大蒜细胞SOD酶的提取分离与活性测定

1、大蒜细胞socB的提取别离与活性测定目的1 .掌握SODB的提取、别离、检测一般步骤.2 , 了解酶在提取过程中的两个参数：回收率、纯化倍数.试齐I大蒜,磷酸缓冲液(PH7.8, 0.05mol/l)(PH8.3),氯仿一乙醇混合液冷丙酮,邻苯三酚,浓盐酸方法1 . SOES取：称取5g大蒜蒜瓣,参加石英砂研磨破碎细胞,参加 15mlPH7.8、 0.05mol/L的磷酸缓冲液,研磨搅拌20分钟,使SO而分溶解,6000rpm离心, 弃去沉淀,得上清液.(留出1ml备用,准确量取剩余上清液体积,记录)2 .除杂蛋白：提取液参加1/4体积的氯仿乙醇混合液搅拌10分钟,6000rpm 离心15mi

2、n去沉淀,得粗酶液.(取1ml粗酶液备用,精确测量剩余粗酶液体积) 3.SOD酶的沉淀别离：剩余的粗酶液中参加等体积的冷丙酮,搅拌15min, 6000rpm 离心15min,得到SOD!沉淀.将沉淀先加2ml磷酸缓冲液,溶解后在加3ml混 匀.6000rpm离心15min,取上清得到SOD8液.取1ml备用,其余量取体积.2.大蒜SOD勺提取液活性测定提取液、粗酶液、酶液中SOD舌力检测,1)溶液中可溶性蛋白含量测定：分别从1ml备用的提取液、粗酶液、酶液各取 0.3ml按以下倍数稀释,260nm/280nm测定吸光值,按公式计算蛋白质浓度.提取液稀释:50 X粗酶液稀释:20 X酶液稀释：

3、10 X蛋白质浓度(mg/ml)=(1.45A 280 - 0.74A 26.)X稀释倍数计算酶活力单位 U/ml=2 (OD1-OD2 X 5/0.11ml反响液中,每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率到达 80%寸的酶量总活力U= 舌力单位x总体积比活力U/mg= 舌力单位/蛋白质浓度纯化倍数=fi酶液酶液比活力/提取液比活力 回收率=粗酶液酶液总活力/提取液总活力试验结果记录：1试剂管OD1OD2空白管对照管提取液粗酶液酶液光吸收值A00.0810.0410.0680.0132蛋白质含量的测定:提取液粗酶液酶液光吸收值A260nm0.4350.7600.185光吸收值A280nm0.3060.5

4、100.1443提取液：酶活力单位 U/ml = 4.0总活力U = 41.2蛋白质浓度mg/ml = 6.09 比活力 U/mg = 0.6568粗酶液：酶活力单位U/ml = 1.3总活力U = 12.78蛋白质浓度mg/ml = 3.542 比活力 U/mg = 0.3670酶液：酶活力单位U/ml = 6.8总活力U = 65.96蛋白质浓度mg/ml = 0.719 比活力 U/mg = 9.45764粗酶液：纯化倍数=0.56回收率=0.31酶液：纯化倍数=14.40回收率=1.60实验结果讨论：粗酶液的实验结果较为正确,操作较为得当,试剂添加较为合理.但是酶液的 纯化倍数较大,而且,回收率好似不太正确,值偏大,可能是添加试剂时的量 不太准确,或可能与添加了过多的石英砂有关.或者是离心时有局部液体渗出 导致引入误差.下次实验应多加注意,小心用量与操作细节与步骤,