土壤中分解尿素的细菌分离和计数学习教案

1、会计学1土壤中分解尿素的细菌土壤中分解尿素的细菌(xjn)分离和计数分离和计数第一页，共26页。细菌脲酶细菌脲酶尿素尿素CO(NH2)2CO(NH2)2重要重要(zhngyo)(zhngyo)的农业氮的农业氮肥。肥。只能被土壤中细菌分解为只能被土壤中细菌分解为NH3NH3才能被植物才能被植物(zhw)(zhw)吸吸收利用收利用 CO(NH2)2 + H2O CO2 +2NH3 CO(NH2)2 + H2O CO2 +2NH3课题背景课题背景第1页/共25页第二页，共26页。课题课题(kt)目的目的土壤(trng)中尿素分解菌的分离与计数从土壤中分离出能够(nnggu)分解尿素的细菌统计每克土样

2、中究竟含有多少这样的细菌第2页/共25页第三页，共26页。思考：思考：PCRPCR技术要求使用耐高温的技术要求使用耐高温的DNADNA聚合酶，这种聚合酶，这种酶要能忍受酶要能忍受93 93 左右的高温。如果请你来寻找左右的高温。如果请你来寻找(xnzho)(xnzho)这种耐高温的酶，你会去哪里寻找这种耐高温的酶，你会去哪里寻找(xnzho)(xnzho)？( () )A A土壤中土壤中 B B海水中海水中C C热泉中热泉中 D D冷库中冷库中C C如何寻找耐高温如何寻找耐高温(gown)(gown)的酶？的酶？ 寻找高温寻找高温(gown)(gown)环境；环境；原理：热泉原理：热泉70-8

3、070-80的高温的高温(gown)(gown)条件淘汰了绝条件淘汰了绝大多数的微生物，使得耐热的大多数的微生物，使得耐热的TaqTaq细菌脱颖而出。细菌脱颖而出。选出耐高温选出耐高温(gown)(gown)细菌后，从耐高温细菌后，从耐高温(gown)(gown)菌菌种中提取耐高温种中提取耐高温(gown)(gown)酶。酶。第3页/共25页第四页，共26页。1 1、自然界中目的、自然界中目的(md)(md)菌株的刷选原理：菌株的刷选原理：一、筛选一、筛选(shixun)(shixun)菌株菌株2 2、实验室中筛选、实验室中筛选(shixun)(shixun)微生物的原理：微生物的原理：（纯且

4、活的菌种纯且活的菌种）在寻找目的菌株时，要根据它对在寻找目的菌株时，要根据它对生存环境生存环境的要求，的要求，到相应的环境中去找。到相应的环境中去找。人为提供人为提供有利于目的菌株生长的条件有利于目的菌株生长的条件( (包括营养、包括营养、温度、温度、pHpH等等) )，同时，同时抑制或阻止抑制或阻止其他微生物生长。其他微生物生长。第4页/共25页第五页，共26页。 KH2PO4 1.4g KH2PO4 1.4g NaHPO4 2.1g NaHPO4 2.1g MgSO4 H2O 0.2g MgSO4 H2O 0.2g 葡萄糖葡萄糖 10.0g 10.0g 尿素尿素 1.0g 1.0g 琼脂琼

5、脂 15.0g 15.0g 将上述物质将上述物质(wzh)(wzh)溶解溶解后，用蒸馏水定容到后，用蒸馏水定容到1000mL1000mL。 该培养基的配方中，为该培养基的配方中，为微生物的生长提供碳源和微生物的生长提供碳源和氮源的分别是什么物质？氮源的分别是什么物质？ 此配方能否筛选此配方能否筛选(shixun)出分解尿素的出分解尿素的细菌？为什么？细菌？为什么？碳源：葡萄糖、尿素碳源：葡萄糖、尿素(nio s)氮源：氮源：尿素尿素能。只有产生脲酶的细菌能利能。只有产生脲酶的细菌能利用尿素作为氮源而生存。用尿素作为氮源而生存。第5页/共25页第六页，共26页。3 3、方法、方法(fngf)(f

6、ngf)：利用选择利用选择(xunz)(xunz)培养基分离培养基分离选择选择(xunz)(xunz)培养基：培养基：允许允许特定种类特定种类的微生物生长，同时的微生物生长，同时抑制或阻止抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。其他种类微生物生长的培养基。(1)(1)在培养基中在培养基中加入某种化学物质加入某种化学物质。利用选择培养基分离微生物的方法：利用选择培养基分离微生物的方法：例如，加入例如，加入青霉素青霉素可以分离出可以分离出 ； 加入加入高浓度的食盐高浓度的食盐可以得到可以得到 。 酵母菌和霉菌酵母菌和霉菌金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌这里的加入是在培养成分的基础上加入这里的加入是在培养

7、成分的基础上加入。第6页/共25页第七页，共26页。(2)(2)改变改变(gibin)(gibin)培养基中的营养成分。培养基中的营养成分。例如，缺乏氮源时可以分离例如，缺乏氮源时可以分离 ； 尿素作为尿素作为(zuwi)(zuwi)唯一氮源时，可以分离出唯一氮源时，可以分离出 石油作为石油作为(zuwi)(zuwi)唯一碳源时，可以分离出唯一碳源时，可以分离出 固氮固氮( dn)( dn)微生物微生物能消除石油污染的微生物能消除石油污染的微生物能分解尿素的细菌能分解尿素的细菌(3)(3)改变改变微生物的微生物的培养条件培养条件。例如，将培养基放在例如，将培养基放在高温环境高温环境中培养可以得

8、到中培养可以得到耐高温的微生物耐高温的微生物第7页/共25页第八页，共26页。本课题本课题(kt)使用的培养基的配方如下：使用的培养基的配方如下：成分成分KH2PO4Na2HPO4MgSO4 7H2O葡萄糖葡萄糖 尿素尿素琼脂琼脂水水含量含量1.4 g2.1 g0.2 g10.0 g1.0 g 15.0 g 1000 mL请分析后回答：请分析后回答： (1) (1)在该培养基的配方中，为微生物的生长提供碳源和氮源在该培养基的配方中，为微生物的生长提供碳源和氮源的分别是的分别是_和和_。 (2) (2)该培养基为该培养基为_培养基培养基( (按物理状态分按物理状态分) )，理由，理由是是_。 (

9、3) (3)想一想这种培养基对微生物是否具有选择作用？如果具想一想这种培养基对微生物是否具有选择作用？如果具有，又是如何有，又是如何(rh)(rh)进行选择的？进行选择的？_ _ _。葡萄糖葡萄糖尿素尿素(nio s)固体固体有凝固剂琼脂有凝固剂琼脂有选择作用。此配方中尿素是唯一氮源，因此，只有有选择作用。此配方中尿素是唯一氮源，因此，只有能能够利用尿素的微生物才能够生长够利用尿素的微生物才能够生长第8页/共25页第九页，共26页。二、统计菌落二、统计菌落(jnlu)(jnlu)数目数目1 1、方法、方法(fngf)(fngf)：常用稀释涂布平板法统计常用稀释涂布平板法统计(tngj)(tng

10、j)活菌的数目活菌的数目原理：原理：当样品的当样品的 时，培养基表面生长时，培养基表面生长的的一个菌落一个菌落来源于样品稀释液中的来源于样品稀释液中的 。为了保证结果准确，一般选择菌落数在为了保证结果准确，一般选择菌落数在 统计统计通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少的活菌。中大约含有多少的活菌。要求：要求：3030 300 300 个菌落的平板个菌落的平板稀释度足够高稀释度足够高一个活菌一个活菌第9页/共25页第十页，共26页。 例：两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品例：两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。从对应稀释

11、倍数为中的细菌数。从对应稀释倍数为106106的培养基中，得到以下的培养基中，得到以下两种统计结果。两种统计结果。 1 1、甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落、甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落(jnlu)(jnlu)数为数为230230。 2 2、乙同学在该浓度下涂布了、乙同学在该浓度下涂布了A A、B B、C C三个平板，统计的三个平板，统计的菌落菌落(jnlu)(jnlu)数分别为数分别为2121、212212、256256，该同学以这三个平板，该同学以这三个平板上菌落上菌落(jnlu)(jnlu)数的平均值数的平均值163163作为统计结果。作为统计结果。 你认为这两位

12、同学的作法正确吗？如果有问题，错在你认为这两位同学的作法正确吗？如果有问题，错在哪？哪？ 甲：没有重复实验（至少涂布甲：没有重复实验（至少涂布3 3个平板个平板(pngbn)(pngbn)） 乙：乙：A A组结果误差过大，不应用于计算平均值组结果误差过大，不应用于计算平均值第10页/共25页第十一页，共26页。 用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数，在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下几种统计(tngj)结果，正确的是()A涂布了一个平板，统计(tngj)的菌落数是230B涂布了两个平板，统计(tngj)的菌落数是215和260，取平均值238C涂布了三个平板，统计(tngj)的菌

13、落数分别是21、212和256，取平均值163D涂布了三个平板，统计(tngj)的菌落数分别是210、240和250，取平均值233第11页/共25页第十二页，共26页。因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察观察(gunch)(gunch)到的只是一个菌落。到的只是一个菌落。因此统计结果一般用菌落数表示。因此统计结果一般用菌落数表示。= =（平均菌落（平均菌落(jnlu)(jnlu)数涂布的稀释液体积）稀释倍数数涂布的稀释液体积）稀释倍数 。缺点缺点(qudin)(qudin)：操作复杂，实验结果有一定的误差。操作复杂，实验结果有一定的误差。 统计的菌

14、落数往往比活菌的实际数目低统计的菌落数往往比活菌的实际数目低 每克样品中的菌株数每克样品中的菌株数= =（C/V)X MC/V)X MC:C:某一稀释度下平板上生长的平均菌落数；某一稀释度下平板上生长的平均菌落数；V:V:所用稀释液的体积；所用稀释液的体积；M:M:稀释倍数。稀释倍数。计算计算公式：公式：第12页/共25页第十三页，共26页。显微镜直接显微镜直接(zhji)(zhji)计数计数 优点优点(yudin)(yudin)：缺点：缺点：计数计数(j sh)(j sh)方便，操作简单方便，操作简单死菌、活菌都计算在内，死菌、活菌都计算在内，统计结果比实际值偏大统计结果比实际值偏大（统计菌

15、株数目）（统计菌株数目）第13页/共25页第十四页，共26页。1 、产生标准形态菌落的细菌的最初数目和培养基分别是（、产生标准形态菌落的细菌的最初数目和培养基分别是（ ）A 一个细菌、液体培养基一个细菌、液体培养基 B 许多细菌、液体培养基许多细菌、液体培养基C 一个细菌、固体培养基一个细菌、固体培养基 D 许多细菌、固体培养基许多细菌、固体培养基2、某同学在稀释倍数为、某同学在稀释倍数为106 的培养基上测得平板上的菌落数的培养基上测得平板上的菌落数的平均值为的平均值为215，那么每毫升样品中菌落数是（涂布平板时所用，那么每毫升样品中菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为稀释液的体积为0.1

16、ml）A 2.15108 B 2.15109 C 215 D 21.5 3、下列有关检测、下列有关检测(jin c)土壤中细菌总数实验操作的叙述中，土壤中细菌总数实验操作的叙述中，不正确的是（不正确的是（ ）A 用蒸馏水配制牛肉膏蛋白胨，高温、高压灭菌后道平板用蒸馏水配制牛肉膏蛋白胨，高温、高压灭菌后道平板B 取取104、105、106 倍土壤稀释液和无菌水各倍土壤稀释液和无菌水各0.1ml涂布不同平板涂布不同平板C 将实验组和对照组平板倒置，将实验组和对照组平板倒置，37恒温培养恒温培养24h-48hD 确定对照组无菌后，选择菌落数在确定对照组无菌后，选择菌落数在300以上的平板进行计数。以

17、上的平板进行计数。CBD第14页/共25页第十五页，共26页。 利用选择培养基进行尿素分解菌的分离过利用选择培养基进行尿素分解菌的分离过程中，从对应稀释倍数为程中，从对应稀释倍数为106106的培养基中，的培养基中，A A、B B两同学分别两同学分别(fnbi)(fnbi)得到以下两种统计结果。得到以下两种统计结果。 1 1、A A同学筛选出同学筛选出150150个菌落。个菌落。 2 2、B B同学筛选出同学筛选出5050个菌落。个菌落。 B B认为认为A A的培养基被杂菌污染了，或培养基的培养基被杂菌污染了，或培养基中混入了其他含氮物质，因而导致不能分解尿中混入了其他含氮物质，因而导致不能分

18、解尿素的细菌也能在该培养基中生长。素的细菌也能在该培养基中生长。A A确认自己的确认自己的操作无误，但也拿不出能令人信服的证据。操作无误，但也拿不出能令人信服的证据。 请你帮助请你帮助A A同学改进实验，提供具有说明了同学改进实验，提供具有说明了的证据。的证据。方案方案1 1：其他同学：其他同学(tng xu)(tng xu)用用A A同学同学(tng xu)(tng xu)的土样进行实验。的土样进行实验。 方案方案2 2：A A同学同学(tng xu)(tng xu)以不接种的培养基作为空白对照。以不接种的培养基作为空白对照。第15页/共25页第十六页，共26页。2 2、增加、增加(zngj

19、i)(zngji)实验说服力的措施：实验说服力的措施：排除实验组中非测试排除实验组中非测试(csh)(csh)因素对实验结果因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。的影响，提高实验结果的可信度。设置设置(shzh)(shzh)重复：重复：排除排除偶然因素偶然因素对实验结果的影响。对实验结果的影响。在培养过程中在培养过程中同一稀释度下同一稀释度下应应涂布涂布至少至少3个平板个平板，才能增强说服力和准确性，才能增强说服力和准确性设置对照：设置对照：若对照的培养皿中无菌落生长，说明若对照的培养皿中无菌落生长，说明：方法：方法：方法：方法：观察培养物中是否有杂菌污染观察培养物中是否有杂菌污染如如空

20、白对照组空白对照组培养基未被杂菌感染培养基未被杂菌感染培养基混入其他杂菌培养基混入其他杂菌若实验的培养基菌落数偏高或者菌落形态多样，说明：若实验的培养基菌落数偏高或者菌落形态多样，说明：第16页/共25页第十七页，共26页。若牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落若牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落(jnlu)数大于选择培养基数大于选择培养基上的数目，说明：上的数目，说明：观察选择培养观察选择培养(piyng)物是否具有物是否具有选择作用选择作用如完全如完全(wnqun)培养基对照组培养基对照组选择培养基具有筛选作用选择培养基具有筛选作用第17页/共25页第十八页，共26页。距地表距地表(dbio)(dbio)约

21、约3 3 8cm8cm土土壤层壤层菌落计数菌落计数配制土壤溶配制土壤溶液液系列稀释系列稀释涂布平板与涂布平板与培养培养三、实验设计三、实验设计1 1、实验、实验(shyn)(shyn)流程：流程：2 2、操作、操作(cozu)(cozu)流程：流程：（1 1）土壤取样）土壤取样 取样原因：取样原因：土壤要求：土壤要求：取样部位：取样部位：土壤土壤“微生物的天然培养基微生物的天然培养基”，含有大量，含有大量的微生物，数量最大，种类最多。的微生物，数量最大，种类最多。富含富含有机质有机质，pHpH接近接近中性中性且且潮湿潮湿。第18页/共25页第十九页，共26页。测细菌测细菌(xjn)(xjn)数

22、数：测放线菌：测放线菌：测真菌数：测真菌数：（2 2）样品）样品(yngpn)(yngpn)稀释稀释 稀释原因稀释原因(yunyn)(yunyn)：稀释标准：稀释标准：稀释倍数：稀释倍数：样品的稀释程度样品的稀释程度直接影响平板上生长的直接影响平板上生长的菌落数目菌落数目选用一定稀释范围的样品液进行培养选用一定稀释范围的样品液进行培养，保证获得，保证获得菌落数在菌落数在30-30030-300之间之间，便于计数，便于计数。一般用一般用10104 4、10105 5、10106 6稀释液稀释液一般用一般用10103 3、10104 4、10105 5稀释液稀释液一般用一般用10102 2、101

23、03 3、10104 4稀释液稀释液思考：为什么分离不同的微生物要用不同的稀释度？思考：为什么分离不同的微生物要用不同的稀释度？土壤中各类微生物的数量不同土壤中各类微生物的数量不同如果是第一次做这个实验，稀释倍数的范围如果是第一次做这个实验，稀释倍数的范围可以放宽可以放宽103-107.第19页/共25页第二十页，共26页。1 、关于土壤取样的叙述，错误的是（、关于土壤取样的叙述，错误的是（ ）A 土壤取样，应选取肥沃、湿润的土壤土壤取样，应选取肥沃、湿润的土壤 B 先铲去表层土先铲去表层土3-8cm左右，再取样左右，再取样C 取样用的小铁铲和信封在使用前不用灭菌取样用的小铁铲和信封在使用前不

24、用灭菌D 应在火焰旁称取土壤应在火焰旁称取土壤2、下列关于、下列关于“土壤中分解土壤中分解(fnji)尿素的细菌的分离尿素的细菌的分离”实验步骤排列实验步骤排列正确的是正确的是土壤取样土壤取样称取称取10g土壤加入盛有土壤加入盛有90ml无菌水的锥形瓶中无菌水的锥形瓶中吸取吸取0.1ml进行平板涂布进行平板涂布依次稀释至依次稀释至101、102、103、104、105、106、107 稀释度稀释度A B C D CC第20页/共25页第二十一页，共26页。第21页/共25页第二十二页，共26页。（四）鉴定：筛选后必鉴定（四）鉴定：筛选后必鉴定鉴别培养基：不影响微生物的生存鉴别培养基：不影响微生

25、物的生存酚红培养基：鉴定分解酚红培养基：鉴定分解(fnji)(fnji)尿尿素的细菌。素的细菌。原理：脲酶催化尿素分解原理：脲酶催化尿素分解(fnji)(fnji)成氨成氨培养基碱性增强培养基碱性增强 酚红变红酚红变红第22页/共25页第二十三页，共26页。为了调查某河流的水质状况，某研究小组测定了该河流水为了调查某河流的水质状况，某研究小组测定了该河流水样中的细菌含量，并进行了细菌分离等工作。回答下列问样中的细菌含量，并进行了细菌分离等工作。回答下列问题：题：(1)该小组采用稀释涂布平板法检测水样中细菌含量。在涂该小组采用稀释涂布平板法检测水样中细菌含量。在涂布接种前，随机取若干布接种前，随机取若干(rugn)灭菌后的空白平板先行培灭菌后的空白平板先行培养了一段时间，这样做的目的是养了一段