吡啶诱导白毛真菌三孢布拉氏霉菌生物合成番茄红素的调节E.P

1、 吡啶诱导白毛真菌三孢布拉氏霉菌生物合成番茄红素的调节E.P.Feofilova,V.M.Tereshina,and A.S.Memorskaya微生物研究所，俄罗斯科学学会，pr.60-letlya Oktyabrya 7,k,2,Moscow,117811 Russia,1994年10月8号摘要：吡啶诱导刺激三孢布拉氏霉菌生物合成番茄红素。6-甲基-2氨基吡啶被证明是最有效的刺激剂。利用放线菌和放线素是基因调节从头合成的刺激反应器。6-甲基-2氨基吡啶在三孢布拉氏霉菌合成类胡萝卜素中的作用是抑制环化酶和一些脱氢酶，刺激类胡萝卜素前体和一种抗氧化剂的合成。6-甲基-3-乙基-3-羟基吡啶是一

2、种抗氧化剂，在加入6-甲基-2氨基吡啶的条件下，产生一种作用刺激生物合成番茄红素。提出了三孢布拉氏菌合成番茄红素中可能的生物作用。 在现代生物工艺学中，被称为化学生物调节器的特殊复合物的利用是获得次生代谢物的一种有效方法，例如：-紫罗酮，三孢酸和VA通过白毛真菌三孢布拉氏菌增加-胡萝卜素产量10-15倍。 前几年，另一种类胡萝卜素番茄红素，由于它好的抗氧化作用，在生物工艺学和药学中吸引了特殊的关注。它还被用做天然染料，把食品染色成红色和桃红色。番茄红素的化学合成与微生物合成相比，在经济上较差，工业复合过程较好。三烃基铵氯化物和吡啶这些生物调节剂在植物、真菌和细胞中的使用抑制胡萝卜素的生物合成，

3、增强了番茄红素的产率。相似研究表明，-胡萝卜素的超级生产物，即三孢布拉氏霉菌，在工业上是用来生产-胡萝卜素的。生物调节剂的使用使番茄红素的产量增至1.0-1.5g/l（培养基）成为可能，但是，生物调节剂的作用机理还不明确。阻止了生物工程的更进一步发展。由于这个原因，我们工作的目的是寻找新的生物合成番茄红素的刺激剂，并阐明该合成过程和刺激剂的化学结构之间的关系，以及寻找一个新的方法来阐明三孢布拉氏霉菌在生物合成番茄红素中的刺激作用的机理。材料与方法这项实验中使用了三孢布拉氏霉菌菌株（+）-A-732和（-）-A-732（由A.I.Kiseleva提供）。该菌丝体在添加了2%的葵花子油的玉米-大豆

4、培养基，并在26-29。C，摇床（230-240r/min）作用下生长.该真菌在含有50ml该培养基的250ml容量瓶中生长。（+）/（-）孢子比例为1：15的孢子悬液被用作接种体。 -胡萝卜素和番茄红素的含量是通过Unicam SP 1800分光光度计测得，或者使用丙酮提取真菌生物量，再用正己烷提取类胡萝卜素之后使用SF-56 LOMO分光光度计测量；根据Brockman在4中的描述，在Al4+培养皿中用薄层色谱法测量。后者常用于测定-胡萝卜素、八氢番茄红素、六氢番茄红素、-胡萝卜素和链孢红素的含量；在4中出项的E值是用于计算这些多烃的含量的。 三孢布拉氏霉菌菌丝体的碳水化合物的分析 在沸水

5、中煮二十分钟后，提取四次碳水化合物。使用Dowex-50W(H+)和Dowex-1（醋酸盐形式），通过离子交换色谱法移出蛋白质，然后将纯化的蛋白质样本低压冻干。碳水化合物然后转化为三甲基甲硅烷衍生物，用5%的SE-30缓和的红色硅藻色谱载体装成的两米玻璃柱,使用气-液色谱法验证，用3700-模式气-液色谱和从170到270。C温度梯度。肌糖，葡萄糖，海藻糖，甘露糖，蔗糖，棉子糖被作为测定标准。 吡啶诱导剂和二氮氯圜的合成方法在3中描述过。抗氧化剂（亚诺抗氧化添加剂、6-已氧基二氢2，2，4-三甲基喹啉、VE、6-甲基-3-已基-3-羟基吡啶）由E.B.Burlakova和L.A.Vakulov

6、a提供。每个实验做了三到四次。表中的数据代表了实验结果的平均值。结果和讨论 首先，我们研究了向生物合成番茄红素的发酵培养皿中加入刺激剂的最佳时间。在以前的实验中，三孢布拉氏霉菌的生长和在已用培养基中生物合成番茄红素的动力学已经研究。三孢布拉氏霉菌的生物量在培养的第46-53h停止。到这个时间，菌丝体的合成量已经大约为-胡萝卜素在繁殖期最后合成量的一半。-胡萝卜素最强烈的合成期为第二到第三天，并且生长过程强度有一个大的增长。 在含有2%的葵花子油的玉米-大豆培养基中三孢布拉氏霉菌和-胡萝卜素数量的动态（1）生物量；（2）-胡萝卜素根据在4，6中的数据，生物合成番茄红素的刺激剂是2-氨基吡啶。这种

7、复合物在生长的29h，46h，53h，77h加入到三孢布拉氏霉菌培养基中，阐明加入刺激剂的最佳时间。表1 三孢布拉氏霉菌生物合成番茄红素中加入2-氨基吡啶的时间的作用注：C标准；E试验；下标代表2-氨基吡啶的加入时间；所有的试验都做96h。 在培养的第53h向发酵培养基中加入生物合成番茄红素的刺激剂，得到这种类胡萝卜素的最高产率（表1）。数据在表一中显示，首先，在二氨基吡啶的作用下三孢布拉氏霉菌最强烈的生长菌丝与成熟的菌丝相比，合成了相当小数量的番茄红素。其次，与控制条件相比这种刺激剂轻微的抑制了幼小菌丝的生长和类胡萝卜素（番茄红素和-胡萝卜素）的生物合成。同时，在加入二氨基吡啶的条件下由菌丝

8、体转换为染色相（46h），从而生物合成类胡萝卜素的量有所增长。实验结果表明这种生物调节剂不仅改变了类胡萝卜素的组成，增加了番茄合成的生物合成，而且刺激了这种菌丝体在一定生长阶段生物合成番茄红素。表2 三孢布拉氏霉菌生物合成番茄红素中吡啶的作用注：在加入吡啶诱导物的菌丝体中胡萝卜素和番茄红素的含量 各种吡啶诱导物对生物合成番茄红素的作用的研究证明了吡啶杂环的化学作用（表2）。因此甲基群的介入双倍的提高了番茄红素的产率。在6位置上多一个甲基对番茄红素的生物合成无效。在4位上的第三个甲基使二氮陆环的集中减少了一半，这种变体提供了集中力。在吡啶杂环上的一个氨基介入也可双倍的减少这种刺激剂的集中。然而,

9、取代氨基在杂环上的位置有显著的作用（与2-和4-氨基吡啶相比）。在三孢布拉氏霉菌生物合成番茄红素中2，6-氨基吡啶最为有效。 在吡啶杂环上含有氨基和甲基的（特别是在2和6位置）吡啶诱导剂对生物合成番茄红素有显著的刺激。在这种情况下，生物合成胡萝卜素的阻凝剂的集中会减少十倍。以前，报道在杂环上的苯甲酰、N-氧化物、乙炔基或者在或位置上引入第二个杂环对番茄红素的生物合成无效。哌啶氢氧化物（1g/l）与2-氨基吡啶的刺激作用相当。 向上面所说的，除了取代吡啶外，许多三烃基铵氯化物刺激诱导番茄红素的生物合成；然而，它们作用的机理还不清楚。尽管它们的化学结构不同，这些复合物还是被认为阻止了番茄红素的环化

10、和转化为-和-胡萝卜素。表3 三孢布拉氏霉菌生物合成类胡萝卜素中DPA和PD的作用（菌丝体生长的第5天）菌丝体在含有0.05%酵母的培养基中生长；培养24h后加入DPA 0.7×10-4M。CP-胡萝卜素（八氢番茄红素和六氢番茄红素）的无色前体。 在吡啶的诱导作用下，特别是6-甲基-2氨基吡啶，由三孢布拉氏霉菌合成类胡萝卜素的分析显示了生物合成的诱导剂不仅是番茄红素，而且是链孢红素和-胡萝卜素和八氢番茄红素和六氢番茄红素无色前体的诱导剂（表3）。在PD作用下合成类胡萝卜素总的数量比在检验下高。 在PD作用下由三孢布拉氏霉菌菌丝体合成多烯烃的数据显示这些复合物不仅刺激了胡萝卜素前体，包

11、括无色的前体，而且阻止了脱氢酶。在这些考虑下，PD的作用类似于二苯胺的作用（表3），他阻止了-胡萝卜素的生物合成，并且刺激链孢红素、无色多烯和类胡萝卜素前体。因此，PD刺激番茄红素和多烯烃（八氢番茄红素、六氢番茄红素、链孢红素和八氢番茄红素等等），PD抑制环化酶和脱氢酶，特别是移动了氢原子使八氢番茄红素转变为八氢番茄红素。为了阐明PD对生物合成类胡萝卜素酶的作用机理，这些抑制剂的水平，特别是6-甲基-2氨基吡啶，应该说明操作过程。我们研究了放线酮和防线菌D，生物合成蛋白质和核酸的抑制剂，特别是转化和复制。向加入了生物合成番茄红素刺激剂的三孢布拉氏霉菌中加入放线酮（50l/ml）,显著抑制了番茄

12、红素的生物合成（PD作用下7060l/ml，加入放线酮后234.2l/ml）。表明，放线酮抑制了-胡萝卜素的生物合成，但是使番茄红素增长3-4倍。表4 三孢布拉氏霉菌生物合成-胡萝卜素和番茄红素中CHI和AD的作用注：C-5353h 的菌丝体，C-7777h的菌丝体；C-53+CHI-C-77在培养53h后加入CHI中生长。在其它试验中，在培养53h后加入6-甲基-2-氨基吡啶或AD。AD(20g/ml)产生了不同的作用，这种核酸的抑制剂也抵抗PD的作用抑制了番茄红素的生物合成，但是比CHI更少，实际上不影响-胡萝卜素的产率。然而在有PD存在时AD对生物合成-胡萝卜素的抑制能力更显著（表4）。

13、这些数据表明，PD影响生物合成蛋白质是在转化水平。考虑CHI高的集中，我们提出OD可能抑制基因调控了生物合成番茄红素的特定酶的生物合成。因此，获得的结果显示PD不仅抑制胡萝卜素-合成酶的生物合成，而且刺激番茄红素合成酶的从头合成。在有PD的情况下，合成类胡萝卜素的数量要高些，并且番茄红素的数量要高100倍。在同一个实验中-胡萝卜素的数量没有变，与向菌丝体中加PD前-胡萝卜素的含量是相当的。考虑到最后的假定，番茄红素含量在有CHI和PD的情况下与只有CHI相比的轻微增加，值得考虑。这个现象可解释为，三孢布拉氏霉菌的细胞质和核糖体结合膜的不同蛋白质合成作用，或者由于CHI在膜组织中mRNA的部分稳

14、定。表4中的结果显示AD在复制水平上抑制番茄红素的生物合成，而PD部分释放AD的抑制能力。有趣的是与-胡萝卜素相比，番茄红素的生物合成中AD抑制的复制产生了更显著的作用。加AD后在三孢布拉氏霉菌中番茄红素的产率的降低可能与AD部分抑制转化有关，这个在14中描述过。氮杂-和5-卤素的吡啶诱导剂基质被认为是抑制核酸的生物合成。许多复合物，例如：叶酸，消除这些吡啶诱导剂的作用。表5 三孢布拉氏霉菌生物合成-胡萝卜素和番茄红素中5-嗅尿嘧啶（0.05g/l）的作用注：5-BU5-嗅尿嘧啶。表5中的结果显示，在有PD的条件下，核酸生物合成的抑制剂对-胡萝卜素和番茄红素的生物合成无效，但是降低了类胡萝卜素

15、的产率嗅尿嘧啶最有效。这个符合物抑制了酶的生物合成，可能是依靠DNA的RNA聚合酶2，从而影响蛋白质和环化酶的从头合成。与催化脱氢酶的作用相比，番茄红素成环为-和-胡萝卜素是一个敏感的氧化反应8。因此，我们假设一定的氧化物能调节番茄红素环化为-胡萝卜素。表6 三孢布拉氏霉菌生物合成-胡萝卜素和番茄红素中抗氧化剂的作用注：MEHP6-甲基-3-已基-3-羟基吡啶。抗氧化剂假如的最终浓度为0.1g/l。为了验证这个假设，我们研究了各种各样的氧化物（AO），例如：VE，甲氯喹啉，亚诺抗氧化添加剂和6-甲基-3-已基-3-羟基吡啶（MEHP），把这些加入培养基中抵消生物合成番茄红素的刺激剂（表6）。6

16、-已氧基二氢2，2，4-三甲基喹啉、亚诺抗氧化添加剂和VE抑制了生物合成番茄红素。利用MEHP获得的结果不同；这个氧化物，根据以前获得的数据5，与上述的氧化物截然不同，能够刺激真菌的生长，对类脂物膜产生抗氧化作用，它的性质与天然真菌抗氧化物相近。在加入PD后加入MEHP，它增加合成类胡萝卜素的总产率，并且刺激生物合成番茄红素。MEHP的加入是为了对在PD作用下生物合成番茄红素产生一种额外的作用。MEHP对生物合成-胡萝卜素也产生一种额外的作用；然而，这个刺激作用对生物合成番茄红素不是很显著。在这次工作中，我们研究了吡啶诱导剂对生物合成番茄红素的作用，并揭示了最显著的刺激作用与氨基和甲基组出现在

17、吡啶杂环2位置的关系。获得了PD刺激作用机理的数据。这些复合物，特别是2-氨基-6-甲基吡啶增加番茄红素和多烯烃（链孢红素和八氢番茄红素、六氢番茄红素）的产率。这些让我们假定PD不仅抑制番茄红素环化酶环化成-胡萝卜素，而且影响类胡萝卜素脱氢的作用，例如，影响脱氢酶。用生物合成蛋白质和核酸的抑制剂发现PD很可能作用在核糖体mPNA转化水平上。考虑到这些，PD与-紫罗酮、三孢酸和VA相似。加如氧化剂，特别是MEHP，增加生物合成番茄红素，然而允许我们假定在三孢布拉氏霉菌番茄红素的生物作用。-胡萝卜素是三孢酸、异宗配合的真菌激素苛尔蒙的前体，因此，它通过受精卵形成，着手性的重建。在培养基中引入中毒的PD可能会导致一个应力。在这种情况下，生长和重新产生的过程会很快阻止7，可能是由于番茄红素替代-胡萝卜素的生物合成。我们假定生物合成番茄红素由抑制和刺激环化酶的从头合成来调节，特别是由加入相应的氧化物提供的脱氢酶。表7 由含有三孢布拉氏霉菌的碳水化合物生物合成番茄红素中，刺激剂的作用注：C053h的菌丝体；C170h的菌丝体；C1+6-M-2-AP在培养53h后加入刺激剂的70h菌丝体；C2+6-M-2-AP在培养53h后加入刺激剂的84h菌丝体；C284h的菌丝体；