免疫组化SP法与SABC

1、ABC 法: ABC 代表的是亲和素一生物素一过氧化物酶复合物。 利用抗生物素分 别 连接生物素标记的第二抗和生物素标记的酶。 但是此法注意内源性生物素活性的 消除，以减少非特异性的染色。SP 法：是采用生物素标记的第二抗体与链霉菌抗生物素蛋白连接的碱性磷酸酶 及底物色素混合液来测定细胞或组织中的抗原。PA 是一种金黄色葡萄球菌细胞壁分离的蛋白质，它能与各种动物的 IGG 的 FC 段结合，在免疫组化中可作为桥 抗体或标记抗体。最大的优点是不受种属的特异性 限制。此法还具有染色时间 短、灵敏度高、背景染色淡等优点，分子量小，易于穿透组织。两者本质的区别是：SABC 法的“三抗”是 SABC 复

2、合物即链酶亲和素-生物素- 过氧化物酶复合物；而 SP 法的“三抗”是过氧化物酶直接与链酶亲和素相连的，没有通过生物素的中介连接。SABC 步骤：切片常规脱蜡、脱 水；30% H2O 比蒸馏水 10 份混合，室温 510 分钟以灭活内 源性酶，蒸馏水洗；将切片浸入 0.01M 枸橼酸盐（PH6.0）,微波炉加热至沸腾 后断 电，间隔 10 分钟，反复两次进行热修复抗原；滴加 5%BSA 封闭液，室温 20 分钟；滴加一抗，37C1小时 30 分钟孵育；滴加生物素化山羊抗小鼠 IgG，室温下 20 分钟，PBS（ PH7.2 7.6 ）洗；滴加试剂 SABC 室温下 20 分钟，PBS 洗 5分

3、钟X4次；DAB 显色：取 1ml 蒸馏水，加试剂盒中 A，B，C 试剂各 1 滴，混 匀后加至切片，室温显色 18 分钟；苏木素轻度复染；脱水，透明封片。显微镜 下观察。免疫组织化学又称免疫细胞化学， 是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原 位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应， 对相应抗原进行定性、 定位、 定量 测定的一项新技术。 免疫组织化学的方法有多种， 其实都大同小异， 不同点只是 在于显色基团！SP 法1 ）脱蜡、水化；2）PBS 洗 23 次各 5 分钟；3）3%HO （80 和醇）滴加在 TMA 上，室温静置 10 分钟；4）PBS 洗 23 次各 5 分钟；5）抗原修复

4、；6）PBS 洗 23 次各 5 分钟；7）滴加正常山羊血清封闭液，室温 20 分钟。甩去多余液体。8）滴加I抗 50 卩 l，室温静置 1 小时或者 4C过夜或者 37C1小时。9） 4C过夜后需在 37C复温 45 分钟。10）PBS 洗 3 次各 5 分钟；11）滴加U抗 4050 卩 I，室温静置，或 37C1小时;12）II 抗中可加入 0.05%的 tween-20 。13）PBS 洗 3 次各 5 分钟；14）DAB 显色 510 分钟，在显微镜下掌握染色程度；15）PBS 或自来水冲洗 10 分钟；16）苏木精复染 2 分钟，盐酸酒精分化；17）自来水冲洗 1015 分钟；18

5、）脱水、透明、封片、镜检。SABC 法I ）脱蜡、水化。2） PBS 洗两次各 5 分钟。3） 用蒸馏水或 PBS 配置新鲜的 3%HO，室温封闭 510 分钟，蒸馏水洗 3 次。4） 抗原修复。5） PBS 洗 5 分钟。6） 滴加正常山羊血清封闭液，室温 20 分钟。甩去多余液体。7） 滴加I抗， 室温 1 小时或者 4C过夜或者 37C1小时 （4C过夜后在 37E复温 45 分钟）。8） PBS 洗三次每次 2 分钟。9） 滴加生物素化二抗，20r37r20 分钟。10）PBC 洗 3 次每次 2 分钟。II）滴加试剂 SABC， 20r 37r20 分钟。12）PBS 洗 4 次每次

6、 5 分钟。13）DAB 显色：DAB 显色试剂盒或者自配显色剂显色（镜下掌握显色程度）。14）蒸馏水洗。苏木素复染 2 分钟、盐酸酒精分化。15）脱水、透明、封片、镜检。二者区别 ：sp 法是：一抗+生物素化二抗+ HRP 标记的链霉卵白素（HRP 标记的亲和素）酶标亲和素-生物素技术（labelled avidin-biotintechnique，简称 LAB 法）。即用辣根过氧化物酶直接标记 avidin ，用 biotin 标记 2 抗。关键步骤为 3 步：Ag +Ab1 + （Ab2-B） +A（A为 HRP 标记的卵白素）A与 2 抗的生物素结合，avidin 起桥联作用。如 将该

7、法中的卵白素（avidin ）变换成链霉卵白素 （streptavidin ），LAB 法即 成 LsAB法，或称 SP 法。据认为 LAB 法比 ABC 法敏感 24 倍，而 LsAB 法因 streptavidin不与组织细胞中内源性生物素结合而特异性更高。现在 SP 法已趋于取代 ABC 法而广为应用。sabc 法是：一抗生物素化二抗 abc 复合物（是使用前亲和素与酶联生物素现 配使用）亲和素 - 生物素 - 过氧化物酶复合物技术（ avidin-biotin-peroxidase complextechnique，简称 ABC 法）。关键的程序步骤为 3 步：Ag +Ab1 +（ A

8、b2-B）+AB C 复合物（Ab2-B 为生物素标记的第二抗体）（B 为生物素标记的过氧化物酶）ABC复合物是 avidin 与酶联 biotin 1 比 1 在使用前 30min 配置，混匀。 1 个 avidin 分子结合了 3 个 biotin 分子，剩下 1 个结合点与 2 抗的生物素结合， avidin 起 桥联作用。ABC 法敏感性更高，比 PAP 法敏感 2040 倍，背景也更清晰。个人理解：SP 法和 SABC 法相差不大，一般都可以用.SP 法：一抗+ 生物素标记二抗 + 辣根酶标记链霉卵白素 + 辣根酶底物显色SABC 法: 一抗+生物素标记二抗+滴加试剂 SABC 链霉

9、卵白素+辣根酶标记生物素）+辣 根酶底物显色比较可知，SABC 法 SP 法在原理上基本是一样的。但由于 SABC 法第 3 步有放大作用，所以更灵敏一些.可能会出现用 SABC 法可以做出结果的，用 SP 法做不出 来.总的来说，个人认为 SABC 法可能好一些！我自己以及周围的同学以前一般都 是选用SABC 法！SP 法1 脱蜡水化2 蒸馏水中 5 分钟3 用蒸馏水或 PBS 配置新鲜的 3%H2O2 室温封闭 10 分钟蒸馏水洗 1 次4 抗原修复5PBS 洗 5 分钟6 滴加正常山羊血清封闭液 ,室温 10 分钟7 甩去多余液体滴加 1 抗 37 度 1 小时或者 4 过夜 4 过夜后

10、 37 复温 45 分钟8PBS 洗 2 次各 5 分钟9 滴加生物素化抗孵育条件参见所用试剂盒10PBS11 滴加酶标抗体孵育条件参见所用试剂盒12PBS 洗 2 次各 5 分钟13DAB 显色 510 分钟在显微镜下掌握染色程度14 蒸馏水洗终止染色苏木素复染盐酸酒精分化1 5 脱水透明封片镜检洗 2 次各 5 分钟SABC 法1 脱蜡水化2 蒸馏水中 5 分钟3 用蒸馏水或 PBS 配置新鲜的 3%H2O2 室温封闭 5-10 分钟蒸馏水洗 1 次 4 抗原修复5PBS 洗 5 分钟6 滴加正常山羊血清封闭液室温 10-20 分钟甩去多余液体7 滴加 1 抗,37 度 1 小时或者 4 过夜 4 过夜后在 37 复温 30 分钟8PBS 洗 2 次每次 5 分钟9 滴加生物素化二抗孵育条件参见所用试剂盒10PBC 洗 2 次每次 5 分钟11 滴加试剂 SABC 孵育条件参见所用试剂盒12PBS 洗 2 次每次 5