豆角中血细胞凝集素的分离提纯及分子量测定

1、豆角中血细胞凝集素的分离提纯及分子量测定参赛者资料：南方医科大学第一临床医学院 06级临床医学五年制专业常威 61364882金花 61364868初 61364868 要目的：分离提纯豆角中血细胞凝集素及测定分子量方法：凝胶层析法，SDS-PAGE电泳关键词：豆角 血细胞凝集素 凝胶层析 SDS-PAGE电泳1 前言近年来，豆角中毒事件屡次发生，受到了各界广泛的关注。据一些研究表明其毒性物质为豆角血细胞凝集素。它是广泛存在于各种植物中的抗营养因子，在高温中可被分解破坏，但在菜肴烹饪中如不注意火候温度，便容易使人误食

2、未经高温灭活的血细胞凝集素而导致凝集素中毒。凝集素中毒潜伏期可长可短，一般在2-4小时。中毒者会出现恶心、呕吐、腹痛腹泻、头疼、头晕、心慌胸闷、出冷汗、手脚发冷、四肢麻木、畏寒等症状。血细胞凝集素是动物细胞和植物细胞都能够合成和分泌的、能与糖结合的蛋白质,在细胞识别和粘着反应中起重要作用,主要是促进细胞间的粘着，因具有一个以上同糖结合的位点，因此能够参与细胞的识别和粘着。2实验目的本实验通过对豆角中血细胞凝集素的粗提取，应用凝胶层析法对其分离提纯，并且应用SDS-PAGE电泳测定其蛋白质相对分子量，来进一步研究豆角中血细胞凝集素的生物化学性质及意义。3 实验原理31 血细胞凝集素特性：血细胞凝

3、集素是一种非免疫来源的、对糖及其缀合物可逆专一识别的蛋白质分子，它是能够可逆地结合到特异单糖或多糖上的蛋白质，故可通过葡萄糖洗脱液洗脱分离。32 凝胶是一种经过交联而具有立体网状结构的多聚体，因其有立体的网状结构故有分子筛效应，利用凝胶层析可以脱盐，分离提纯蛋白质。33 聚丙烯酰胺，即丙烯酰胺（CH2=CHCONH2）和少量交联剂甲叉双丙烯酰胺（CH2=CHCONH2）2-CH2(缩写Bis)在催化剂过硫酸铵（NH4）2S2O8作用下形成凝胶。反应液中还加有四甲基乙二胺（TEMED）用来引发和控制聚合反应。反应混合物在底部用1.5%琼脂凝胶封闭，反应液顶部覆盖一层水层，保证凝胶表面平坦，同时起

4、到隔离大气中氧气的作用，因为氧气可抑制聚合反应。聚合后的聚丙烯酰胺凝胶形成网状结构,具有浓缩效应、电荷效应、分子筛效应。血清蛋白在聚丙烯酰胺凝胶电泳一般可分成1225个组分。因此适用于不同相对分子质量物质的分离，且分离效果好。4 实验设备名称规格数目备注恒温水浴箱-1台自动部分收集器-1台蠕动泵-1台组织捣碎机-1台普通离心机3000r/m1台移液枪10L，100L各一试管、烧杯小号各3个SDS-PAGE电泳仪-1台染色/脱色皿-1个滤纸-5块层析柱1.0*25cm1个笔记本电脑-1台摇床-1台为自备用品，无需主办方提供。为非必须器材，主办方没有则不必准备5 实验材料及试剂51试剂的配制511

5、 蒸馏水 500mL512 Sephadex G50 (自备)513 1M的氯化钠溶液 1000mL514 含0.5M葡萄糖的1M的氯化钠溶液 500mL515 下胶：（12%） 水-9.9mL 30%丙烯酰胺溶液-12.0mL 1.5mol/L Tris(pH8.8)-7.5mL 10% SDS-300L 10%过硫酸氨-300L TEMED-12L516 上胶：（6%） 水-4.1mL 30%丙烯酰胺溶液-1000L 1.5mol/L Tris(pH6.8)-750L 10% SDS-60L 10%过硫酸氨-60L TEMED-6L517 染色液：0.5g考马斯亮蓝R250，90mL甲醇，

6、20mL冰乙酸，加水至200mL518 脱色液：90mL甲醇，20mL冰乙酸，加水至200mL519 10×电泳缓冲液（pH 8.3）：称取3.0g Tris base，14.4g Glycine，SDS 1.0g加双蒸水至100mL溶解。5110 2×样品缓冲液：0.5mol/L Tris-HCl(pH6.8)2.0mL，甘油2.0mL，20%SDS(w/v)2.0mL，-巯基乙醇1.0mL，0.1%溴酚蓝（w/v）0.5mL，双蒸水2.5mL52材料的处理521新鲜四季豆的种子6实验操作步骤61血细胞凝集素粗提611 取样：取600g新鲜四季豆，取其种子。612 将上述

7、种子用组织捣碎机捣碎，用微孔筛过滤取其滤液。613 将滤液置于离心管中，3000r/m离心十分钟，取上清液。62血细胞凝集素提纯621 凝胶层析分离 1.装柱：取直径为1.0 cm，长度为 25 cm的层析柱，自顶部用玻璃管引流缓缓连续加入稀薄的Sephadex G50悬液，待凝胶上升至距顶柱约3-5 cm即可，启动蠕动泵，用1M NaCl溶液平衡10分钟。 2.加样：取样品离心所得上清液上柱，静置10分钟。3.洗脱（1M氯化钠）用1M的氯化钠缓慢洗脱，启动自动部分收集器开始收集洗脱液，设定为每3分钟换一个玻璃试管（每管4mL），连续收集9管（3个柱体积），关闭自动部分收集器，在各管中分别液在

8、 280 nm 紫外光上比色检测并记录数值，直至吸光值下降到接近零为止。此洗脱峰为不与葡萄糖亲和的杂蛋白峰。4.再洗脱（0.5M葡萄糖/1M NaCl）：改用含0.5M葡萄糖的1M NaCl进行洗脱，启动自动部分收集器开始收集洗脱液，设定为每3分钟换一个玻璃试管（每管4mL），连续收集9管，关闭自动部分收集器，在各管中分别取液在280nrn紫外光上比色检测并记录数值，直至吸光值下降至接近零为止。此洗脱峰为凝集素峰。5.取血细胞凝集素峰时的洗脱液，置于小试管中。此为四季豆中血细胞凝集素的提取液。63血细胞凝集素的分子量测定631安装垂直电泳槽模具，并用琼脂糖溶液封边。632配制分离胶（下胶）：（

9、12%）水9.9mL，30%丙烯酰胺溶液12.0mL，1.5mol/L Tris（pH8.8 7.5mL），10% SDS300L，10%过硫酸氨300L，加入TEMED 12L后应立即混合均匀，加入到凝胶模具中，并留出浓缩胶所需空间（梳齿长加1cm），用吸管沿玻璃板壁小心滴加一层水饱和正丁醇或双蒸水，在凝胶与覆盖液之间会看见一个明显的分界面，然后将凝胶垂直置于室温下，不要随意移动以免凝胶聚合后表面不平，分离胶最好在30min左右聚合。聚合后，原有的分界面消失，而在稍低的部位将会出现另一分界面，这就是聚合后的凝胶表面。倾出覆盖层液体，用蒸馏水洗涤凝胶顶部数次，除去未聚合的丙烯酰胺，并用滤纸吸去

10、残留的液体。633制备浓缩胶（上胶）：（6%）水4.1mL，30%丙烯酰胺溶液1000L，1.5mol/L Tris(pH6.8)750L，10% SDS 60L，10%过硫酸氨60L，加入TEMED 6L后将配好的浓缩胶溶液快速混合后灌注在已聚合的分离胶上，并立即在浓缩胶溶液中插入干净的梳子，将凝胶垂直放置于室温下，避免移动。634浓缩胶聚合后，小心拨出梳子，用双蒸水冲冼加样槽除去未聚合的丙烯酰胺，将凝胶固定在电泳装置上，加入10×电泳缓冲液。635取待测凝集素提取液50L加入EP管中，再加入2×样品缓冲液50L，混合均匀，在100摄氏度水浴中煮沸10min。636在第一

11、个电泳槽中加入高分子量marker637待提取液冷却后，用移液器取30L溶液加入凝胶电泳槽中。638加样完毕，把电泳装置放在电泳槽内，使电泳装置底部电极丝浸于缓冲液中，将电泳装置的负极与电泳液相接，将电流设置在90-120V，样品应10min之内进入浓缩胶，否则说明盐浓度过大。待测样品进入分离胶后可将电源调至120-160V，继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部，关闭电源。639从电泳装置上卸下玻璃板，放在滤纸上，撬开玻璃板，取出凝胶，在凝胶下缘切角标记位置。6310将凝胶板轻轻放入染色液中染色，40染色1h。倒出染色液以后备用，用蒸馏水冲洗酌留的染色液。将凝胶浸入脱色液中，其间更换34次脱色液，

12、直至背景透明，回收后的脱色液经活性炭吸附后可重复使用。6311干胶制作方法：将凝胶包在两层浸湿的玻璃纸间，四周用夹子或胶带纸固定在玻璃板上，室温下自然干燥，待凝胶干燥后去掉玻璃板，即可长期保存。7 实验结果记录1MNaCl洗脱表格(表-1)试管号12345吸光值1.8412.4660.8950.3620.140试管号6789吸光值0.0820.0550.0250.0030.5M葡萄糖/1M NaCl洗脱表格(表-2)试管号12345吸光值2.6020.5352.3450.2680.215试管号6789吸光值2.5420.1252.6230.030根据表-2中的吸光度值，取1,3,6,8号试管中

13、的样品50L，各加入2×样品缓冲液50L，煮沸10分钟，然后8000r/m离心5分钟，各取上清液10L上样。将电泳结果通过数码相机拍摄并将相片输入笔记本电脑，用gelpro32软件分析。结果如图：（图-1）（图-2）Lanes:Lane 1Lane 2Lane 3Lane 4Lane 5Rows(mol.w.)(amount)(mol.w.)(amount)(mol.w.)(amount)(mol.w.)(amount)(mol.w.)(amount)r11163.133101.93.674111.12.2411162.475121.10.885r266.21.49963.081.1

14、4961.570.98063.082.647r3452.67139.133.67141.381.79841.382.80642.556.353r4354.71232.807.76333.664.98632.803.60732.808.795r5251.00724.411.65327.0110.74r618.40.69017.140.54115.62.34515.970.456r715.64.75014.534.26614.538.06911.481.73911.4812.12（图-3）8 结果讨论与分析81 从表-1中可以看出,杂蛋白的洗脱峰集中在第一个柱体积的洗脱液里,即此洗脱液中蛋白含量最

15、高(如用280紫外自动检测仪检测,在第一个柱体积的洗脱液时可出现明显峰值) .82 从表-2中可看出,与葡聚糖亲和蛋白的洗脱峰不连续出现,原因可能有以下两方面:层析柱成柱时没有一次性成柱,导致柱各段不均匀;目的蛋白与葡聚糖结合不连续,呈分段结合.83 层析柱上样后,待样品完全进入层析柱时关闭蠕动泵停止洗脱(根据颜色判断样品是否完全进入层析柱),等待10分钟左右,可以使样品中的目的蛋白与葡聚糖充分结合,从而使第二次洗脱时目的蛋白的峰值更明显,增加洗脱所得目的蛋白含量.84 根据血细胞凝集素的特性：血细胞凝集素是一种非免疫来源的、对糖及其缀合物可逆专一识别的蛋白质分子，它能够可逆地结合到葡聚糖上，故可通过葡萄糖洗脱液洗脱分离。故血细胞凝集素可以导致人体内糖蛋白的聚合变性导致中毒。85 根据gelpro32分析电泳结果，由图-1可知在116KDa处有峰值，结合图-2，图-3可知其为目的蛋白。9注意事项91 在凝胶制备过程中防止微生物感染。92 争取一次成胶，避免在制胶过程中使气泡进入凝胶内。93 在洗脱时用蠕动泵调节控制洗脱液的流速。93 安装电泳槽时要注意均匀用力旋紧固定螺丝，避免缓冲液渗漏。94 用琼脂(糖)封底及灌胶时不能有气泡，以免电泳时影响电流的通过。95 加样时样品不能超出凹形样品槽。加样槽中不能有气泡，如有气泡，可用注射器针头挑除。96 丙烯酰胺是有毒