流式细胞仪的工作原理和基本结构

1、职业教育医学检验技术专业教学资源库流式细胞仪的基本结构和工作原理沧州医学高等专科学校沧州医学高等专科学校 刘玉枝刘玉枝流式细胞仪的工作原理和基本结构流式细胞仪的工作原理和基本结构 1. 1.流式细胞仪流式细胞仪分析对象：生物颗粒，包括大的免分析对象：生物颗粒，包括大的免疫复合物、疫复合物、DNADNA、RNARNA、蛋白质、病毒颗粒、脂质体、蛋白质、病毒颗粒、脂质体、细胞器、细菌、霉菌、染色体、真核细胞、杂交细胞细胞器、细菌、霉菌、染色体、真核细胞、杂交细胞、聚集细胞等。、聚集细胞等。 2.2.检测生物颗粒的理化性质：包括细胞大小、细检测生物颗粒的理化性质：包括细胞大小、细胞形态、胞浆颗粒化程

2、度、胞形态、胞浆颗粒化程度、DNADNA含量、总蛋白质含量、含量、总蛋白质含量、细胞膜完整性和酶活性等。细胞膜完整性和酶活性等。流式细胞仪的工作原理和基本结构流式细胞仪的工作原理和基本结构 1.1.生物学颗粒分析原理生物学颗粒分析原理 2.2.细胞分选原理细胞分选原理一、流式细胞仪的工作原理一、流式细胞仪的工作原理流式细胞仪的工作原理和基本结构流式细胞仪的工作原理和基本结构1 1生物颗粒分析的原理生物颗粒分析的原理 （1 1）悬浮分散的单细胞悬液经悬浮分散的单细胞悬液经荧光染料染色后，放人样品管。荧光染料染色后，放人样品管。在液流泵作用下，垂直进入流在液流泵作用下，垂直进入流动室，沿流动室的轴

3、心向下流动室，沿流动室的轴心向下流动。流动室轴心至外壁的鞘液动。流动室轴心至外壁的鞘液也向下流动，形成包绕细胞悬也向下流动，形成包绕细胞悬液的鞘液流，鞘液和样品流从液的鞘液流，鞘液和样品流从喷嘴孔喷出，在测量区与水平喷嘴孔喷出，在测量区与水平方向的激光束垂直相交。方向的激光束垂直相交。 流式细胞仪的工作原理和基本结构流式细胞仪的工作原理和基本结构1 1生物颗粒分析的原理：生物颗粒分析的原理： （2 2）染色的细胞在测量区受激染色的细胞在测量区受激光照射后发出荧光，同时产生光照射后发出荧光，同时产生光散射。这些信号分别被光电光散射。这些信号分别被光电倍增管和光电二极管接收，经倍增管和光电二极管接

4、收，经过计算机储存、计算、分析这过计算机储存、计算、分析这些数字化信息，就可得细胞的些数字化信息，就可得细胞的大小和核酸含量等指标。大小和核酸含量等指标。 2 2细胞分选的原理细胞分选的原理 在压电晶体加上信号，产生同频率的机械振动，流动室随在压电晶体加上信号，产生同频率的机械振动，流动室随之振动，促使通过测量区的液柱断裂成一连串均匀的液滴。之振动，促使通过测量区的液柱断裂成一连串均匀的液滴。流式细胞仪的工作原理和基本结构流式细胞仪的工作原理和基本结构 2 2细胞分选的原理细胞分选的原理 细胞分选：细胞分选：当某类细胞的当某类细胞的特性与要分选的细胞相同时，特性与要分选的细胞相同时，流式细胞仪

5、就会在这类细胞形流式细胞仪就会在这类细胞形成液滴时给含有这类细胞的液成液滴时给含有这类细胞的液滴充以特定的电荷，带有电荷滴充以特定的电荷，带有电荷的液滴向下落入偏转板间的静的液滴向下落入偏转板间的静电场时，依所带电荷的符号分电场时，依所带电荷的符号分别向左偏转或向右偏转，落入别向左偏转或向右偏转，落入指定的收集器内，达到细胞分指定的收集器内，达到细胞分类收集目的。类收集目的。流式细胞仪的工作原理和基本结构流式细胞仪的工作原理和基本结构 二、二、流式细胞仪的基本结构流式细胞仪的基本结构流式细胞仪由下列基本结构组成：流式细胞仪由下列基本结构组成： 1.1.流动室与液流驱动系统流动室与液流驱动系统

6、4.4.信号检测与分析信号检测与分析 5.5.细胞分选器细胞分选器 2.2.激光光源与光束成形系统激光光源与光束成形系统 3.3.光学系统光学系统流式细胞仪的工作原理和基本结构流式细胞仪的工作原理和基本结构1 1流动室与液流驱动系统流动室与液流驱动系统（1 1）流动室：由石英玻璃制成，并在石英玻璃中央开一个孔，）流动室：由石英玻璃制成，并在石英玻璃中央开一个孔，供细胞单个流过，检测区在该孔的中心，流动室内充满了鞘供细胞单个流过，检测区在该孔的中心，流动室内充满了鞘液液, ,鞘液的作用是将样品流环包。鞘液的作用是将样品流环包。流式细胞仪的工作原理和基本结构流式细胞仪的工作原理和基本结构1 1流动

7、室与液流驱动系统流动室与液流驱动系统 样品流在鞘流的环包下形成聚焦，保证每个细胞通过激样品流在鞘流的环包下形成聚焦，保证每个细胞通过激光照射区的时间相等，从而得到准确的细胞荧光信息。光照射区的时间相等，从而得到准确的细胞荧光信息。流式细胞仪的工作原理和基本结构流式细胞仪的工作原理和基本结构11 空气泵产生压缩空气，通过鞘流压力调节器加在鞘液空气泵产生压缩空气，通过鞘流压力调节器加在鞘液上恒定的压力，鞘液以匀速运动流过流动室，在整个上恒定的压力，鞘液以匀速运动流过流动室，在整个系统运行中流速不变。系统运行中流速不变。 1 1流动室与液流驱动系统流动室与液流驱动系统流式细胞仪的工作原理和基本结构流

8、式细胞仪的工作原理和基本结构2 2激光光源与光束形成系统激光光源与光束形成系统 激光：是一种相干光源，它能提供单波长、高强度及激光：是一种相干光源，它能提供单波长、高强度及稳定性高的光照，是细胞微弱荧光快速分析的理想光源。稳定性高的光照，是细胞微弱荧光快速分析的理想光源。 流式细胞仪多采用氩离子气体激光器。流式细胞仪多采用氩离子气体激光器。 激光光束经透镜聚焦，形成短轴稍大于细胞直径的光斑，激光光束经透镜聚焦，形成短轴稍大于细胞直径的光斑，再进入流动室。再进入流动室。 流式细胞仪的工作原理和基本结构流式细胞仪的工作原理和基本结构2 2激光光源与光束形成系统激光光源与光束形成系统 细胞快速流动，

9、每个细胞经过光照区的时间仅约为细胞快速流动，每个细胞经过光照区的时间仅约为1s1s，细胞携带荧光物质所激发出的荧光信号强弱与被照射的时间细胞携带荧光物质所激发出的荧光信号强弱与被照射的时间和激发光的强度有关，因此细胞必须达到足够的光照强度。和激发光的强度有关，因此细胞必须达到足够的光照强度。 流式细胞仪的工作原理和基本结构流式细胞仪的工作原理和基本结构3 3光学系统光学系统组成：透镜、滤光片和小孔。组成：透镜、滤光片和小孔。作用：将不同波长的光信号进行分离、聚集后，送入不同的作用：将不同波长的光信号进行分离、聚集后，送入不同的光电转换和电子探测器。光电转换和电子探测器。流式细胞仪的工作原理和基

10、本结构流式细胞仪的工作原理和基本结构3 3光学系统光学系统滤光片分类：滤光片分类：（1 1）长通滤光片：使特定波长以上的光通过，长通滤光片：使特定波长以上的光通过，LPLP表示。表示。（2 2）短通滤光片：特定波长以下的光通过，短通滤光片：特定波长以下的光通过，SPSP表示。表示。（3 3）带通滤光片：允许一定波长范围内的光通过，带通滤光片：允许一定波长范围内的光通过，BPBP表示。表示。流式细胞仪的工作原理和基本结构流式细胞仪的工作原理和基本结构4 4信号检测与分析系统信号检测与分析系统系统构成：光电二极管和计算机。系统构成：光电二极管和计算机。细胞产生的激光散射信号和荧光信号照射到光电二极

11、管散射细胞产生的激光散射信号和荧光信号照射到光电二极管散射光检测器上，经转换器转换为电子信号后，输入到放大器进光检测器上，经转换器转换为电子信号后，输入到放大器进行线性放大或对数放大，计算机分析这些数字化信息，得到行线性放大或对数放大，计算机分析这些数字化信息，得到相应结果。相应结果。流式细胞仪的工作原理和基本结构流式细胞仪的工作原理和基本结构4 4信号检测与分析系统信号检测与分析系统（1 1）激）激光信号：光信号： 前向角散射：被测细胞的大小有关。前向角散射：被测细胞的大小有关。 侧向角散射：提供细胞内精细结构和颗粒性质的信息。侧向角散射：提供细胞内精细结构和颗粒性质的信息。流式细胞仪的工作

12、原理和基本结构流式细胞仪的工作原理和基本结构4 4信号检测与分析系统信号检测与分析系统（2 2）荧光信号）荧光信号 当激光光束与细胞正交时，特异荧光素标记当激光光束与细胞正交时，特异荧光素标记细胞受激发发射荧光信号，通过对这类荧光信号的检测和定细胞受激发发射荧光信号，通过对这类荧光信号的检测和定量分析能了解所研究细胞的性质和数量。量分析能了解所研究细胞的性质和数量。流式细胞仪的工作原理和基本结构流式细胞仪的工作原理和基本结构4 4信号检测与分析系统信号检测与分析系统（2 2）荧光信号）荧光信号 当激光光束与细胞正交时，特异荧光素标记当激光光束与细胞正交时，特异荧光素标记细胞受激发发射荧光信号，

13、通过对这类荧光信号的检测和定细胞受激发发射荧光信号，通过对这类荧光信号的检测和定量分析能了解所研究细胞的性质和数量。量分析能了解所研究细胞的性质和数量。流式细胞仪的工作原理和基本结构流式细胞仪的工作原理和基本结构4 4信号检测与分析系统信号检测与分析系统 荧光信号线性测量和对数测量：线性放大器的输出与输入是荧光信号线性测量和对数测量：线性放大器的输出与输入是线性关系。线性关系。 线性测量用于线性测量用于细胞细胞DNADNA含量、含量、RNARNA含量、总蛋白质含量测定。含量、总蛋白质含量测定。 对数测量：用于对数测量：用于在细胞膜表面抗原等荧光检测。在细胞膜表面抗原等荧光检测。 荧光信号的面积

14、和宽度：荧光信号的面积和宽度： 荧光信号的面积：采用对荧光光通量进行积分测量，多用于荧光信号的面积：采用对荧光光通量进行积分测量，多用于DNADNA倍体测量。倍体测量。 荧光信号的宽度：常用来区分双连体细胞。荧光信号的宽度：常用来区分双连体细胞。流式细胞仪的工作原理和基本结构流式细胞仪的工作原理和基本结构5 5细胞分选系统细胞分选系统 系统组成：水滴形成、分选逻辑电路、水滴充电及偏转。系统组成：水滴形成、分选逻辑电路、水滴充电及偏转。 （1 1）小水滴的形成：压电晶体振动使喷出的流束形成水滴，小水滴的形成：压电晶体振动使喷出的流束形成水滴，并带动流动室振动。并带动流动室振动。 喷嘴的振动频率即

15、每秒钟产生水滴的数目。喷嘴的振动频率即每秒钟产生水滴的数目。 流式细胞仪的工作原理和基本结构流式细胞仪的工作原理和基本结构5 5细胞分选系统细胞分选系统 当喷嘴直径为当喷嘴直径为50m50m时，信号频时，信号频率为率为40kHz40kHz，则每秒钟产生，则每秒钟产生4 4万个水万个水滴。若每秒钟流出的细胞是滴。若每秒钟流出的细胞是10001000个，个，则平均每则平均每4040个水滴中只有一个水滴个水滴中只有一个水滴是有细胞的，其他皆为空白。是有细胞的，其他皆为空白。 流式细胞仪的工作原理和基本结构流式细胞仪的工作原理和基本结构5 5细胞分选系统细胞分选系统 （2 2）分选）分选逻辑电路逻辑电

16、路 细胞在经过测量区时判断出哪个细胞在经过测量区时判断出哪个细胞满足了分选的条件，并产生一细胞满足了分选的条件，并产生一个逻辑信号，此信号驱动充电脉冲个逻辑信号，此信号驱动充电脉冲发生器，使之产生充电脉冲。发生器，使之产生充电脉冲。流式细胞仪的工作原理和基本结构流式细胞仪的工作原理和基本结构5 5细胞分选系统细胞分选系统 （3 3）水滴的充电与偏转水滴的充电与偏转 当水滴从流束上要断开当水滴从流束上要断开时给整个流束充电，便带有时给整个流束充电，便带有同极性的多余表面电荷。下同极性的多余表面电荷。下落的水滴通过一对平行板电落的水滴通过一对平行板电极形成的静电场时，带正电极形成的静电场时，带正电荷的水滴向带负电的电极板荷的水滴向带负电的电极板偏转，可用容器收集水滴。偏转，可用容器