实验室检测技术概要

1、 实验室常用检测技术简要介绍主要内容主要内容概述概述 疾病鉴别诊断过程疾病鉴别诊断过程n临床症状和大体病变检 病料的采集及处理 实验室检验病料中细菌的检测病料中细菌的检测病料中病毒的检测病料中病毒的检测一 、疾病鉴别诊断过程u临床标本的采集及处理 原则n合理的采样时机n正确的采样方法n适宜的采样部位一 、标本采集 尽量在病程的早期采集；标本应放置无菌容器中；标本应做适当的标记，如动物、地点、时间、暂定的诊断等。1 唾液在生理理盐水中常加0.5%明胶或BSA，以保护不稳定病毒。 2 鼻、咽及肛门拭子 3 粪便标本4 脑脊髓液、心包液、尿液等 5 尸体材料 死后应尽早获取，无菌采取，不使用防腐剂。

2、 不同病毒所取材料不同，如NDV，取脑、气管，FMV取肺、PRRS取肺、SFV取淋巴结等。二 标本的保存和运送 尽量活体送检，大部分病毒不稳定，必须尽快送实验室；如有延误，则标本必须冷藏，到实验室立即处理和接种，延误时间短的，可置4；时间延误较长，置-70。 如邮寄标本则需放置有干冰的保温箱内。三 标本处理1 体液 可以直接接种、检测2血标本 凝固血离心后的血清即可用于检测3各种拭子 4粪便标本 5 组织材料u病原学检测常用的实验室技术n分离培养分离培养 （“金标准金标准”）n形态学检查形态学检查 （病毒（病毒 电镜镜检）电镜镜检）n细菌的生化试验细菌的生化试验n动物实验动物实验n免疫学诊断技

3、术免疫学诊断技术 ELISA IFA 免疫组化免疫组化n分子生物学诊断技术分子生物学诊断技术 PCR 荧光定量荧光定量PCR二、病料中细菌的检测方法n细菌的形态学检查n细菌的分离培养n细菌的生化试验n动物试验n血清学试验n分子生物学方法光学显微镜下细菌的形态细菌的形态观察光镜和电镜的比较大肠杆菌葡萄球菌电镜镜检光学显微镜镜检培养结果初次分离纯培养鉴别培养不乳糖发酵乳糖麦康凯平板麦康凯平板 不发酵乳糖的细菌大肠杆菌，呈现黑色金属光泽EMB平板平板 SS平板平板 大肠杆菌或者别的发酵乳糖的肠杆菌 有黑色中心的是沙门氏菌。如果没有黑色中心，就很可能是志贺氏菌了。不发酵乳糖的肠道菌，可能就是志贺氏菌。

4、 不发酵乳糖的某种肠道菌，而且产生硫化氢，可能是沙门氏菌 发酵乳糖的某种肠杆菌。 HE（苏木素伊红（苏木素伊红)琼脂平板琼脂平板 本培养基倾注平皿待冷却后呈草绿色，质控菌株接种后。361培养1824h，观察结果 。大肠杆菌部分被抑制，橙黄色-橙红色。葡萄球菌生长被抑制。革兰氏染色革兰氏阳性革兰氏阴性n染色原理及过程：染色原理及过程：初染初染（结晶紫）媒染媒染（碘液）脱色脱色（ 95酒精）复染复染（复红）细菌的生化试验硫化氢试验糖发酵试验MR试验VP试验靛基质试验药敏试验示意图药敏试验示意图测量抑菌圈测量抑菌圈 涂布细菌涂布细菌贴上药敏纸片贴上药敏纸片12温箱培养温箱培养34以大肠杆菌为例：1.

5、剖检（采集病料）2.纤维素渗出物的涂片染色3.分离培养（普通营养琼脂平板、麦康凯琼脂平板或伊红美兰琼脂平板）4.培养物涂片G染色5.生化试验6.动物试验7.血清学实验 玻板凝集鉴定血清型三、病料中病毒的检测电镜技术电镜技术血清学试验血清学试验分子生物学技术分子生物学技术病毒的分离鉴定病毒的分离鉴定标本采集与送检标本采集与送检病毒分离和鉴定的一般程序病毒分离和鉴定的一般程序 常用检测方法n分离培养n血清学 中和试验 补体结合试验 血凝及血凝抑制试验 免疫扩散试验 n免疫学诊断技术 ELISA IFA 免疫组化n分子生物学检测 PCR 分子杂交技术 病毒分离病毒分离标本采集标本采集杀灭杂菌杀灭杂菌

6、（青链霉素青链霉素）接种接种鉴定病毒种型鉴定病毒种型易感动物易感动物出现病状出现病状鸡胚鸡胚病变或死亡病变或死亡细胞培养细胞培养细胞病变细胞病变三大方法三大方法 1 1动物接种动物接种病毒的分离与鉴定病毒的分离与鉴定 2鸡胚培养鸡胚培养3 3组织培养组织培养病毒中和试验 本实验极为特异和敏感，是病毒学中重要的血清学实验。主要用于病毒感染的血清学诊断、病毒分离株的鉴定、不同病毒株的抗原关系研究、疫苗免疫原性的评价、免疫血清质量的评价以及实验动物中是否存在相应的抗体等。virus补体结合反应 AgAb红细胞红细胞溶血素溶血素补体补体AbAg红细胞红细胞补体补体溶血素溶血素溶血溶血 （-）不溶血不溶

7、血 （+）免疫扩散 电镜技术鸡痘病毒（超薄切片）鸡痘病毒（超薄切片）狂犬病毒包涵体狂犬病毒包涵体（Negri body）ELISA分类ELISA Procedures分子生物学方法nPCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶链反应) n荧光实时定量PCR （real time PCR）nNASBA （依赖核酸序列的扩增）PCRPCR原理原理: :实质就是实质就是体外基因体外基因复制复制技术技术Mg2+dCTPdGTPdUTPdATPTaq DNA聚合酶聚合酶 AmpErasePrimer靶序列靶序列加热变性加热变性95 C靶序列引物退火靶序列引物退火55 C引物延伸引物

8、延伸72 C原理图示一二三 完成一个循环3030次循环后靶序列扩增的数量次循环后靶序列扩增的数量No. ofNo. Amplicon CyclesCopies of Target122438416532664201,048,576301,073,741,8241 cycle = 2 Amplicon2 cycle = 4 Amplicon3 cycle = 8 Amplicon4 cycle = 16 Amplicon5 cycle = 32 Amplicon6 cycle = 64 Amplicon7 cycle = 128 Amplicon 特异性荧特异性荧光双标记光双标记探针探针 Taq

9、酶酶 5353外切酶活外切酶活性性染料法的优点染料法的优点：成本低不需要探针；适合初步筛查先用SYBR筛查，再用TaqMan精确定量部分关键样品；融解曲线鉴定PCR有无杂带、引物二聚体；染料法的缺点染料法的缺点：无模板特异性 不能分辨主带与杂带，给出的是总信号；不能做多重检测 每孔只能检测一个目标基因；灵敏度低适合于5000 拷贝以上的基因定量。与DNA结合时发光游离时不发光SYBR Green I染料法染料法举例：举例：基于结核分枝杆菌插入序列IS1081，建立SYBR Green荧光定量PCR方法。实验结果：图2.3：标准曲线引物二聚体1copy图2.4 融解曲线10copies/uL1copy/ul阴性对照105copies/ullL107copies/