性特性特性I型内切酶型内切酶II型内切酶型内切酶III型内切酶型内切酶内切酶的内切酶的蛋白结构蛋白结构3种不同的亚基种不同的亚基单一成分单一成分2种不同的种不同的亚基亚基限制作用限制作用所需要的所需要的辅助因子辅助因子ATP、 Mg2+和和SAMMg2+ ATP、 Mg2+和和SAM寄主特异寄主特异性位点

25、识性位点识别序列别序列EcoB： TGA(N)8TGCT EcoK：AAC(N)6GTGC回文序列，回文序列，旋转对称旋转对称 （IIs型除外）型除外）EcoP1: AGACC EcoP15: CAGCAG第27页/共73页第二十八页，共74页。切割位点切割位点在距离识别位在距离识别位点至少点至少1000 bp外随机切外随机切开一条单链。开一条单链。位于寄主位于寄主特异性位特异性位点或其附点或其附近近识别位点识别位点3端端24-26bp处处甲基化作用的位甲基化作用的位点点寄主特异性位寄主特异性位点点寄主特异寄主特异性位点性位点寄主特异性寄主特异性位点位点识别未甲基化的识别未甲基化的序列进行切割

26、序列进行切割能能能能能能序列特异的切割序列特异的切割 不是不是是是不是不是基因工程中的用基因工程中的用途途无用无用十分有用十分有用用处不大用处不大第28页/共73页第二十九页，共74页。1 1、限制、限制- -修饰系统修饰系统2 2、限制性核酸内切酶的命名和类型、限制性核酸内切酶的命名和类型3 3、IIII型限制性核酸内切酶的基本特性型限制性核酸内切酶的基本特性4 4、影响、影响(yngxing)(yngxing)限制性内切酶活性的因素限制性内切酶活性的因素5 5、限制性内切酶对、限制性内切酶对DNADNA的消化作用的消化作用 第一节第一节 限制性核酸限制性核酸(h (h sun)sun)内切

27、酶内切酶第29页/共73页第三十页，共74页。识别识别(shbi)(shbi)序列序列 识别识别(shbi)(shbi)顺序的碱基数一般为顺序的碱基数一般为4-6 bp4-6 bp，少数识别，少数识别(shbi)(shbi)更长，多数识别更长，多数识别(shbi)(shbi)位点具有旋转对称性（位点具有旋转对称性（回文结构），少数的识别回文结构），少数的识别(shbi)(shbi)位点在切割位点之外，位点在切割位点之外，具旋转对称性。具旋转对称性。 4bp Hpa C CGG Hae GG CC 5bpAva G GWCC EcoR CCWGG 6bp BamHG GATTC SmaCCC G

28、GG11bp Bg1 GCCNNNN NGGC 12bp BstX CCANNNNN NTGC 第30页/共73页第三十一页，共74页。1 1、以某一对核苷酸为中轴，左右同数目的核苷酸彼此呈、以某一对核苷酸为中轴，左右同数目的核苷酸彼此呈碱基互补碱基互补(h b)(h b)。2 2、这两股、这两股DNADNA链若按同方向阅读（如链若按同方向阅读（如5 35 3），其核），其核苷酸顺序相同。苷酸顺序相同。 5GAA TTC3 3CTT AAG5特点特点(tdin)有二：有二：回文序列：反向重复序列，双链回文序列：反向重复序列，双链DNADNA中含有两个中含有两个(lin )(lin )结构相同，

29、方向相反结构相同，方向相反的序列的序列 5GTNAC3 3CANTG5第31页/共73页第三十二页，共74页。限制性核酸内切酶切割双链DNA，水解磷酸二酯键中3 位酯键产生两个末端，末端结构(jigu)是5-P和3-OH，产生3种不同的切口。 切割切割(qig)(qig)方式方式 第32页/共73页第三十三页，共74页。与与IIII型核酸内切酶有关型核酸内切酶有关(yugun)(yugun)的几个概的几个概念念粘性末端粘性末端(cohesive ends):(cohesive ends):因酶切位点在两条因酶切位点在两条DNADNA单单链上不同链上不同(b tn)(b tn)（对称）酶切后形成

30、（对称）酶切后形成的具有互补碱基的单链末端结构，酶切产的具有互补碱基的单链末端结构，酶切产生的两个粘性末端很容易通过互补碱基的生的两个粘性末端很容易通过互补碱基的配对而重新连接起来。配对而重新连接起来。平平 末末 端端(Blunt end): (Blunt end): 因酶切位点在两条因酶切位点在两条DNADNA单链单链上相同，酶切后形成的平齐的末端结构，上相同，酶切后形成的平齐的末端结构，这种末端不易重新连接起来。这种末端不易重新连接起来。第33页/共73页第三十四页，共74页。1. 51. 5突出突出(t (t ch)ch)的末端的末端EcoRI等产生的5粘性末端5G-C-T-G-A-A-

31、T-T-C-G-A-G 33C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C 5 EcoRI 37 5G-C-T-G-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G 33C-G-A-C-T-T-A-AP OH-G-C-T-C 5 退火 4-7 5G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G 33C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C 5第34页/共73页第三十五页，共74页。2. 32. 3突出突出(t (t ch)ch)的末端的末端PstI等产生的3粘性末端 5C-T-G-C-A-G 3 3G-A-C-G-T-C 5 PstI 37 5C-T-G-C-A-OH P-G 3 3G- P OH

32、 -A-C-G-T-C 5 退火 4-7 5C-T-G-C-A-G 3 3G-A-C-G-T-C 5第35页/共73页第三十六页，共74页。i i）不同）不同(b tn)(b tn)的的DNADNA双链双链：只要粘性末端只要粘性末端(m dun)(m dun)碱基互补就可以连碱基互补就可以连接。接。这比连接两个平齐末端这比连接两个平齐末端(m dun)(m dun)容易得多容易得多。粘性末端的意义粘性末端的意义 连接便利连接便利iiii）同一个同一个DNADNA分子内连接：分子内连接：通过两个相同的粘性末端可以连接成通过两个相同的粘性末端可以连接成环形分子环形分子。第36页/共73页第三十七页

33、，共74页。粘性粘性(zhn xn)(zhn xn)末端可以用末端可以用DNADNA聚合酶补平成聚合酶补平成平齐末端。平齐末端。 补平成平齐末端补平成平齐末端(m dun)(m dun)B 3B 3末端可以通过末端转移酶添加几个多聚核苷酸的尾末端可以通过末端转移酶添加几个多聚核苷酸的尾巴（如巴（如dAdA和和dTdT），即同聚物加尾造成人工），即同聚物加尾造成人工(rngng)(rngng)粘性粘性末端。末端。A A 5 5末端末端可用可用DNADNA多核苷酸激酶多核苷酸激酶进行进行3232P P标记。标记。 末端标记末端标记第37页/共73页第三十八页，共74页。3. 3. 平头平头(png

34、tu)(pngtu)末端末端PvuII等产生的平头末端 5G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G 3 3C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C 5 PvuII 37 5G-C-T-C-A-G-OH P-C-T-G-G-A-G 33C-G-A-G-T-C-P OH-G-A-C-C-T-C 5第38页/共73页第三十九页，共74页。平齐末端平齐末端(m (m dun)dun)的特点的特点 连接困难，连接效率低，只有粘性连接困难，连接效率低，只有粘性(zhn xn)(zhn xn)末端连末端连接效率的接效率的1%1%，这种连接常出现多联体连接。，这种连接常出现多联体连接。粘性末端与平

35、齐末端连接的处理粘性末端与平齐末端连接的处理(chl)(chl)方法方法）添补法：）添补法： 利用利用DNADNA聚合酶聚合酶 (klenow fragment）将碱基添将碱基添补到目的基因的粘性末端上。补到目的基因的粘性末端上。）削除）削除( (平平) )法法 利用利用S1S1和和BalBal3131等等核酸酶核酸酶将目的基因粘性末端的单将目的基因粘性末端的单链突出部分削去，使其成为平齐末端链突出部分削去，使其成为平齐末端第39页/共73页第四十页，共74页。不同来源的酶，识别相同的序列，切割不同来源的酶，识别相同的序列，切割(qig)(qig)方式相同方式相同或不同。或不同。识别识别(sh

36、bi)(shbi)位点和切点完全相同位点和切点完全相同 如如Hind Hind 和和Hsu IHsu I 同裂酶（同裂酶（Isoschizomer)Isoschizomer) 完全完全(wnqun)(wnqun)同裂酶：同裂酶：第40页/共73页第四十一页，共74页。Xma I 5-CCCGGG -3 3-GGGCCC-5Sma I 5-CCCGGG-3 3-GGGCCC-5识别位点相同识别位点相同(xin tn)(xin tn)，但切点，但切点不同。不同。如如Xma I Xma I 和和 Sma I Sma I。 不完全不完全(wnqun)(wnqun)同裂酶：同裂酶：第41页/共73页第四

37、十二页，共74页。识别的序列不同，但能切出相同的粘性识别的序列不同，但能切出相同的粘性(zhn xn)(zhn xn)末端末端。如。如BamH IBamH I、Bgl Bgl 、Bcl IBcl I、Xho Xho 等等 同尾酶同尾酶(Isocaudamers(Isocaudamers）第42页/共73页第四十三页，共74页。 Sau 3A同尾酶的粘性同尾酶的粘性(zhn xn)末端互相结合后形末端互相结合后形成的新位点一般不能再被原来的酶识别。成的新位点一般不能再被原来的酶识别。Sau 3A第43页/共73页第四十四页，共74页。1 1、限制、限制- -修饰系统修饰系统2 2、限制性核酸内切

38、酶的命名和类型、限制性核酸内切酶的命名和类型(lixng)(lixng)3 3、IIII型限制性核酸内切酶的基本特性型限制性核酸内切酶的基本特性4 4、影响限制性内切酶活性的因素、影响限制性内切酶活性的因素5 5、限制性内切酶对、限制性内切酶对DNADNA的消化作用的消化作用 第一节第一节 限制性核酸限制性核酸(h sun)(h sun)内切酶内切酶第44页/共73页第四十五页，共74页。1. 1. 标准酶解体系标准酶解体系(tx)(tx)的建立的建立 一个单位（一个单位（U U）的限制性内切酶定义）的限制性内切酶定义(dngy)(dngy)： 在合适的温度和缓冲液中，在在合适的温度和缓冲液中

39、，在20l20l的反应体系中，的反应体系中，1h1h完全酶解完全酶解1gDNA1gDNA所需要的酶量。所需要的酶量。推荐推荐(tujin)(tujin)：稍过量的酶（：稍过量的酶（2-52-5倍）和较长的反应时倍）和较长的反应时间间 限制性核酸内切酶的反应条件限制性核酸内切酶的反应条件 第45页/共73页第四十六页，共74页。定定第46页/共73页第四十七页，共74页。一般一般(ybn)20l(ybn)20l，保证酶液体积不超过反应总，保证酶液体积不超过反应总体积的体积的10%10%前提下，尽量降低反应总体积。前提下，尽量降低反应总体积。加样顺序加样顺序(shnx)(shnx)一般是：一般是：

40、ddHddH2 2O buffer DNA O buffer DNA 酶酶 第47页/共73页第四十八页，共74页。大部分大部分II 型核酸内切酶需要相似型核酸内切酶需要相似(xin s)的反应条件：的反应条件：Tris-HCl50 mM pH 7.5MgCl210 mMNaCl0 - 150 mMDTT1 mM0 - 50 mM 低盐酶低盐酶100 mM 中盐酶中盐酶150 mM 高盐酶高盐酶Volume20 - 100 mlTime Temp37 1 - 1.5 hr第48页/共73页第四十九页，共74页。移液枪吹打或手指移液枪吹打或手指(shuzh)(shuzh)轻弹管壁轻弹管壁若底物若

41、底物(d w)(d w)分子很大（如基因分子很大（如基因组组DNADNA），应避免强烈振荡。），应避免强烈振荡。混匀后微量高速离心机进行短混匀后微量高速离心机进行短暂离心，使管壁液体暂离心，使管壁液体(yt)(yt)全部下沉全部下沉。第49页/共73页第五十页，共74页。三种三种(sn zhn)(sn zhn)方法：方法：）加乙二胺四乙酸（）加乙二胺四乙酸（EDTAEDTA）至终浓度）至终浓度(nngd)(nngd) 10mmol/L; 10mmol/L; 加十二烷基硫酸钠（加十二烷基硫酸钠（SDSSDS） 至终浓度至终浓度(nngd)0.1%(W/V)(nngd)0.1%(W/V)）6565

42、加热加热20min20min或者或者7070加热加热10min10min）酚）酚/ /氯仿氯仿抽提抽提第50页/共73页第五十一页，共74页。快速进行微型琼脂糖凝胶电泳快速进行微型琼脂糖凝胶电泳观察观察然后然后(rnhu)(rnhu)决定是否终止反应决定是否终止反应第51页/共73页第五十二页，共74页。第52页/共73页第五十三页，共74页。限制性核酸内切酶的反应条件限制性核酸内切酶的反应条件 完全消化：内切酶在完全消化：内切酶在DNA上的所有识别位点都被切开。上的所有识别位点都被切开。 局部消化：只有有限数量的酶切位点被切开。局部消化：只有有限数量的酶切位点被切开。 通过通过(tnggu)

43、缩短保温时间、降低反应温度或减少缩短保温时间、降低反应温度或减少酶的用量可达到局部消化的目的。酶的用量可达到局部消化的目的。 第53页/共73页第五十四页，共74页。电泳电泳(din yn)(din yn)后电泳后电泳(din yn)(din yn)条带扩散，电条带扩散，电泳泳(din yn)(din yn)条带移动距离异常条带移动距离异常 底物底物DNADNA不纯；不纯；内切酶不纯；内切酶不纯；酶蛋白自身或其它杂蛋白与酶蛋白自身或其它杂蛋白与DNADNA结合在一起使电泳条结合在一起使电泳条带移动距离异常带移动距离异常第54页/共73页第五十五页，共74页。 DNA中的杂质如蛋白质、多糖、苯酚

44、、氯仿、乙中的杂质如蛋白质、多糖、苯酚、氯仿、乙醇醇(y chn)、SDS、EDTA、NaCl等都会影响酶的活等都会影响酶的活性。性。 1. DNA的纯度的纯度(chnd) 一一般般(ybn)采采取取 纯化纯化DNA 加大酶的用量加大酶的用量 （510U酶酶/ g DNA ） 延长保温时间延长保温时间 （34h） 扩大反应体积，使潜在的抑制因素被稀释（扩大反应体积，使潜在的抑制因素被稀释（ 20 l） 加入亚精胺提高消化作用，需要适当的温度加入亚精胺提高消化作用，需要适当的温度 影响限制性内切酶活性的因素影响限制性内切酶活性的因素 第55页/共73页第五十六页，共74页。2. DNA2. DN

45、A的甲基化程度的甲基化程度(chngd) (chngd) 大肠杆菌大肠杆菌(d chn n jn)一般有两种甲一般有两种甲基化酶修饰质粒：基化酶修饰质粒：damdam甲基化酶（修饰甲基化酶（修饰(xish)GATC(xish)GATC中的中的A A）；）； dcmdcm甲基化酶（修饰甲基化酶（修饰(xish)CCA/TGG(xish)CCA/TGG的的C C）。）。 基因工程中必须使用甲基化酶基因工程中必须使用甲基化酶失活突变的菌株。失活突变的菌株。第56页/共73页第五十七页，共74页。 不同不同(b tn)的限制性内切酶的最适反应温度不同的限制性内切酶的最适反应温度不同(b tn)。大多数

46、是。大多数是37 ，少数例外。，少数例外。3. 3. 温度温度(wnd) (wnd) 第57页/共73页第五十八页，共74页。 酶切超螺旋酶切超螺旋DNA分子分子(fnz)，所需酶量多于线，所需酶量多于线性性DNA分子分子(fnz)；最高可达；最高可达20倍；倍；4. DNA分子分子(fnz)的的构型构型 对同一对同一DNA分子上不同位置的识别分子上不同位置的识别(shbi)序列，切割效率具有位点偏爱性；序列，切割效率具有位点偏爱性； 识别序列的侧面序列影响酶切效率。识别序列的侧面序列影响酶切效率。 “保保 护护 碱碱 基基”第58页/共73页第五十九页，共74页。是影响限制是影响限制(xin

47、zh)酶活性的重要酶活性的重要因素。因素。5. 5. 缓冲液缓冲液(Buffer) (Buffer) 缓冲液的化学缓冲液的化学(huxu)组成：组成：10XbufferMgCl2MgCl2、NaCl/KClNaCl/KCl： 提供提供Mg2+Mg2+和离子强度；和离子强度； Tris-HClTris-HCl： 维持维持(wich)pH(wich)pH； 二硫苏糖醇（二硫苏糖醇（DTTDTT）：）： 防止酶的氧化，保持酶稳定性；防止酶的氧化，保持酶稳定性； 牛血清白蛋白牛血清白蛋白BSABSA等：等： 提高溶液中蛋白质的浓度，防止酶失活提高溶液中蛋白质的浓度，防止酶失活 ；商品化的限制酶一般都带

48、有专用缓冲液。商品化的限制酶一般都带有专用缓冲液。第59页/共73页第六十页，共74页。高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度(qingd)、极端、极端pH值等，会使一些核酸内切酶的识别和切割序列值等，会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性，即所谓的发生低特异性，即所谓的“星活性星活性” （star activity）现象。现象。 EcoRI*代表代表EcoRI的星号活力。的星号活力。 星活性的特点星活性的特点: 限制酶识别序列特异性降低限制酶识别序列特异性降低 商品化的限制商品化的限制(xinzh)酶一般都带有专用缓冲液。酶一般都带有专用缓冲液。 第

49、60页/共73页第六十一页，共74页。EcoR I 和和BamH I 等都有等都有*活性。活性。EcoR I *在低盐、高在低盐、高pH（8）时可识别）时可识别(shbi)和切和切割割GAATTA、AAATTC、GAGTTC等等GAATTCEcoR I：使用的时候使用的时候(sh hou)要特别注意！要特别注意！第61页/共73页第六十二页，共74页。概括概括(giku)(giku)起来，诱发星活性的因素有如下几种起来，诱发星活性的因素有如下几种：（1 1）高甘油含量（）高甘油含量（55, v, vv v）；）；（2 2）限制性内切核酸酶用量过高（）限制性内切核酸酶用量过高（100U100Uu

50、gDNAugDNA）；）；（3 3）低离子浓度（）低离子浓度（25 mmol25 mmolL L）；）；（4 4）高）高pHpH（8.08.0以上）；以上）；（5 5）含有机溶剂，如）含有机溶剂，如DMSODMSO（二甲基亚砜（二甲基亚砜 ），乙醇），乙醇等；等；（6 6）有非）有非Mg2+Mg2+的二价阳离子存在（如的二价阳离子存在（如Mn2+Mn2+，Cu2+Cu2+，Co2+Co2+，Zn2+Zn2+等）。等）。第62页/共73页第六十三页，共74页。 但在实际应用中，一般要用稍过量的酶（但在实际应用中，一般要用稍过量的酶（1g1g加加25U25U酶）反应较长的时间，才能达到完全酶）反应

51、较长的时间，才能达到完全(wnqun)(wnqun)酶酶解。但是不能过分加大酶的用量解。但是不能过分加大酶的用量酶过量对酶切反应的影响：酶过量对酶切反应的影响：1 1）酶过量（一般为）酶过量（一般为100U/gDNA100U/gDNA）会影响识别序列）会影响识别序列(xli)(xli)的正确性，如：的正确性，如：BamHI BamHI 的正常识别序列的正常识别序列(xli): GGATTC (xli): GGATTC ；酶过量识别序列；酶过量识别序列(xli) NGATCN(xli) NGATCN2 2）酶制剂含甘油成分，酶过量，会因为甘油量大而影响其）酶制剂含甘油成分，酶过量，会因为甘油量大而影响其识别的专一性，诱发星号活力。识别的专一性，诱发星号活力。6. 酶对消化酶对消化(xiohu)效率的影效率的影响响1U1U核酸内切酶的酶活性：在最佳反应条件下核酸内切酶的酶活性：在最佳反应条件下1h1h，完全水解，完全水解1gDNA1gDNA所需的酶量所需的酶量第63页/共73页第六十四页，共74页。1 1、限制、限制- -修饰系统修饰系统2 2、限制性核酸内切酶的命名和类型、限制性核酸内切酶的命名和类型3 3、IIII型限制性核酸内切酶的基本特性型限制性核酸内切酶的基本特性4 4、影响限制性内切酶活性的因素、影响限制