三种土壤微生物总DNA提取方法的比较

1、基因组学与应用生物学，2009年，第28卷，第2期，第331-334页GenomicsandAppliedBiology,2009,Vol.28,No.2,331-334实验技术与方法TechniquesandMethodology三种土壤微生物总DNA提取方法的比较王丽娜1,2许修宏1宛煜嵩2金芜军2*1东北农业大学生命科学学院,哈尔滨,150030;2中国农业科学院生物技术研究所,北京,100081*通讯作者,jinwujun1218摘要本文对3种常用的土壤微生物总DNA提取方法Martin法、高盐改进法及试剂盒法进行了比较，并通纯度及16SrDNAV3可变区的PCR扩增结合DGGE法(d

2、enaturinggradientgelelectrophoresis)，过DNA得率、分别对3种方法进行评价。结果表明，3种方法提取的DNA均能满足土壤微生物多样性分析的要求。其中试但DNA得率较低且成本昂贵。Martin法和高盐改进法用时较剂盒方法操作简单，提取的DNA质量较高，长，DNA得率较高，纯度较低，但对后续PCR扩增和DGGE分析没有明显影响，且成本低廉。关键词土壤微生物,DNA提取,DGGEComparisonofthreeExtractionMethodsofSoilMicrobialDNAWangLina1,2XuXiuhong1WanYusong2JinWujun2*1L

3、ifeSciencesInstitute,NortheastAgriculturalUniversity,Harbin,150030;2BiotechnologyResearchInstitute,ChineseAcademyofAgriculturalSci-ences,Beijing,100081*Correspondingauthor,jinwujun1218DOI：10.3969/gab.028.000331AbstractThreecommonlyusedmethodsforsoilmicrobialDNAextractionincludingMartinmethod,improve

4、dhigh-saltconcentrationmethodandthekitmethodwereassessedinthispaper.TheevaluationwasbasedontheyieldandpurityofextractedtotalDNA,theamplificationof16SrDNAV3variableregionandthesubsequentanalysisofamplifiedproductsbyDGGE(denaturinggradientgelelectrophoresis).TheresultsshowedthateachofthreemethodsofDNA

5、extractioncouldmeettherequirementsofanalysisofsoilmicrobialdiversity.Thekitmethodissimple,thequalityofextractedDNAishigher,buttheyieldofDNAislowerandthecostismoreex-pensive.Martinmethodandimprovedhigh-saltconcentrationmethodbothgothigheryieldsofDNAwithlowercostthanthekitmethodbutspentlongertime.Thep

6、urityofDNAwerelowerthanoneextractedbythekitmethod,butitwouldnotaffectthefollowingPCRandDGGEanalysissignificantly.KeywordsSoilmicroorganisms,DNAextraction,DGGE土壤微生物是陆地生态系统中重要的生命体，过提取土壤中微生物总DNA，并对特定DNA序列对所生存的微坏境十分敏感，是常用的土壤生态系统变化的预警及敏感指标。近些年发展起来的分子生物学技术如PCR-DGGE、ARDRA、RFLP等运用到土壤微生物生态学的研究，可避开传统的微生物分离培养过

7、程，直接探讨土壤中微生物的多样性变化及其与环境的关系，克服因土壤微生物可培养性的差异引起的分析偏差。这些分子生物学方法主要通/doi/10.3969/gab.028.000331基金项目：本研究由农业部948课题(2007-Z8)资助通过分析扩增产物的多如16SrDNA基因进行扩增，样性来推断微生物群落的多样性。由于土壤中腐殖酸、重金属离子等物质的存在，往往会造成提取的DNA数量和质量不能满足要求，影响后续的PCR扩增、分子杂交等而导致多样性分析失败。本实验对3种直接提取土壤微生物总DNA的方法进行了比较，旨在为相关的研究提供一些参考。332基因组学与应

8、用生物学GenomicsandAppliedBiology1材料与方法1.1材料试验土壤取自中国农业科学院试验田内的棕壤土。土壤充分混匀后装入花盆中，种植水稻，在水稻出穗期抖落其根际土壤作为实验材料。16SrDNAV3可变区细菌特异性引物为对大多数细菌与古细菌16SrDNAV3区具有特异性的通用引物(Muyzeretal.,1993)：正向引物：357(5-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3)；反向引物：518(5-ATTACCGCGGCTGCTGG-3)。其中F357中下划线部分为“GC夹板”结构。引物由上海

9、生物技术服务有限公司合成，引物扩增产物片段长度约为230bp。1.2试剂盒法提取土壤DNA采用美国Mobile公司的UltraCleansoilDNAisolationKit。每次提取的土壤样品量为0.3g。1.3Martin法提取土壤DNA按照Martin-Laurent等(2001)报道的方法进行适当改进。取0.5g土样加入一离心管，加入1g酸洗石英砂(直径0.51mm)，再加入3mLDNA提取液(100mmol/LTris,100mmol/LEDTA,100mmol/LNaCl,1%pvp,2%SDS,pH8.0)，涡旋混匀后，在摇床上250r/min振荡2h。412000伊g离心10m

10、in。取上清，加入等体积苯酚:氯仿:异戊醇混匀。412000伊g离心10min，取上清。加入等体积氯仿:异戊醇抽提1次。412000伊g离心10min。水相中加入1/10体积3mol/L乙酸钠和1体积冰预冷的异丙醇，4沉淀DNA1h。12000伊g离心10min收集DNA沉淀，用100滋LddH2O溶解，得到DNA粗提液。DNA粗提液用ddH2O稀释100倍用于PCR扩增。1.4高盐改进法提取土壤DNA按照张瑞福等(2003)报道的方法进行适当改进。称取1g土壤样品，加入3mLDNA提取液(100mmol/LTris-HCl,100mmol/LEDTA,100mmol/LNa3PO4,1.5m

11、ol/LNaCl,1%CTAB,pH8.0)混匀，再加入20滋L蛋白酶K(10mg/mL)，37温浴30min，中间混匀数次。加入0.3mL20%SDS，65水浴2h，每隔1520min颠倒混匀一次。-70冷冻，然后65溶化，反复3次，每次10min。室温12000伊g离心10min，收集上清于一新10mL离心管。沉淀再加入1mLDNA提取液和0.1mL20%SDS，旋涡10s，65水浴10min，室温12000伊g离心10min，合并上清液。重复上一步DOI：10.3969/gab.028.000331骤合并上清液。加入等体积氯仿:异戊醇(24:1,v

12、/v)混匀。12000伊g离心10min，上清转移至一新10mL离心管，加入0.6v/v异丙醇，室温沉淀1h。12000伊g离心20min，去上清。加入70%预冷乙醇洗涤，沉淀用100滋L无菌去离子水重悬，得到DNA粗提液。DNA粗提液用ddH2O稀释100倍后用于PCR扩增。1.5DNA浓度与纯度检测用紫外分光光度计测定3种提取方法所得的粗提产物在230nm、260nm、280nm的光密度值。通过计算OD260/OD280(DNA/蛋白质)来测定所提DNA的纯度。230nm处光密度值指示DNA溶液中腐殖酸的含量。1.616SrDNAV3可变区的扩增PCR扩增体系：5伊buffer5滋L，dN

13、TP(10mmol/L)0.5滋L，上下游引物各0.5滋L(10滋mol/L)，TaqDNA聚合酶0.125滋L(5U/滋LPromega)，分别用1滋L试剂盒法的粗提液、Martin法稀释100倍的粗提液与高盐改进法稀释100倍的粗提液为模板，补ddH2O至25滋L。扩增程序为：94预变性5min；9430s，5530s，共30个循环；72延伸5min。以上述PCR产物为模板，经ReconditioningPCR去除PCR产物中的异源双链(Thompsonetal.,2002;VonWintzingerodeetal.,1997)。反应体系为：5伊buffer5滋L，dNTP(10mmol/

14、L)0.5滋L，上下游引物各0.5滋L(10滋mol/L)，TaqDNA聚合酶0.125滋L(5U/滋LPromega)，模板1滋L，补ddH2O至25滋L。反应程序为：94变性5min；941min，551min和721min，5个循环；72延伸10min。扩增产物用1.2%的琼脂糖胶电泳检测。1.7变性梯度凝胶电泳ReconditioningPCR产物通过DGGE(仪器为DcodeTMSystem(Bio-RadLaboratories)进行分离，聚丙烯酰胺胶浓度8%，凝胶变性梯度为40%65%，60，180V，1伊TAE缓冲液，电泳时间5h，DGGE胶银染。银染方法参考Sangulnet

15、ti等(1994)并略作改进简化如下：10%酒精+0.5%乙酸+0.2%AgNO3中染色5min，清水漂洗2min后在3%NaOH+0.5%甲醛中显色510min。2结果分析2.1提取的总DNA产量与纯度比较3种方法提取的DNA片段长度差异不大，完整性较好，均在20kb左右，其中试剂盒法提取的DNA条三种土壤微生物总DNA提取方法的比较ComparisonofthreeExtractionMethodsofSoilMicrobialDNA333带较单一，Martin法及高盐改进法提取的DNA中有些许杂质(图1)。3种方法中，Martin法获得的DNA产量最高，其次为高盐改进法，试剂盒法产量最低

16、(表1)。3种提取方法中纯度最高的为试剂盒法，Martin法与高盐改进法两种方法提取的DNA蛋白质污染DNA含量与腐殖程度都较为严重。在粗提产物中，酸含量成正比，腐殖酸含量与提取物黑褐颜色的程度呈正比关系，黑褐色越深，腐殖酸污染也越严重。图2以土壤DNA为模板扩增的16SrDNA琼脂糖凝胶电泳注:M:DL2000plusmarkerFigure2Agarosegelelectrophoresisof16SrDNAamplified3种方法中，Martin法的粗提产物为黑褐色，高盐改进法为棕褐色，试剂盒法颜色透明；230nm处光密度值Martin法为9.5，高盐改进法为8.84，试剂盒法为0.4

17、3(表1)。用Martin法提取DNA时，虽然DNA得率高，但同时腐殖酸污染也最严重，试剂盒法DNA得率低，对应地其DNA提取液中腐殖酸含量也相对较少。2.2PCR扩增检测分别以试剂盒法粗提液，Martin法与高盐改进法稀释100倍后的提取液为模板进行细菌16SrDNAV3可变区的PCR扩增检测。结果表明，本实验所采用的3种方法提取的DNA都不需要进一步纯化即可用于后续PCR分析(图2)。图13种土壤DNA提取方法注:M:姿-Hind芋DNAdigestMarker;13:试剂盒法提取的DNA;46:Martin法提取的DNA;79:高盐改进法提取的DNA;以下同Figure1SoilDNAe

18、xtractedfromthreedifferentmethodsofex-tractionNote:M:姿-Hind芋DNAdigestMarker;13:DNAextractedbyKitmethod;46:DNAextractedbyMartinmethod;79:DNAextractedbyimprovedhigh-saltconcentrationmethod;Thesameasbelow表13种不同提取方法的土壤DNA产量与纯度Table1TheyieldandpurityofsoilDNAextractedfromthreedifferentmethodsofextraction

19、方法OD230OD260OD280OD260/OD280YMethodA0.43依0.070.22依0.020.12依0.011.76依0.043.62依0.37B9.5依0.217.76依0.055.84依0.101.33依0.013129.22依0.67C8.84依0.216.51依0.314.94依0.241.32依0.02108.57依5.18注:A:试剂盒法;B:Martin法;C:高盐改进法;Y:DNA产率(滋g/g)Note:A:Kitmethod;B:Martinmethod;C:Improvedhigh-saltconcentrationmethod;Y:SoilDNAyie

20、d(滋g/g)fromsoilDNANote:M:DL2000plusmarker2.3PCR扩增产物的DGGE分析3种方法提取DNA进行PCR扩增，扩增产物的DGGE电泳分析结果如图3。图中不同扩增条带及数目代表土壤微生物种类的多样性。由图3可以看出，3种方法提取DNA的PCR扩增及DGGE分析结果均具有较好的重复性，且3种方法提取DNA扩增的16SrDNAV3可变区的条带位置与数目基本相同。唯一差别在于，试剂盒方法中a、b位置为两条条带，代表两种微生物种类，而在Martin法和高盐改进法中的同一位置却只有一条单一的较粗深色条带c。由以上分析我们得出的结论是，3种方法均能达到土壤微生物多样性

21、PCR-DGGE分析的要求。其中，试剂盒提取方法的DGGE条带更为均匀，能更好地代表土壤微生物多样性。与试剂盒法相比，Martin法和高盐改进法由于纯化不够完全，DNA提取液中的杂质等可能影响PCR扩增反应，造成DGGE分析中PCR扩增产物条带数目的微小变化，从而可能会给土壤微生物多样性分析带来偏差，这也是应用DGGE分析微生物多样性时常见的一种偏差(Maarit-Niemietal.,2001)，理想的解决方案是，DGGE结合目的条带回收、测序以保证土壤微生物多样性分析的可靠性。3讨论图3三种不同提取方法的DGGE电泳图注:a,b:试剂盒法;c:Martin法和高盐改进法Figure3DGG

22、EgelelectrophoresisofsoilDNAextractedfromthreedifferentmethodsofextractionNote:a,b:Kitmethod;c:MartinmethodandImprovedhigh-salt334基因组学与应用生物学GenomicsandAppliedBiology从土壤或沉积物中提取DNA的方法可以分为两类(Leffetal.,1995)：一类是直接提取法，主要在土壤中直接裂解微生物体并提取DNA(TsaiandOlson,1991)；另一类是间接提取法，即先将微生物菌体与土壤颗粒分开，再提取DNA(JacobsenandRas

23、mussen,1992)。通常第一类方法提取效率比较高，其DNA提取物中理论上包含了所有土壤微生物DNA，但在实际操作中，由于DNA提取物中含有大量杂质如腐殖酸等，可能抑制DNA聚合酶活性，影响PCR扩增效率，引起微生物多样性分析偏差。一般情况下，土壤微生物DNA的粗提液因含有大量的抑制物质如腐殖酸，所以都应该经过纯化以后才能进行PCR扩增，但这些纯化方法往往造成核酸的大量损失(Lloyd-JonesandHunter,2001)。本实验中，试剂盒方法在提取过程中含有去除腐殖酸的步骤，因此可以直接进行PCR。而Martin法与高盐改进法都含有大量的腐殖酸，考虑纯化后DNA损失会影响多样性分析的

24、问题，因此在本实验中，采用直接稀释的方法，进行PCR扩增后表明能够达到理想的结果。这可能是因为在进行PCR扩增时，DNA的量少至pg(皮克)级就可以进行扩增，而适当稀释可以使腐植酸等抑制物的浓度降低，减少其抑制作用。1993年，Muzyer等首次将DGGE技术应用于分子微生物学研究领域，最近10年DGGE已广泛应用于各种环境微生态的研究中，在多样性分析中表现了越来越大的优越性。本实验中用DGGE方法检验了3种DNA的提取方法对后续生物多样性分析的影响，结果表明3种方法均能应用于微生物多样性的PCR-DGGE分析。其中试剂盒方法的DGGE条带相比更加均匀，更加便于进行多样性分析。对于土壤微生物总

25、DNA提取方法的评价，根据不同的目标有不同的指标。从土壤中提取微生物总DNA，不仅要保证DNA片段足够大，数量多，杂质少，而且过程是否简单、省时也是不可忽视的。本实验的3种方法相比较而言，试剂盒法用时最少，大约只需要4050min，Martin法与高盐改进法步骤较多，用时较长，Martin法一般用时45h，高盐改进法需要反复冻融、溶菌酶及SDS溶液多步裂解细胞等步骤，操作程序更为复杂。在试剂成本方面，试剂盒法相对昂贵，每反应大约人民币5060元；与之相比，Martin法与高盐改进法则低的多，据本实验室估算，Martin法每个反应成本为人民币1015元，高盐改进法为人民币1520元。总体说来，试

26、剂盒方法操作简单、省时，提取的DNA质量较高，但成本昂贵。Martin法与高盐改进法DOI：10.3969/gab.028.000331用时较长，但成本低廉。而对于初学者来说，Martin法与高盐改进法操作程序复杂，重复性较差，需反复学习、实验，技术熟练后方可提取出符合微生物多样性分析需要的土壤微生物总DNA样品。参考文献JacobsenC.S.,andRasmussenO.F.,1992,Developmentandap-plicationofanewmethodtoextractbacterialDNAfromsoilbasedonseparatio

27、nofbacteriafromsoilwithcation-ex-changeresin,Appl.Environ.Microbiol.,58(8):2458-2462LeffL.G.,DanaJ.R.,McArthurJ.V.,andShimketsL.J.,1995,ComparisonofmethodsofDNAextractionfromstreamsed-iments,Appl.Environ.Microbiol.,61(3):1141-11431Lloyd-JonesG.,andHunterD.W.F.,2001,ComparisonofrapidDNAextractionmeth

28、odsappliedtocontrastingNewZealandsoils,SoilBiology&Biochemistry,33:2053-2059Maarit-NiemiR.,HeiskanenI.,WalleniusK.,andLindstr觟mK.,2001,ExtractionandpurificationofDNAinrhizospheresoilsamplesforPCR-DGGEanalysisofbacterialconsortia,J.Microbiol.Methods,45(3):155-165Martin-LaurentF.,PhilippotL.,HalletS.,

29、ChaussodR.,GermonJ.C.,SoulasG.,andCatrouxG.,2001,DNAextractionfromsoils:oldbiasfornewmicrobialdiversityanalysismethods,Appl.Environ.Microbiol.,67(5):2354-2359MuyzerG.,EllenC.W.,andAndreG.U.,1993,Profilingofcom-plexmicrobialpopulationsbydenaturinggradientgelelec-trophoresisanalysisofpolymerasechainre

30、actiongenescod-ingfor16SrRNA,Appl.Environ.Microbiol.,59:695-700SanguinettiC.J.,DiasNetoE.,andSimpsonA.J.,1994,RapidsilverstainingandrecoveryofPCRproductsseparatedonpolyacrylamidegels,Biotechniques,17(5):914-21ThompsonJ.R.,MarcelinoL.A.,andPolzM.F.,2002,Heterodu-plexesinmixed-templateamplifications:f

31、ormation,conse-quenceandeliminationbyreconditioningPCR,NucleicAcidsRes.,30(9):2083-2088TsaiY.L.,andOlsonB.H.,1991,RapidmethodforseparationofbacterialDNAfromhumicsubstancesinsedimentsforpoly-merasechainreaction,Appl.Environ.Microbiol.,58(7):2292-2295VonWintzingerodeF.,G觟belU.B.,andStackebrandtE.,1997

32、,Determinationofmicrobialdiversityinenvironmentalsam-ples:pitfallsofPCR-basedrRNAanalysis,FEMSMicrobiol.Rev.,21(3):213-229ZhangR.F.,CaoH.,CuiZ.L.,LiS.P.,andFanB.,2003,Extrac-tionandpurificationofsoilmicrobialtotalDNA,WeishengwuXuebao(ActaMicrobiologicaSinica),43(2):276-282(张瑞福,曹慧,崔中利,李顺鹏,樊奔,2003,土壤微

33、生物总DNA的提取和纯化,微生物学报,43(2):276-282)基因组学与应用生物学，2009年，第28卷，第2期，第335-338页GenomicsandAppliedBiology,2009,Vol.28,No.2,335-338实验技术与方法TechniquesandMethodology螺旋藻的分离筛选及培养条件的选择宋玉凤马光庭*韩宇广西大学生命科学与技术学院,南宁,530005*通讯作者,mgt7828摘要采用选择性Zarrouk无机培养基从北海螺旋藻养殖场水样中富集和稀释平板分离出9株螺旋藻，经对通过对其形态学观察、培养基优其生长测定，从中筛选出一株生长较快、藻体粗壮的螺旋藻藻

34、种(暂定名SP06)，径宽3070滋m，化和最佳生长条件的选择试验，结果表明：该藻螺旋状，细胞为短圆柱形，藻体长50600滋m，螺旋数310，在配方为NaHCO316.8g/L、KH2PO40.4g/L、NaNO32.7g/L、NaCl1.0g/L、FeSO40.005g/L、MgSO40.1g/L、K2SO41.0g/L、CaCl20.04g/L液体培养基中，在起始pH810，光照强度4000Lx，30/25光/暗变温条件下生长良好，培养8d每升养殖水可收获湿藻4648g。关键词螺旋藻,分离,培养基优化,环境条件选择IsolationandScreeningoftheCultureCondi

35、tionofSpirulinaSongYufengMaGuangting*HanYuCollegeofLifeScienceandTechnology,GuangxiUniversity,Nanning,530005*Correspondingauthor,mgt7828DOI：10.3969/gab.028.000335AbstractInthispaper,SpirulinasamplesfromBeihaiwereenrichedbyusingZarroukinorganicculturemediumandninestrainswereisolatedbydilutionplates.O

36、nestrain(namedSP06)withrapidgrowthspeedwasobtainedbytestingtheirgrowthconditions.Bymorphologicalobservation,growingfactorstestandculturesoptimization.itisfoundthatthealgaishelical,cylindricalcell,thelengthofthealgaeis50600滋mandthediameterofthealgaeis3070滋m,helixicalnumberis310.Itgrowswellinfluidcult

37、uremediumwhichingredientsareNaHCO316.8g/L,KH2PO40.4g/L,NaNO32.7g/L,NaCl1.0g/L,FeSO40.005g/L,MgSO40.1g/L,K2SO41.0g/L,CaCl20.04g/L;lightin-tensityis4000Lx;thetemperatureis30/25(light/dark).Aftereightdays,wewillget4648gwetalgaeperliter.KeywordsSpirulina,Separation,Optimizationofthemedium,Choiceofenviro

38、nmentalcondition螺旋藻(Spirulina)是一种古老的微藻类生物，据报道在地球已有35亿年的生长历史，因其体形在显微镜下呈螺旋状而得名，属于蓝藻门、颤藻目、颤藻科、螺旋藻属；其含有丰富的蛋白质，氨基酸、维生素、生物活性元素等营养物质，对提高人体免疫力，抗衰老、抗肿瘤、抗辐射，防治多种疾病有显著辅助作用，1981年联合国粮农组织推荐它为人类未来最理想的光合效食品(陈金娥,2007)。另外螺旋藻生长繁殖快，率是一般农作物的23倍，生产周期短，一般810d，养殖成本低，效益好，引发国内外在近年来大面积养殖。但在生产中仍存在如藻种退化和混杂，生长慢，加工程度低，产后废水难以处理等问题

39、，为了解决这些/doi/10.3969/gab.028.000335基金项目：本研究由广西自然科学基金项目(桂科自0339006)资助问题，近年来对养殖螺旋藻的工艺技术、废水处理、螺旋藻加工和保健作用等亦有报道，尤其对螺旋藻的药理保健作用研究较多，但对其选种和生理研究较少。本研究紧密结合螺旋藻的生产实际需要，试图分离筛选出生长快、产量高、抗逆性和适应性强、藻体粗壮的螺旋藻藻种，并对其培养条件进行优化选择，以为螺旋藻的规模养殖提供优质藻种和养殖技术参数。1材料和方法1.1藻种来源从广西北海生巴达螺旋藻养殖水样分离筛选。336基因组学与应用生物学Genomi

40、csandAppliedBiology1.2培养基及培养条件富集和分离培养基：采用Zarrouk液体和固体培养基配方配制(李全顺和贾庆舒,2006)养殖试验培养基：以上培养基在Zarrouk藻类培养基配方的基础上根据试验需要设计进行优化试验，改良配制，121灭菌15min后备用。除条件试验外，试验均采用起始pH9.0，30/25变温，4000Lx光照12h，接藻种量10%(V/V)，以第78天的培养液OD560来表示藻体生长量，以生长量作为试验的考核指标。1.3螺旋藻的分离筛选取螺旋藻养殖水富集培养液在分离培养基作稀释平板涂布分离，光照培养箱培养810d，形成单个藻的群落后取其转接于试管中培养

41、，作为螺旋藻分离株，然后将分离株分别接种于三角瓶螺旋藻培养液中培养，培养8d后测定其OD值，根据OD560值的高低从中筛选出生长较快的藻株作为藻种筛选株。1.4筛选株培养基的优化在Zarrouk培养基配方的基础上，选用L9(43)正交试验表(表1)对NaHCO3、KH2PO4、NaNO3、NaCl，即C、N、P、K、Na等营养元素添加量对螺旋藻生长的影响进行正交试验，根据试验结果选出其最佳加量，优化培养基的配方。1.5筛选株最适生长条件的选择采用以上试验优化的Zarrouk螺旋藻培养基配方，对螺藻筛选株生长的起始pH值、温度、光照强度和接藻种量进行最适环境条件的选择，另外还试验了紫外照射对筛选

42、株生长的影响。1.6在所选最佳条件下筛选株生长的测定采用优化培养基和在所选最佳条件下对筛选株作培养试验；在生长过程中定期取培养液测筛选株藻体的生长变化，采用1伊104r/min30min离心称量湿藻重量测定其生长量；并作出其生长曲线，了解生长规律。表1正交试验表L9(43)因素及水平Table1FactorsandlevelsoforthogonaltableL9(43)水平因素LevelsFactorsNaHCO3(g/L)NaNO3(g/L)KH2PO4(g/L)NaCl(g/L)0.81.031.2www.genoapplb

43、DOI：10.3969/gab.028.0003352结果与分析2.1螺旋藻的分离筛选从北海螺旋藻养殖场水中分离出9株藻种，分别编号为SP01、SP02、SP09，经对其养殖试验，结果表明：其中分离株SP06培养液深绿色，藻体密度高，OD值较高，生长比其它株好(表2)，故选其为筛选藻株。2.2筛选株的形态特征经对筛选株SP06显微观察和群落特征观察表明：其由短圆柱形细胞组成，螺旋状，两端钝圆，藻体长50600滋m、径宽3070滋m，螺旋数为310个，表面不具胶鞘，不易被微生物附着，细胞内有气泡，上浮性好(图1A)。其在固体培养基上生长形成不规则点状，深绿色，边缘丝状不规则的群落(

44、图1B)。根据表3可以判断，NaNO3对螺旋藻生长的影响最大，NaHCO3其次，NaCl第三，KH2PO4最小。其最佳添加量为(g/L)：NaHCO316.8，KH2PO40.4，NaNO32.7，NaCl1.0。NaNO3在这里作为氮源，主要用来合成细胞内的含氮物质，而螺旋藻蛋白质含量较高，单位蛋白质产量比大豆高出25倍(周希华,2006,中国食品与营养,(8):23-25)，可见其对氮素营养的需求量是较大的；而碳源也是微生物生长不可或缺的，螺表2螺旋藻藻种的筛选Table2SelectionofspirulinastrainsABCDOD560SP01浅绿色密度低悬浮0.664Shallo

45、wgreenLowdesitySuspendSP02绿色密度高悬浮1.026GreenHighdesitySuspendSP03绿色密度高悬浮1.373GreenHighdesitySuspendSP04浅绿色密度低絮状0.841ShallowgreenLowdesityAgglomeratioSP05浅绿色密度低悬浮0.502ShallowgreenLowdesityaSuspendSP06深绿色密度高悬浮2.152DeepgreenHighdesitySuspendSP07绿色密度高悬浮1.587GreenHighdesitySuspendSP08浅绿色密度低絮状0.824Shallowg

46、reenLowdesityAgglomerationSP09浅绿色密度低絮状0.796ShallowgreenLowdesityAgglomeratio注:A:藻体编号;B:培养液颜色;C:显微观察藻体生长密度;D:培养液中藻体生长状态Note:A:Serialnumberofspirulina;B:Colorofhydroponiccul-ture;C:Growthdensityofspirulinabymicroscopeobservation;D:Growthstateofspirulinainhydroponicculture螺旋藻的分离筛选及培养条件的选择IsolationandSc

47、reeningoftheCultureConditionofSpirulina337图1螺旋藻分离筛选株SP06的形态观察注:A:光学显微镜(伊400)下细胞;B:群落形态Figure1MorphologicalobservationofisolateSP06Note:A:Morphologybyopticalmicroscop(伊400);B:Populationmorphology表3正交试验L9(43)结果与分析Table3ResultsandanalysisoforthogonalexperimentL9(43)试验编号及项目因素OD560ExperimentFactorsnumber

48、anditemNaHCO3NaNO3KH2PO4NaCl11(14.8)1(2.3)1(0.4)1(0.8)1.06021(14.8)2(2.5)2(0.5)2(1.0)0.97131(14.8)3(2.7)3(0.6)3(1.2)1.27642(16.8)1(2.3)2(0.5)3(1.2)1.04152(16.8)2(2.5)3(0.6)1(0.8)0.50262(16.8)3(2.7)1(0.4)2(1.0)2.30173(18.8)1(2.3)3(0.6)2(1.0)0.64083(18.8)2(2.5)1(0.4)3(1.2)0.17893(18.8)3(2.7)2(0.5)1(0.

49、8)0.796K1/31.1020.9141.1800.786K2/31.2810.5500.9361.304K3/30.5381.4580.8060.832极差0.7430.9080.3740.518Range旋藻在生长过程中除吸收空气中的CO2还需要利用培养基碳酸盐中的CO2，NaHCO3不仅可作为碳源，也可调节培养基pH；K、Na对于维持细胞渗透压和细胞质离子平衡有重要作用，磷是核酸、核蛋白、磷脂、辅酶及ATP等高能分子的成分，这些物质过量就会加大渗透压不利于生长，不足量则不能满足藻体生长需要。2.4起始pH值对螺旋藻SP06生长的影响由图2显示，筛选株螺旋藻SP06生长的最适起始pH值

50、为810，pH7.0和pH11.0培养液中其生长量下降，但普遍认为在偏碱性环境不仅有利于螺旋藻生长，同时在生产中对抑制其它杂藻的生长有很大作用(杨学文等,2006)。2.5温度对螺旋藻SP06生长的影响试验表明：筛选株SP06在30/25条件下生长比较好；温度升高或降低，其生长量都有所下降(图2)，图2不同条件对SP06生长的影响注:光暗周期:12h/12h;A:20/15(光/暗);B:25/20(光/暗);C:30/25(光/暗);D:35/30(光/暗)Figure2EffectofconditiononthegrowthoftheisolateSP06Note:Lightcycle:1

51、2h/12h;A:20/15(light/dark);B:25/20(light/dark);C:30/25(light/dark);D:35/30(light/dark)所以选择昼/夜温度30/25为最适培养温度。据研究：通过对3种螺旋藻生长最适温度的比较研究得出了温度对螺旋藻生长的影响为单峰曲线，温度过高或过低均会导致螺旋藻生长速率急剧降低(杨学文等,2006)，这与本研究的结果基本相同。可能温度过高或过低都会影响酶活性，从而影响暗反应和光合作用以及细胞物质的累积，使螺旋藻生长变慢。2.6光照强度对筛选株螺旋藻SP06生长的影响试验结果表明：筛选株螺旋藻SP06在无光照时338基因组学与应

52、用生物学GenomicsandAppliedBDOI：10.3969/gab.028.000335生长很差，在光照4000Lx比3000Lx生长好(图2)，保健价值，是未来人类理想的食品源，因此对其高试验进一步验证螺旋藻是一种绿色光合自养生物，生长过程中进行光合作用合成细胞物质需要大量的光能，光照不仅能影响光合碳固定的速率，还能影响藻细胞的呼吸强度以及能源水平(田华等,2005;Kebede,1996)，因此光照是螺旋藻生长最主要的环境因子。2.7接藻种量对螺旋藻SP06生长的影响试验表明接藻种量越大，其同时间生长量就越大。由图2，接藻种量5

53、%和10%所获得的生长量OD560相近，从养殖成本考虑我们选择5%为最佳接藻种量。2.8紫外照射对筛选株螺旋藻SP06生长的影响试验结果如图2所示，藻种接种前后生长显著受到影响，这可能是因为紫外线照射会大量杀死藻种细胞，或受损的细胞修复复活也有一个过程，该试验表明螺旋藻对紫外线有一定抗逆性，照射0.5h仍有较大生长量，同时也可预示有希望通过此方法筛选对紫外线抗逆性强的藻种。综合以上选择试验表明该筛选株螺旋藻SP06在培养基配方为(g/L)：NaHCO316.8、KH2PO40.4、NaNO32.7、NaCl1.0、FeSO40.005、MgSO40.1、K2SO41.0、CaCl20.04，在起始pH9.0，每天光照强度4000Lx照射12h，光/暗30/25变温条件下生长最好。2.9在所选最佳条件下筛选株SP06生长试验试验结果表明：螺旋