大孔吸附树脂对贯叶金丝桃中苯并二蒽酮类成分的富集

1、大孔吸附树脂对贯叶金丝桃中苯并二蒽酮类成分的富集樊敏伟1，宋崎 1*，王冰1，宋英1，奚静芳1，王建新2(1. 上海市中药研究所，上海 201203；2复旦大学，上海 200032)摘要目的考察大孔吸附树脂对贯叶金丝桃中苯并二蒽酮类成分的富集方法, 并确定工艺路线和吸附参数。方法本文以贯叶金丝桃中苯并二蒽酮类成分为考察指标，采用动态和静态吸附试验相结合来考察大孔吸附树脂对贯叶金丝桃中苯并二蒽酮类成分的富集工艺。结果 本文得到稳定可行的对贯叶金丝桃中苯并二蒽酮类成分富集的工艺路线和吸附参数。结论 该方法可为贯叶金丝桃中苯并二蒽酮类成分的大孔树脂精制工艺的确定提供参考。关键词 贯叶金丝桃；苯并二蒽

2、酮；大孔吸附树脂；静态吸附；动态吸附所属专业 中药与天然药物（中药与天然药物资源的开发利用和可持续发展）Enrichment of Naphthodianthrones in Hypericum perforatum L. with Macroporous ResinFAN Min-wei 1，SONG Qi 1*，WANG Bing1，SONG Ying1，XI Jing-fang1，WANG Jian-xin2 (1.Shanghai Institute of Chinese Meteria Medica Shanghai 201203；2. Fudan University Shangh

3、ai 200032)Abstract Objective To study the enrichment of naphthodianthrones in Hypericum perforatum L. with macropotous resin , and define the refinement process and adsorption factor. Methods The refinement process and adsorption factor of the separation and purification of naphthodianthrones in Hyp

4、ericum perforatum L. with macroporous resin were compared by static and dynamic adsorbing experiments. And the content of naphthodianthrones was developed as its quality standard, screening out the best refinement process and adsorption factor. Results The refinement process and adsorption factor of

5、 the enrichment of naphthodianthrones in Hypericum perforatum L. with macroporous resin are stable and feasible .Conclusion The enrichment method can offer information about the determination of refinement process of Hypericum perforatum L. with macroporous resin.Key words Hypericum perforatum L.; n

6、aphthodianthrones; macropotous resin; static adsorption; dynamic adsorption贯叶金丝桃为藤黄科植物贯叶金丝桃Hypericum perforatum L. 的干燥地上部分。贯叶金丝桃的主要化学成分包括苯并二蒽酮类化合物, 如金丝桃素、伪金丝桃素、原金丝桃素、原伪金丝桃素等； 黄酮类化合物, 如芦丁、金丝桃甙、槲皮素、异槲皮素、阿曼托黄素等；间苯三酚类化合物, 包括贯叶金丝桃素、加贯叶金丝桃素等；还含有挥发油类、香豆素类化合物等1-3。据文献报道, 贯叶金丝桃中的抗抑郁活性成分主要有苯并二蒽酮类、黄酮类、间苯三酚类等。其中

7、，苯并二蒽酮类被普遍认为是抗抑郁作用较好的成分，国内外对贯叶金丝桃提取物多以金丝桃素计的苯并二蒽酮类含量不低于0.3%作为质量控制指标。本文采用大孔吸附树脂来考察贯叶金丝桃中苯并二蒽酮类的吸附特性，从而进一步确定苯并二蒽酮类活性成分富集方法,得到较高纯度的贯叶金丝桃有效部位。1仪器、试剂和材料HP6890气相色谱仪，HP7694顶空进样仪；岛津UV-2401PC；金丝桃素对照品购自美国SIGMA公司；试剂均为分析纯。大孔树脂均为国产；贯叶金丝桃采购于陕西省汉中市。2实验部分2.1苯并二蒽酮类的含量测方法2.1.1供试品和对照品的制备供试品溶液：取样品约0.1g，精密称定，至50ml棕色量瓶中，

8、加甲醇40ml，超声处理（功率350W、频率35KHz）40分钟，放冷，加甲醇至刻度，摇匀，过滤。精密量取续滤液2ml，置10ml棕色量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀。对照品溶液：精密称取五氧化二磷减压干燥24h的金丝桃素对照品，加甲醇-吡啶(9:1)配制成每1ml含金丝桃素20g的溶液，置棕色量瓶中，作为对照品储备液。2.1.2测定方法分别取供试品溶液和对照品溶液，以试剂作空白，照分光光度法（中国药典2005年版一部附录VB），在588nm波长处测定吸收度，计算，即得。2.1.3线性范围的考察分别精密量取对照品储备液1.0ml、2.0ml、4.0ml、6.0ml、8.0ml于10ml棕色量瓶中，加

9、甲醇-吡啶(9:1)稀释至刻度，摇匀，照分光光度法 (中国药典2005年版一部附录VB)，在588nm波长处测定吸收度，以吸收度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。结果得到回归方程：C=0.2939+23.53A ， r=0.9988。结果表明在1.98-19.8g/ml范围内苯并二蒽酮类浓度与吸收度有良好的线性关系。2.2大孔吸附树脂有机残留物检查 照有机溶剂残留量测定法（中国药典2005年版二部附录VIII P 第二法）测定。2.2.1色谱条件 用键合/交联聚乙二醇毛细管色谱柱（30m0.25mm0.25m HP-INNOWAX Agilent公司）；柱温50，进样口及检测器温度分别为2

10、60及300；载气为氮气，流速：2.0ml/min；顶空取样瓶加热条件：120加热15min。2.2.2供试品和对照品的制备供试品溶液的制备：取样品约0.2g，精密称定，置20ml顶空取样瓶中，精密加入0.6%十二烷基硫酸钠溶液5ml，摇匀，即得。对照品溶液的制备：精密称取正己烷，苯，甲苯，对二甲苯，邻二甲苯，苯乙烯和1,2-二乙基苯适量，加0.6%十二烷基硫酸钠溶液配制成每1ml分别含15g，10g，12g，12g，13g，16g和13g的溶液，摇匀，精密量取5ml，置20ml顶空取样瓶中，即得。2.2.3 测定法分别取对照品溶液和供试品溶液，在120加热15min，依法测定，按外标法以峰面

11、积计算，即得。2.3 贯叶金丝桃提取液的制备取贯叶金丝桃药材，加60%乙醇回流提取二次，每次1.5h，合并提取液，滤过，滤液减压浓缩至1ml溶液约相当于1g药材，离心，备用。2.4大孔树脂的预处理以95%乙醇湿法装柱, 以95%乙醇洗脱，不时检测流出的乙醇，当流出的乙醇与水混合后不呈白色浑浊时即可，再以蒸馏水洗至无醇味。实际操作中，乙醇洗至柱体积的4倍时与水混合不浑浊，洗至6倍时，无树脂味。2.5影响大孔树脂静态吸附的因素2.5.1树脂型号的筛选选取6种经预处理的湿态树脂5g（ D-101、DA-101、DA-201、 DB-301、AB-8、LSA-20）置100ml 具塞锥形瓶中，取贯叶金

12、丝桃提取液加入瓶中，在25摇床中振荡 24h，吸附达到平衡后，滤去树脂，定量移取清液，测定含量，计算吸附率。结果，吸附率依次为72.13，73.08，60.12，61.78，65.51，80.35。本文根据吸附率结合树脂成本综合考虑，最终选择LSA-20型大孔吸附树脂。2.5.2吸附时间的考察取30g湿态LSA-20型大孔吸附树脂，置于100ml具塞锥形瓶中，加入贯叶金丝桃提取液，在25摇床中振荡 24h，取样时间依次为1，2，4，6，8，10，24h。测定吸附率，考察吸附时间对静态吸附的影响。结果为，结合吸附率和时间成本综合考虑，最终选择吸附时间为2h。2.6影响大孔树脂动态吸附的因素2.6

13、.1洗脱溶剂的筛选精密吸取贯叶金丝桃提取液100ml(每ml含生药1g)上柱, 依次用蒸馏水、20%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇梯度洗脱, 每瓶收集一个柱体积的洗脱液,依次按1，2，3编号，分别浓缩至干, 测定每份洗脱液中苯并二蒽酮量。以收集量瓶编号(X)为横坐标，苯并二蒽酮量(Y)为纵坐标, 绘制洗脱曲线, 见图1。 01234567891号2号3号4号5号6号7号8号9号10号11号12号13号14号15号16号17号18号19号20号21号22号23号24号25号26号编号苯并二蒽酮(mg)图1 贯叶金丝桃大孔树脂吸附苯并二蒽酮类梯度洗脱曲线图15号：水洗脱；610号：20%

14、乙醇洗脱；1115号：50%乙醇洗脱；1622号：70%乙醇洗脱；2326号：95%乙醇洗脱结果显示，50、70、95乙醇洗脱液中苯并二蒽酮量占总量的94%，说明苯并二蒽酮主要集中在50、70、95乙醇洗脱液中。而其中50乙醇洗脱液和70乙醇洗脱液中苯并二蒽酮量占总量的84%，95乙醇洗脱液中苯并二蒽酮量较少。70%乙醇的极性与50%乙醇接近，且小于50%乙醇，相对而言可洗脱下的水溶性杂质也较少，可基本涵盖50%乙醇洗脱液可洗脱的苯并二蒽酮量。因此，综合考虑减少操作工序, 节约生产成本等因素，初步确定洗脱条件为先用蒸馏水、20乙醇洗去水溶性杂质，再以70%乙醇洗脱，收集70乙醇洗脱部分。2.6

15、.2洗脱剂用量的确定 精密吸取贯叶金丝桃提取液100ml(每ml含生药1g)上柱,。先用蒸馏水、20乙醇洗脱，再以70乙醇洗脱，每瓶收集一个柱体积的洗脱液,依次按1，2，3编号，分别浓缩至干, 测定每份洗脱液中苯并二蒽酮量。 以收集量瓶编号(X)为横坐标，苯并二蒽酮量(Y)为纵坐标, 绘制洗脱曲线, 见图2。图2考察70%乙醇洗脱溶媒量对苯并二蒽酮类洗脱终点的判断15：水洗脱；610：20% 乙醇洗脱；1119号：70%乙醇洗脱；图2结果显示，当以水洗脱4倍柱体积、20乙醇洗脱3倍柱体积时，洗脱曲线已近横轴且所收集的洗脱液几乎无色，因而确定除去杂质的水用量为4倍柱体积，20乙醇用量为3倍柱体积

16、。采用70乙醇洗脱，洗脱至7倍柱体积时曲线已接近横轴，且前7倍柱体积洗脱液中苯并二蒽酮量约占70乙醇总洗脱量的96以上，故确定洗脱溶媒为7倍柱体积的70乙醇。2.6.3影响大孔树脂吸附性能因素的研究2.6.3.1大孔吸附树脂的吸附性能的考察 大孔吸附树脂的吸附性能与药液浓缩比、上样流速、柱径高比等因素有关。本文采用L9(34)正交试验筛选最佳的上柱工艺条件。正交设计的因素水平表见表1。表1L9（34）正交设计因素水平表 因素水平药液浓缩比 A半径：柱高比 B上样流速 C11:0.51201BV/h2111102 BV/h312153 BV/h2.6.3.2 试验方法及结果本正交试验以70%乙醇

17、洗脱液中苯并二蒽酮量（以100g贯叶金丝桃药材计）为考察指标，结果见表2。表2 正交试验设计及结果试验号药液浓缩比(A)半径：柱高比(B)上样流速 (C)空白(D)苯并二蒽酮类量(10-2g)111114.86212224.47313333.32421236.49522314.98623124.29731324.82832134.22933213.2512.6516.1713.3713.0915.7613.6714.2113.5812.2910.8613.1214.034.225.394.464.365.254.564.744.534.03.624.374.68R1.151.770.370.3

18、2上述数据表明：在设置水平范围内，以苯并二蒽酮量为指标, 由于极差R的大小显示影响因素的主次，所以其影响顺序为BAC；综合分析，B为主要因素，A次之。通过直观分析，最优组合应为B1A2C2，即半径：柱高比为1:20；药液浓缩比为1:1；药液上样流速为2 BV/h。2.6.3.3方差分析由于药液上样流速C列与空白D列的R值相近，说明药液上样流速对结果的影响较小。因此本文采用正交设计助手II V3.1软件，进而以C列和D列作为误差项进行方差分析，结果见表3。表3 方差分析表方差来源离差平方和自由度F比F临界值（=0.05）显著性A2.43213.346.94B4.71225.856.94误差0.3

19、64由方差分析结果可知，A列（药液浓缩比）、B列（半径柱高比 ）对洗脱结果有显著性差异，C列（药液上样流速）无显著性差异。综合直观分析和方差分析结果及生产实际，最终确定上柱工艺条件为半径：柱高比为1:20；药液浓缩比为1:1；药液上样流速为3 BV/h。2.7验证试验按照上述实验条件，进行验证试验，测定70%乙醇洗脱液的浸膏得率，浸膏中苯并二蒽酮类含量和大孔树脂有机残留量，结果见表4。表4 验证试验结果实验次数上样量相当于生药克数（g）70乙醇洗脱液所得浸膏重量（g）浸膏得率（）苯并二蒽酮类含量()苯并二蒽酮类转移率()有机残留物检查（）1100038.33.831.4655.92甲苯：0.0

20、037其余未检出2100033.33.331.5250.62甲苯：0.0013其余未检出3100037.83.781.4855.94甲苯：0.0016其余未检出上述数据可以看出，该条件稳定可行。大孔树脂残留也符合药品注册的国际技术要求（质量部分）（ICH指导委员会周海钧主译）。3讨论3.1苯并二蒽酮类的含量测定方法主要参考美国草药典4 , 样品溶液经波长扫描，其最大吸收值与对照品一致, 均为588nm，空白溶液经扫描在588nm波长处无吸收。因此，选择测定波长为588nm。3.2综合上述实验研究，大孔吸附树脂对贯叶金丝桃中苯并二蒽酮类成分的分离纯化工艺归纳如下：选用LSA-20型大孔吸附树脂，上柱药液浓缩比为1:1，柱高比为1:20，药液上样流速为3 BV/h，吸附时间为2h。先用4倍柱体积蒸馏水和3倍柱体积20乙醇洗脱弃去，再选用7 倍柱体积70乙醇洗脱，收集洗脱液，减压干燥，即得。本文“2.2 贯叶金丝桃提取液的制备”项下所用贯叶金丝桃药材含苯并二蒽酮类约为0.10%，所制备的上柱药液含苯并二蒽酮类约为0.26%。本文通过大孔吸附树脂富集后，样品中苯并二蒽酮类含量约达到1.48%,为药材含量的14.8 倍和上柱药液含量的5.7倍。通过验证试验说明该富集方法的工艺路线稳定可行，吸附