巴斯德毕赤酵母新型分泌表达载体构建

1、 文章编号 :10083464(2003 01003704巴斯德毕赤酵母新型分泌表达载体构建韦宇拓 , 甘凤琼 , 苏华波 , 赵颖怡 , 汪嵘 , 黄日波(广西大学 生物技术实验中心 , 广西 南宁 530005摘要 :巴斯德毕赤酵母分泌表达载体 pP I C I NU 是利用来源于克鲁维酵母 (K luy vero m y ces m arx ianus 的菊 粉 酶 基 因 信 号 肽 DNA 序 列 (ISP 构 建 的。 表 达 实 验 结 果 表 明 , 带 有 分 泌 表 达 载 体 pP I C I NU 的 -1, 3-1, 4葡 聚 糖 酶 基 因 重 组 菌 , 具 有

2、与 带 有 表 达 载 体 pP I C 9K (带 有 因 子 信 号 肽 的 -1, 3-1, 4葡聚糖酶基因重组菌相同的分泌效率 。 关键词 :巴斯德毕赤酵母 ; 克鲁维酵母菊粉酶基因信号肽 ; 分泌表达 ; 因子信号肽中图分类号 :Q 782 文献标识码 :ACon struction of a P ich ia p astorisYu tuo , GAN Feng qi ong , SU H ua bo ,ZHAO Y ing yi , W AN G Rong , HUAN G R i bo(B i o techno logy R esearch Cen ter , Guangx i

3、 U n iversity , N ann ing 530005, Ch ina Abstract :T he secreting exp ressi on vecto r , pP I C I NU con tain ing inu linase signal pep tide (ISP from K luy vero m y ces s m a rx ianu , of P ich ia p astoris w as con structed . T he exp ressi on resu lts show ed that the secreti on efficiency of the

4、 beta1, 31, 4glucanase of recom b inan t P . p astoris con tain ing p P I C I NU w as as h igh as that of recom b inan t P . p astoris harbo ring pP I C I 9K carrying facto r p rep ro p ep tide .Key wards :P ich ia p astori ; signal pep tides of K luy vero m y ces s m a rx ianu inu linase ; secretin

5、g ex 2p ressi on ; -facto r p rep ro pep tide Bong 等研究中发现在克鲁维酵母 (K luy vero m y ces m a rx ianus 中 , 大部分菊粉酶能被分泌到胞外 , 将其先导肽用在酿酒酵母中能促进多种外源蛋白分泌到胞外 , 分泌效率高于常用的 因子信号肽 1。 因 此 , 克鲁维酵母菊粉酶信号肽可能是一种能引导外源蛋白有效分泌的信号肽 , 但将其信号肽用于促进 外源蛋白在巴斯德毕赤酵母 (P ich ia p astoris 中分泌表达国内外尚未有相关报道 。我们曾利用 因子 信号肽在巴斯德毕赤酵母中成功使 1, 31, 4葡

6、聚糖酶表达并分泌到胞外 2, 本研究利用克鲁维酵 母菊粉酶基因的信号肽序列构建新型巴斯德毕赤酵母分泌型表达载体 , 并表达 1, 31, 4葡聚糖酶 , 由此比较 因子信号肽和菊粉酶信号肽在巴斯德毕赤酵母中的分泌效率 , 为巴斯德毕赤酵母表达系统 寻找到一种新的能高效分泌外源蛋白的信号肽 。第 22卷第 1期 V o l 122, N o 11广 西 农 业 生 物 科 学 Journal of Guangxi A gric . and B i o l . Science 2003年 3月 M ar . , 2003收稿日期 :20020829基金项目 :国家高技术 863资助项目 (2001

7、AA 214171作者简介 :韦宇拓 (1971 , 男 , 广西贵港人 , 广西大学博士研究生 ; 黄日波为通讯联系人 。 1 材料和方法111材料浸麻芽孢杆菌 (B acillus m acerans 1164 购自中国科学院微生物研究所菌种保藏中心 。 巴斯德毕赤 酵母表达系统试剂盒 (M u lti -Cop y P ich ia Exp ressi on K it 购自 Invitrogen 公司 。 大肠杆菌菌株 DH 5由本 实 验 室 保 存 。 寡 聚 核 苷 酸 由 Sangon 生 物 公 司 合 成 。 核 酸 酶 购 自 大 连 T akara 。 地 衣 多 糖 (

8、lichenan 购自 Sigm a 公司 。 -1, 3-1, 4葡聚糖酶杂合基因 bg l HAM 的扩增在本实验室进行 。 112方法11211 DNA 的操作 、 重组 、 大肠杆菌的转化参照文献 3。11212分泌表达载体 pP I C I NU 的构建参照文献 1,设计并合成菊粉酶 inu linase 信号肽 DNA 序 列 (简称 ISP , 在 ISP 序列两端设计 B am H I 和 E co R I 两个酶切位点利于连接到载体 。将 ISP 片段连 接到巴斯德毕赤酵母表达系统无先导肽的表达载体 pP I C 315K 的多克隆位点上 , 并进行测序分析 , 正确 的重组

9、子即为分泌表达载体 p P I C I NU 。图 1 I SP 信号肽序列的核酸序列F ig 11 Nucleotide sequences of i nuli nase signal peptide (I SP 11213 酵母分泌表达质粒 pP I C I NU -HAM 和 p P I C 9K -HAM 的构建同文献 2,根据 Gene B ank 中 -葡聚糖酶基因的已知序列设计引物 , 以浸麻芽孢杆菌总 DNA 为模板 , PCR 扩增 -葡聚糖酶杂 合基因 bg l HAM 。 引物划线为部分 E co R I 识别位点 。上游引物 :5 -GGCGGA TCGTTTTTTGA

10、ACCTTTTAA CA GCTTTAA TCCGA GTACA -3下游引物 :5 -GCTGCAA TCA TA TTAA TTG -3PCR 产物经 E co R I 消化后分别连接到构建好的分泌表达载体 pP I C I NU 和试剂盒本身提供的分 泌 表 达 载 体 p P I C 9K 先 导 肽 的 下 游 , 重 组 质 粒 分 别 转 化 DH 5感 受 态 细 胞 , 以 含 氨 苄 青 霉 素 (100g mL 的 LB 平板筛选转化子 , 并经酶切鉴定 , 将获得重组质粒 , 分别命名为 pP I C I NU -HAM 和 p P I C 9K -HAM 。11214

11、巴斯德毕赤酵母的培养 、转化 、高拷贝菌株筛选和鉴定及重组菌的表达均参照 Invitrogen 公 司产品说明书 :M u lti -Cop y P ich ia Exp ressi on K it In structi on M anual 。11215重组菌的诱导表达分别取重组酵母单菌落 P ich ia p astoris pP I C I NU -HAM 、 P ich ia p as 2toris pP I C 9K -HAM , 以空载体 p P I C I NU 和 p P I C 9K 转化巴斯德毕赤酵母菌株 K M 71的重组酵母菌 作 对照。 重组酵母菌的培养及诱导表达于

12、10mL BM GY 培养基中 1%酵母提取物 , 2%蛋白胨 , 1134%YNB , 0100004%B i o tin , 1%甘油 (体 积 比 , 30 剧 烈 振 摇 使 细 胞 生 长 至 饱 和 状 态 (A 600=1020 , 离心收集菌体 , 加入 10mL 诱导培养基 BMM Y (用 015%甲醇代替 BM GY 中的甘 油 , 30下继续诱导培养 10d , 每 12h 取样及补加甲醇 , 维持甲醇浓度为 015%。11216重组 -葡聚糖酶酶活性测定根据文献 4,-葡聚糖酶的活力可通过检测 lichenan 经 -葡 聚糖酶作用后产生的还原糖的量来测定 。 1U

13、定义为每分钟产生 1m o l 的还原糖 (以葡萄糖为参比 所 需要的酶量 。还原糖量的测定采用 3, 5一二硝基水杨酸 (DN S 比色法 5(测三个重复样取平均值 。 分泌 -葡聚糖酶活力的测定 :取 1mL 发酵液 8000r m in 离心 5m in 后取上清测定 -葡聚糖酶的活 83广 西 农 业 生 物 科 学 第 22卷 力为分泌到胞外的酶活 。胞内酶活的测定 :菌体按文献 3加酵母破胞缓冲液至 1mL , 用 lyticase 破 胞后测定 -葡聚糖酶的活力为胞内的酶活 。11217表达产物的 SD S PA GE 分析重组酵母 30诱导培养 , 测定发酵液酶 , 酶活力最高

14、时取 1mL发酵液离心去除菌体 , 取 3L 上清液进行 SD S PA GE 分析 3。2结果分析211分泌表达载体将合成 ISP 的两条寡聚核苷酸退火后 , 用 B am H I 和 E co R I 消化后插入表达载体 pP I C 315K 的多克 隆位点 , 筛选重组子并进行测序分析 , 结果证明 ISP 片断已正确插入质粒 pP I C 315K 即得到新的分泌表 达载体 pP I C I NU 。将扩增得到的 -葡聚糖酶杂合基因 bg l HAM 用 E co R I 消化后分别连接到用 E co R I 消化的载体 p P I C I NU 和 pP I C 9K , 连接产物

15、转化 DH 5感受态细胞 , 提取质粒经酶切 、电泳鉴定获得 正向的重组质粒筛选正确方向的克隆 , 分别得到重组质粒 pP I C I NU -HAM 和 pP I C 9K -HAM 。 212巴斯德毕赤酵母的 -葡聚糖酶表达菌株将构建好的 -葡聚糖酶表达载体 p P I C I NU -和 p I C 9K YPD 平板筛 选高拷贝的重组菌 , 分别获得抗 G (2m , 分 别获得三株 -HAM 1, 2, 3和 K M 71 I NU -HAM 1, 2, 3。 213 -将 筛 选 -葡 聚 糖 酶 高 产 菌 株 以 导 入 空 白 载 体 的 重 组 菌 K M 71 pP I

16、C I NU 和K M 71 pP I C 9K 分别作为对照 (CK , 诱导培养在发酵液的 -葡聚糖酶活力最高时 , 同时取菌体破胞 后测定胞内的 -葡聚糖酶的活力 , 与发酵液的酶活相比就为先导肽的分泌效率 , 结果如表 1所示 , 信 号肽平均分泌百分比 ISP 为 9816%, 因子为 9813%。表 1 重组巴斯德毕赤酵母菌胞外和胞内 -葡聚糖酶活的比较 Table 1 The bet a -1, 3-1, 4glucanase avtiv ity of reco m bi nan t P ich ia p astoris酵母菌株Yeaststrains 胞外酶活力 A ctivi

17、ty of exoenzym e U mL -1胞内酶活力 A ctivity of endoenzym e U mL 分泌百分比 Percentage of secreti on %酵母菌株 Yeast strains 胞外酶活力 A ctivity of exoenzym e U mL -1胞内酶活力 A ctivity of endoenzym e U mL 分泌百分比 Percentage of secreti on%K M 71 pP I C I NU HAM 1 326144119818K M 71 pP I C 9K HAM 1 296124159815K M 71 pP I C

18、 I NU -HAM 2 298183199817K M 71 pP I C 9K HAM 2 28713419981371 3 25313413981371 93 243114199810平均 A verage 292184119816平均 A verage 275154189813K M 71 pP I C I NU (CK 00K M 71 pP I C 9K (CK 00结果表明所构建的分泌表达载体 pP I C I NU 和 pP I C 9K 都能够很好地分泌表达 -葡聚糖 , 而空白 对照 -葡聚糖酶活检测不到 。胞外和胞内酶活的比较表明分泌表达载体 pP I C I NU 分泌

19、效率不低于以 使用 因子信号肽的分泌表达载体 p P I C 9K 。214分泌表达产物的 S D S -PAGE 分析将重组菌诱导表达到胞外酶活最高时 , 取发酵液进行 SD S -PA GE 分析 , 结果 (图 2 表明 :因 子信号肽和 ISP 信号肽都能使 -葡聚糖酶杂合基因 bg l HAM 在巴斯德毕赤酵母中表达并分泌到发酵 液 , 两者的分子量相同与由基因序列推测所得 24KD 理论分子量基本一致 , 这表明 -葡聚糖酶杂合基 因 bg l HAM 不仅得到了表达 、 分泌 , 而且 (因子信号肽和 ISP 信号肽都能够被正切切割 。93第 1期 韦宇拓等 :巴斯德毕赤酵母新型

20、分泌表达载体构建 3讨论图 2 S D S -PAGE 12 expression by S D S -PAGE 1. 菌株 K M 71 pP I C 9k 的总分泌蛋白 ; 2. 菌株 K M 71 pP I C 9k -HAM 1的总分泌蛋 白 ; 3. 菌株 K M 71 pP I C I 的总分泌蛋白 ; 4. 菌 株 K M 71 pP I C I NU -HAM 1的总分泌蛋白 ; 5. 蛋白质标准 1. To tal secreted p ro teins of K M 71 pP I C 9k ; 2. To tal secreted p ro teins of K M 71

21、 pP I C 9k -HAM 1; 3. To tal secreted p ro teins of K M 71 pP I C I NU ; 4. To tal secreted p ro teins ofK M 71 pP I C I NU HAM 1; 5. P ro tein m arker .目前 , 有多种先导肽成功地应用于巴斯德毕赤酵母的分泌表达 , 最常用的是来源于酿酒酵母的 因子信号肽和巴斯德毕赤酵母酸性磷酸酶信号肽 , 其中以 因子信号肽最为成功 , 也是使用最广泛的先导肽 , 它能促进多种异源蛋白在巴斯德毕赤酵母中的分泌表达 6。 然而 , 信号肽对不同的异源蛋白分泌效

22、率会有很大的差异 , 有些外源蛋白甚至不能被 因子和酸性磷酸酶信号肽分泌 , 需要新的信号肽才能使外源蛋白分泌 7。 有些信号肽的分泌效率受胞内m RNA 的积累水平 、培养条件和诱导的影响 8。 因此寻找更 多有效的信号肽 , 比较不同信号肽对异源蛋白的分泌效率具有重要的意义 。本文研究利用菊粉酶的信号肽序列来构建巴斯德毕赤酵母分泌载体并表达了 -葡聚糖酶 , 结果表明 ISP 胞 外 , p P I C 9K 的 L ys -A rg , 泌 , 表达产物的信号肽能被内切蛋白酶 (endop ro tease 正确识别并切割 9。 此外 , ISP 信号肽序列仅为 25个氨基酸远小于 因子

23、的 75个氨基酸 , 这有利于减少表达载体的分子量 , 提高整合到宿主染色体上外源基因表达盒的稳定性和转录效率 。但是 I NU 能否促进其它蛋白的分泌 , 还需要作进一步的研究 。 参考文献 :1 CHUN G B H , NAM S W , K I M B M 1Comm unication to the editor highly efficient secretion of heterologous p roteins from S accharo m y cescerev isiae using inulinase signalpep tides J 1B i o techno lo

24、gyandbi oengineering , 1996, 49: 47347912苏华波 , 韦宇拓 , 黄鲲 , 等 1-葡聚糖酶杂合酶基因 bglHAM 的克隆及在 P 1p astoris 中表达 J 1广西大学学报 (自然科学版 , 2002, 27:101313 SAM BROO K J , RU SSELL D W . M o lecular C loning -A L abo rato ry M anual (th ird editi on M . C lod Sp ringH arbo r , N ew Yo rk :By C lod Sp ring H arbo L abo rato ry P ress 1200114 AND ER SON M A , STON E B A . A new substrate fo r investigating the specificity of -lucanhydro lates J 1FEBS L etters , 1975, 52:20220715张龙翔 , 张庭芳 , 李令媛 . 生化实验方法和技术 (第 2版 M 1北京 :高等教育出版社 , 199716 CER EGH I NO J