去甲二氢愈创木酸对胶质瘤细胞诱导的内皮细胞迁移的影响

1、    去甲二氢愈创木酸对胶质瘤细胞诱导的 内皮细胞迁移的影响        摘要目的观察去甲二氢愈创木酸（NDGA）对胶质瘤细胞诱导的内皮细胞迁移的影响。方法采用微孔滤膜培养小室及双室细胞联合培养法，进行人脐静脉内皮细胞系ECV-304细胞与人恶性胶质瘤细胞系SHG-44细胞的联合培养，并以免疫组化SP方法检测SHG-44细胞血管内皮生长因子（VEGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）的表达。结果100 mol/L 的NDGA作用13 d后，SHG-44细胞V

2、EGF、bFGF 的表达明显降低。100 mol/L NDGA对内皮细胞的非定向运动有明显抑制作用，对胶质瘤细胞及其条件培养基诱导的内皮细胞定向迁移抑制显著（P<0.01）。在50、100、150、200 mol/L 的实验浓度范围内，其抑制作用呈明显量效关系（抑制率各为12.0%，37.4%，86.7%和82.2%）。结论NDGA对内皮细胞的非定向运动和胶质瘤细胞诱导的迁移均有抑制作用，并可降低瘤细胞血管生成因子的表达，提示NDGA具有抗血管生成的作用。关键词去甲二氢愈创木酸；神经胶质瘤；内皮，血管；共同培养The effect of nordihydroguaiaretic acid

3、 on endothelial cell migration induced by glioma cellsSUN HuiqinBIAN Xiuwu CHEN YishengSHI Jingquan（Department of Pathology, Third Military Medical University, Chongqing 400038, China）AbstractObjectiveTo investigate the effect of nordihydroguaiaretic acid (NDGA) on the migration of endothelial cells

4、 (ECs) induced by glioma cells (GCs) in vitro. MethodsCells of human umbilical vein endothelial cell line ECV-304 and human malignant glioma cell line SHG-44 were co-cultured in the Falcon Cell Culture Insert system, and the effect of NDGA on the migration of ECs induced by GCs was investigated. The

5、 expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) and basic fibroblast growth factor (bFGF) was examined with immunohistochemistry. ResultsThe expressions of VEGF and bFGF in SHG-44 cells were reduced after treatment with 100 mol/L NDGA for 1 to 3 days. 100 mol/L NDGA significantly inhibited

6、not only the chemotactic migration of ECs induced by either glioma cells or glioma-conditioned media, but also the random motility of ECs (P<0.01). NDGA at a concentration between 50 mol/L and 200 mol/L inhibited the chemotactic migration of ECs in a dose-dependent manner (the inhibition ratios w

7、ere 12.0%，37.4%, 86.7% and 82.2%). ConclusionThe results confirm the inhibitory effects of NDGA on the migration and angiogenic factor expression of ECs, which suggests that NDGA may suppress angiogenesis of glioma.Key wordsNordihydroguaiaretic acid;Glioma;Endothelium, vascular;Coculture恶性胶质瘤是临床难以根治

8、的原发性肿瘤之一，血管增生活跃不仅是该瘤的病理特征，也是该瘤发展的重要原因。近年来，肿瘤血管生成的理论研究和实践都得以迅速的深入和开展1，2。我们在应用去甲二氢愈创木酸（nordihydroguaiaretic acid，NDGA）抗胶质瘤研究时，发现它能明显减少移植瘤及诱发瘤的血管生成。在肿瘤血管生成中，内皮细胞向肿瘤细胞移行是实现肿瘤血管生成的重要环节，阻止此步的发生即能有效控制肿瘤血管生成。因此，我们就NDGA对内皮细胞及胶质瘤细胞诱导的内皮细胞迁移的影响进行了研究。材料与方法一、细胞培养、胶质瘤条件培养基的制备人脐静脉内皮细胞系ECV-304(引自美国组织培养库，ATCC CRI-19

9、98)和人恶性胶质瘤细胞系SHG-44细胞（引自苏州医学院附属第二医院脑肿瘤研究室）。分别在含10%新生小牛血清、双抗（青霉素100 U/ml，链霉素100 g/ml）的M199和RPMI 1640培养基（Gibco公司产品）中常规培养。等量的SHG-44细胞分别在含NDGA液(终浓度为100 mol/L)和等体积PBS（pH 7.2）的含0.5%新生小牛血清的M199液10 ml中培养24 h，取上清，离心，0.22 m微孔滤膜过滤，分别标记为条件培养基1、2（CM1,CM2），-20保存备用。二、NDGA对胶质瘤细胞血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)蛋白表达影

10、响的观察经NDGA(终浓度为100 mol/L) 或 PBS（pH 7.2）处理后13 d的SHG-44 细胞，经4%多聚甲醛固定，采用SP法（Zymed公司产品）进行VEGF、bFGF（PcAb,120, Santa Cruz 公司产品）的免疫组化染色。三、迁移实验1微孔滤膜培养小室及双室联合培养系统：双室联合培养结构见1。应用微孔滤膜培养小室，进行胶质瘤细胞与内皮细胞的联合培养，可以更接近体内环境，模拟瘤细胞对血管内皮细胞的作用，滤膜上8 m的微孔可允许内皮细胞穿过到达膜的下面，这些穿越迁移的内皮细胞可粘附于膜的下面，通过计数滤膜下面的细胞可基本反映细胞的迁移情况。1双室联合培养示意2SH

11、G-44细胞诱导的迁移实验：用已长满的SHG-44细胞消化后制成悬液，用含10%新生小牛血清的RPMI 1640培养基调节其细胞浓度为1×105个/ml。对不同胶质瘤细胞相关的试验：分别按每孔细胞数为0、1×105个的量传入12孔培养板内，补加含10%新生小牛血清的RPMI 1640培养基至2 ml/孔，置于孵箱内培养。5 h后待细胞贴壁，吸出培养基，以D-Hanks液洗2次，加入含0.5%新生小牛血清M199或含100 mol/L NDGA及0.5%新生小牛血清 M199液，入孵箱内培养。对不同浓度NDGA相关的试验：按每孔细胞数为1×105个的量传入12孔培养

12、板内，培养5 h后吸出培养基，以D-Hanks液洗2次，加入含0.5%新生小牛血清 M199或各含50、100、150、200 mol/L NDGA的0.5%新生小牛血清 M199液2 ml/孔，入孵箱内培养。每组3孔，并至少重复3次试验。18 h后取出，装配PET微孔滤膜培养小室（上室，Falcon Cell Culture Insert，Becton Dickinson公司产品）入12孔板（下室）内，同时消化生长良好的内皮细胞，调整其浓度为105个/ml，每个小室内加入0.1 ml (1×104个细胞)，轻轻振荡使之分布均匀，放入孵箱内进行胶质瘤-内皮细胞的联合培养。6 h后取上

13、室，以棉签拭去小室滤膜上的内皮细胞。PBS洗后将小室置于95%乙醇中固定10 min，PBS洗5 min 2次，苏木素染色25min，水洗，或再加伊红染35min，蒸馏水洗后倒置于普通显微镜下随机计数（×100）13个视野内的膜下面细胞数。同时计算细胞迁移的抑制率：细胞迁移的抑制率=（对照组迁移细胞数-NDGA组迁移细胞数）/对照组迁移细胞数×100%。3胶质瘤条件培养基引起的迁移实验：将已制备的条件培养基CM1、CM2（含NDGA 100 mol/L）以1 ml、2 ml的量加入12孔培养板内，补加含0.5%新生小牛血清 的 M199培养基，使每孔2 ml。消化内皮细胞，

14、调其浓度为1×105个/ml，每个小室内加入0.1 ml(1×104个细胞)，轻振荡，入孵箱内培养6 h取出，后续处理步骤，方法同上。四、数据统计学处理数据以均数±标准差(±s)表示, 采用Microsoft Excel提供的统计程序,进行t检验。结果1NDGA对SHG-44细胞VEGF、bFGF蛋白表达的影响：SHG-44细胞VEGF、bFGF 蛋白表达均较强，主要定位于瘤细胞的胞质。NDGA处理细胞13 d后，SHG-44细胞VEGF、bFGF 蛋白表达的阳性减弱, 如25。2NDGA对内皮细胞的移行和胶质瘤细胞诱导的内皮细胞迁移的影响：传入微孔滤膜

15、培养小室的内皮细胞与在培养板内相似，可很快贴壁生长。当下室无SHG-44细胞时，移行至膜下的内皮细胞多在10个左右。当下室有SHG-44细胞存在时，迁移的细胞数明显增加（6）。而经100 mol/L NDGA处理24 h后，内皮细胞的迁移数较对照组明显减少（7），差异有显著性（8，P<0.01）。当下室有一定量的胶质瘤细胞存在时，50、100、150和200 mol/L的NDGA处理组迁移抑制率分别为12.0%，37.4%，86.7% 和82.2%；迁移的内皮细胞数随NDGA浓度的增加而减少，除50 mol/L NDGA组外，与对照组比差异均有显著性（9，P<0.05）。3NDGA

16、对胶质瘤细胞条件培养基诱导的内皮细胞迁移的影响：加入条件培养基对内皮细胞作用6 h后，CM1表现出对内皮细胞更强的吸引作用，细胞计数显著高于CM2组，差异有显著性（P<0.01），说明在存在NDGA（100 mol/L）的情况下，SHG-44细胞产生的迁移因子减少，对内皮细胞的诱导作用减弱，而CM含量多少之间也显示出明显差异，见10。2对照组48 h SHG-44细胞VEGF蛋白表达较强SP法×2003NDGA组48 h SHG-44细胞VEGF蛋白表达减弱SP法×2004对照组72 h SHG-44细胞bFGF蛋白表达强SP法×4005NDGA组72 h

17、SHG-44细胞bFGF蛋白表达减弱SP法×4006SHG-44细胞与ECV-304细胞联合培养，见较多迁移至微孔滤膜()下面的内皮细胞(EC)苏木素染色×2007SHG-44细胞与ECV-304细胞联合培养，并加入NDGA，见少数散在迁移至微孔滤膜()下面的内皮细胞(EC)苏木素染色×2008NDGA对内皮细胞迁移的影响9不同浓度NDGA对内皮细胞迁移的影响10胶质瘤细胞条件培养基对内皮细胞迁移的影响讨论NDGA作为脂氧化酶的强抑制剂具有抗氧化作用。最早是将其作为添加剂用于抗食物腐败之中，近年来发现其有抗肿瘤作用3-6，引起了许多学者的关注，但至今尚不清楚其抗肿

18、瘤机制。我们在应用NDGA进行抗胶质瘤的研究中，发现其在显著抑制胶质瘤细胞生长、诱导其分化的同时，也明显抑制了移植瘤、诱发瘤内的血管生长。近年来，肿瘤血管生成的研究已成为肿瘤研究的热点及策略问题。肿瘤的生长、转移与肿瘤诱导的血管生成密切相关，而通过抑制血管生成进行抗肿瘤治疗，是肿瘤治疗中最有前途的方法之一1，2。脑胶质瘤能产生一些促血管生成的物质，如VEGF、bFGF、aFGF、内皮细胞生长因子、转化生长因子和血小板源生长因子等。它们能通过不同机制从多种途径刺激血管生成7，多数因子对血管内皮细胞的增生存在作用，bFGF、VEGF 、内皮细胞生长因子等因子还可引起内皮细胞迁移8，而内皮细胞的移行

19、在肿瘤血管生成中亦具有重要作用。只有通过内皮细胞向瘤组织内移行，才能实现肿瘤的血管生成，从而为迅速生长的肿瘤提供充足营养物质及氧气。因此，抑制内皮细胞向肿瘤细胞内移行，同样也能达到抑制肿瘤生长的目的。Yassini等9采用联合培养的方法证明胶质瘤细胞能引起内皮、纤维母细胞的趋化移行。我们利用微孔滤膜培养小室，也成功地进行了胶质瘤细胞-内皮细胞的联合培养，同时观察了NDGA对胶质瘤细胞及其条件培养基诱导的内皮细胞迁移的影响。我们发现在胶质瘤细胞存在的情况下，可引起内皮细胞的迁移；同样采用胶质瘤细胞的条件培养基，也可见内皮细胞的明显移行，说明SHG-44细胞产生了一些对内皮细胞的趋化因子（包括可溶

20、性因子），从而引起内皮细胞向胶质瘤细胞所在区（下室）趋化移行，验证了胶质瘤细胞对内皮细胞的趋化作用。Kumar等10比较了不同生长因子对血管生成不同步骤的影响，发现肝细胞生长因子对内皮细胞的趋化作用最强，其次是bFGF、VEGF 。本研究所用的恶性胶质瘤细胞系 SHG-44细胞有较强的血管生成因子bFGF、VEGF的表达，从而也有强的对内皮细胞的趋化作用，所以联合培养时，我们观察到有明显的内皮细胞的迁移；而经 NDGA处理后bFGF、VEGF的表达降低，其趋化作用也相应减弱。所以，在存在NDGA的情况下进行的联合培养，内皮细胞迁移数减少，并随NDGA 含量的增加，其迁移减少也愈加明显。究其原因

21、，一方面，是由于NDGA抑制胶质瘤细胞的增生，瘤细胞数量减少，从整体产生血管生长因子量的降低所致；另一方面，也是由于NDGA抑制并减少了胶质瘤细胞自身表达、产生bFGF、VEGF等因子的水平降低所致。此外，本研究结果还显示了NDGA对内皮细胞自身的非定向运动也有抑制作用。这一现象是否由于NDGA可导致细胞骨架的变化以致影响内皮细胞本身的运动能力所致，尚待进一步研究。从我们既往的研究结果及本实验来看，NDGA抗胶质瘤的作用不仅针对瘤细胞本身，对肿瘤血管生成也具有作用，对此作进一步的研究可望为胶质瘤的临床治疗有所帮助。(本文编辑：常秀青)基金项目：国家自然科学基金资助项目(39570295)通信作

22、者：卞修武作者单位：孙慧勤（第三军医大学病理学教研室，重庆400038）卞修武（第三军医大学病理学教研室，重庆400038）陈意生（第三军医大学病理学教研室，重庆400038）史景泉（第三军医大学病理学教研室，重庆400038）参考文献：1Folkman J. Fighting cancer by attacking its blood supply. Sci Am, 1996,275:150-154.2Lund EL, Spang-Thomsen M, Skovgaard-Poulsen H, et al. Tumor angiogenesis-a new theraeutic target

23、 in gliomas. Acta Neurol Scand, 1998,97:52-62.3Wang ZY, Agarwal R, Zhou ZC, et al. Antimutagenic and antitumorigenic activities of nordihydroguaiaretic acid. Mutat Res, 1991,261:153-62.4卞修武，史景泉，辛榕, 等. 去甲二氢愈创木酸对人恶性胶质瘤细胞系SHG-44生长和分化的影响. 中华病理学杂志，1997，26:285-288.5McCormick DL,Spicer Am. Nordihydroguaiaretic acid suppression of rat mammary carcinogenesis induced by N-methyl-N-nitrosourea. Cancer Lett， 19