常见问题汇总

1、蛋白&抗体篇1. WB的泛抗体实验中，为什么总是出现只有一条带的情况？答：(1)首先要确定这条带的大小；比如，组蛋白H3的信号会很强，经常出现在17kD左右，如果曝光时间短的话，很可能只存在信号强的条带；(2)上样量是否足够；(3)抗体浓度是否正确使用；(4)荧光底物不灵敏，可调整荧光底物的孵育时间、曝光时间等。2. WB实验中是否条带越多，蛋白修饰的丰度越高？答：(1)客户提到的修饰丰度指什么，是一种蛋白的修饰强弱，还是指修饰的广谱性？(2)同一样品，不同处理的对比，可以这么说；(3)不同样品，不同来源，无可比性；(4)条带的强度，可以体现该条带大小的蛋白修饰丰度高。3. 能否用泛抗

2、体检测单一蛋白/IP复合物的修饰信号？答：我们公司的蛋白质修饰泛抗体是指可以识别所有含该类修饰的蛋白质的抗体，与组蛋白位点特异性修饰抗体的区别在于不局限于某个蛋白的某个位点。如Lys三甲基化的修饰泛抗体可以识别所有含有Lys三甲基化的蛋白，而组蛋白H3K4Me3就只能特异性的识别组蛋白H3第4位Lys的三甲基化修饰。因此泛抗体是可以用来检测单一蛋白/IP复合物的修饰信号。4. 抗体产品用途；如是否可以做ChIP ? IP效果如何？答：(1)抗体可以用来做 WB，ELISA，Dot，IP，IF（免疫荧光）等；(2)我们的泛抗体可以用来做肽段水平的IP且效果非常好，但不建议直接做蛋白水平的IP，效

3、果不是很好，客户用我们的位点特异性抗体尝试做过IP，结论是可以的；(3) ChIP：我们没有用自己的抗体专门做过相关的检测，但我们也准备对此进行验证。5. 抗体可以做免疫组化么？答：免疫组化，是应用免疫学基本原理抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究。我们的抗体是可以做免疫组化、WB、ELISA等实验。6. 蛋白的提取，特别是枯草芽孢杆菌，发酵菌组蛋白提取的关键？答：组蛋白提取的方法大同小异，题目中提到的2类菌株我们暂时没有提过。除了结核杆菌等传染性或致病

4、菌，需要客户经过专业处理后提供蛋白液外，其它样本一般建议客户直接把样品寄来，我们负责蛋白提取。蛋白提取是整个组学项目中最前面、最基础的一步，至关重要，好坏直接影响后续实验结果。因此我们的技术人员经过不断实践总结摸索出的蛋白的提取要点也是公司的技术资源、财富。7. 我们的泛抗体做WB的比例多少，100微升可以做多少次WB？答：我们推荐稀释比例都是1:1000，客户可以根据实际情况自行调整。8. 用乙酰化、琥珀酰化泛抗体做WB检测，客户做不出条带的原因？答：我们的乙酰化、琥珀酰化泛抗体在生产之后都有专门的质量检测，且在所有抗体销售中是销量较好、客户评价最高的两类的抗体，质量是毋庸置疑的。建议帮助客

5、户从自身WB检测的实验中找原因。9. 甲基化抗体中单甲基、二甲基、三甲基的抗体如何区分同一位点的一、二、三甲基的基团而互不交叉？答：(1) 首先，我们在抗体研发过程中，抗原多肽的合成阶段已经区分开；(2) 其次，景杰生物的所有抗体都经过了严格QC验证，甲基化抗体也不例外。通过Dot Blot和ELISA验证抗体的同一位点不同修饰和相同修饰不同位点之间是否存在交叉。10. WB显示条带丰度较好，质谱鉴定到的蛋白种类比条带丰度相对不好的蛋白种类要少？答：WB某一个条带不代表一种蛋白，而是相同分子量的一类蛋白群。因此一个丰度较好的条带里很可能既存在实际丰度高的蛋白，也存在丰度极低的蛋白，而这些丰度极

6、低的蛋白在质谱中鉴定不到是很正常的。11. WB没有看出明显变化，为什么还需要做修饰定量分析？答：(1) 首先要确定客户样品种类，比如酶类，微量变化对生物体本身都会有很大影响；(2) 同一样品不同处理存在修饰类型变化的可能。12. 修饰性WB中经常出现低质量处没有条带的原因？答：(1) 进行SDS-PAGE，看低质量处的蛋白条带丰度如何，确保蛋白的量是足够的；(2) 胶的压缩分离效果不好，低质量蛋白本身易弥散，且泳动速度快，易跑出分离胶。13. WB某蛋白有条带，但是MS没检测到该蛋白。为什么？答：(1) WB是在蛋白水平的检测，MS是基于肽段水平的检测；一般来说免疫水平的检测灵敏度是高于质谱

7、检测的；(2) WB某条带为分子量相近的一类蛋白，包含蛋白的丰度不同，有高有低；而质谱一般检测不到过低丰度蛋白；(3) 某蛋白可能数据库不全，导致MS后搜库检索不到；(4) 样品制备过程中可能存在个别肽段的丢失，导致蛋白的漏检；(5) 蛋白氨基酸序列中K或R过多或过少，导致胰酶切割形成的肽段太短或太长，而质谱有参数设置，切割肽段在7aa以下的，可信度就不高了。14. IP实验，蛋白与抗体孵育的比例是多少？答：我们建议1:20015. 做单蛋白修饰类型鉴定及位点鉴定，蛋白所需量及纯度？答：所需量：微克级；纯度：既然是单蛋白，肯定要求纯度尽可能地高，纯度的高低直接影响到鉴定结果。16. 为什么组蛋

8、白位点特异性抗体的WB中会出现杂带？答：通常情况下，组蛋白位点特异性抗体只会出现一个特定的阳性条带；但在极少数情况下，位点特异性抗体所识别的构象与较大分子量的部分序列不可避免的相近时，会出现杂带，但并不会影响检测的结果。同时，合理提高抗体的稀释比可以让杂带消失，也可以尝试降低曝光时间或将上样量进行调整。17. 你们公司的泛抗体指的是什么抗体？答：我们公司的蛋白质修饰泛抗体是相对于组蛋白位点特异性抗体而言的。泛抗体可以识别某一类含有某种修饰性氨基酸残基的蛋白质。我们公司的泛抗体种类是目前业界最齐全的，不仅有常见的乙酰化、磷酸化等泛抗体，还有世界独有的琥珀酰化、巴豆酰化、丁酰化、丙酰化、丙二酰化等

9、泛抗体。18. 以某客户的WB protocol为例，分析WB常见操作错误答：(1) 提取蛋白：注意冰上操作（保持低温环境），以及提取试剂中要加入PIC（蛋白酶抑制剂），防止蛋白提取过程中被降解；(2) 封闭：5%脱脂奶粉封闭1.5 h（用5% BSA封闭）；(3) 一抗：5%脱脂奶粉稀释。（不能用脱脂奶粉稀释，改用2.5% BSA）(4) 用1* PBST洗三次，每次10 min（漂洗次数可根据实际情况调整）；(5) 孵二抗5%脱脂奶粉稀释，371 h（二抗也要用2.5% BSA稀释，室温即可不用37）；(6) 用1*PBST洗三次，每次10 min.(7) 显色：将A液，B液等比例混合均匀

10、，孵育时要完全覆盖住膜，显色1 min（显色时间可以根据实际情况自行调整）19. 蛋白样品提取制备的注意事项？答：(1) 尽可能提取完全或者降低样本复杂物，集中提取目的蛋白；(2) 保持蛋白处于溶解状态；(3) 提取过程中防止蛋白降解、聚集、沉淀、修饰（低温操作，加入适量的蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂）；(4) 尽量去除核酸、多糖、脂类等；(5) 蛋白样品低温保存，可-80长期保存，但避免反复冻融。20. WB常见问题分析1. 背景高 解决方法(1) 膜没有完全湿透 使用100% 甲醇浸泡膜；(2) 洗膜不充分 增加洗液体积和洗涤次数；(3) 阻断不充分 增加封闭时间，或者提高温度；选择合适的封

11、闭试剂；(4) 二抗浓度过高 降低二抗浓度；(5) 检测过程中膜干燥 保证充分的反应液，避免出现干膜的现象；(6) 曝光过度 缩短曝光时间；(7) 抗体与阻断蛋白有交叉反 检测抗体与阻断蛋白的交叉反应性，选择无交叉反应 的封闭试剂；洗涤液中加入Tween-20可减少交叉反应；2 无阳性条带 解决方法(1) 抗体染色不充分 增加抗体浓度，延长孵育时间；(2) 酶失活 直接将酶和底物混合，如果不显色说明酶失活；选择有效期内有活性的酶联物；(3) 标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量低 设置阳性对照，若对照有结果但标本没有说明标本中不含靶蛋白或含量太低，可考虑增加上样量；(4)试剂不匹配 一抗与组织种属性。

12、一抗与二抗或者底物与酶系统之间不匹配，可通过设置内参照验证二级检测系统的有效性；(5)一抗失效 选择有效期内的抗体；并选择现用现配的工作液(6)HRP抑制剂 所用溶液和容器中避免含有叠氮化钠3. 阳性条带较弱 解决方法(1)抗体染色不充分 增加抗体浓度，延长孵育时间；(2)酶活性降低 直接将酶和底物混合，如果不显色说明酶失活选择有效期内、有活性的酶联物；(3)标本中靶蛋白含量太低 增加标本上样量；(4)洗膜过度 缩短洗涤时间；(5) HRP抑制剂 所用溶液和容器中避免含叠氮化钠；(6)抗体活性降低 选择在有效期内的抗体，工作液现配现用，避免长时间放置；(7)蛋白转移不充分 充分转膜；注意转膜时

13、不要将正负极放反； 注意蛋白分子量大小与转膜时间的关系（分子量较小的蛋白要缩短转膜时间，同时选择小孔径的胶；而分子量很大的蛋白则要延长转膜时间同时选用大孔径的胶）；(8)封闭过度 减少封闭剂的量或缩短时间；换用不同封闭剂；(9)曝光时间多短 延长曝光时间；4. 条带大小不对或有非特异性条带 解决方法(1)二抗的非特异性 增加对照：不加一抗，其他操作过程不变，即可验证背景是否由二抗系统来源。选择其他二抗（特异性更强的，只针对重链的）；(2)一抗特异性不够 使用单克隆或者亲和纯化的抗体，保证抗体的特异性；(3)蛋白降解 使用新鲜制备的标本，并使用蛋白酶抑制剂；(4)二聚体或多聚体存在 增加蛋白质变

14、性过程及强度；(5)抗体浓度过高 降低抗体（一抗、二抗）浓度；(6)蛋白上样量过大 降低上样量；5. 背景有斑点 解决方法(1) 封闭剂中有聚集体 使用前过滤封闭试剂；(2) HRP偶联二抗中有聚集体 过滤二抗试剂，去除聚集体；6. 膜上出现反像（暗背景上白色带） 解决方法(1) HRP含量过高 降低酶联二抗的浓度21. 我们公司的抗体优势在那里？答：(1) 我们公司有世界上最多种类的蛋白质修饰泛抗体和覆盖位点最全的组蛋白修饰的位点特异性抗体；(2) 公司在国内，也就是货期短，而且可以很方便的与客户交流，及时反馈问题；(3) 有很多文章支持，就乙酰化而言，我们发现了真核生物和原核生物中最大的乙

15、酰化组，所用抗体就是我们的抗体；(4) 最核心的一点，我们开发的所有抗体都进行了最严格、最全面的交叉检验，确保了不同修饰类型抗体间的高特异性和高灵敏度。注：别的公司抗体没有这方面的检验。21. 抗体生产的流程？答：(1) 单抗：多肽合成交联KLH为免疫原（抗原）免疫小鼠（取血检测WB、Dot、Elisa）取脾脏磨碎与骨髓瘤细胞融合（在PEG作用下融合）选择培养（HAT培养基）为融合的细胞死亡，杂交瘤细胞存活阳性克隆的筛选及克隆化克隆扩增及大量制备McAb（打腹水Protein G纯化（一步）QC检测(2) 多抗：多肽合成交联KLH为免疫原（抗原）免疫兔子（取血检测Dot,WB泛抗体时不用）检测

16、合格（大规模取血，每次取30ml，大约要150ml）纯化QC检测上市入库注：合成多肽一般15个氨基酸，抗原决定簇是3-5个氨基酸。种族的差异性越强越易产生抗体，但修饰位点固定，我们的抗体很难做，导致修饰的抗体贵。技术篇1. 胶条蛋白混合物鉴定时提供样品的注意事项？答：(1) 切取的胶条应为刚脱离浓缩胶刚刚进入分离胶的样品；(2) 跑胶的整个过程应保持干净，防止其他蛋白质的污染；(3) 若是全蛋白的鉴定，若是全蛋白的鉴定需要增加胶条的长度，待所有蛋白都分离后，将胶条分批切下。2. 蛋白修饰类型鉴定的样本要求？答：(1) 样本要求更加严格，样品量要足够，否则鉴定不出全部的修饰类型及位点；可用考马斯

17、亮蓝染色，能够看到清晰的条带方可；(2) 样品纯度要求在90%以上。3. iTRAQ常规蛋白质组学中，如果有3个以上样品相互比较，而且做生物重复，那需要做3个3标的实验。这3次实验中出现的差异怎么处理？最后得到的结论是怎么定下来的？答：因为一个iTRAQ试剂盒一次最多8标，所以，原则上3个3标，不可能同时标记完。所以样本之间相互比较和生物重复不能兼得。如果分成3次实验，那这三次出现的差异是没有意义的。4. 如何做细胞器的定量修饰组学？答：我们目前相关实验室的条件尚不成熟，很多相关的设备仪器，如差速离心机、细胞器提取试剂盒等都还没有，暂时还不可以做关于细胞器为实验材料的组学实验。5. 蛋白质组学

18、中常见样本处理方法？答：植物、动物、真菌液氮研磨 蛋白酶抑制剂细菌、可培养的细胞8mol/L Urea BufferDTT：还原二硫键 EDTA：金属酶抑制剂 超声破碎 离心、取上清 样品蛋白提取 蛋白定量与质检 iTRAQ标记 修饰组学项目 还原烷基化 沉淀蛋白 沉淀蛋白 酶解 酶解 还原烷基化 除盐与标记 IP HPLC分离 除盐 LC-MS/MS6. iTRAQ、SLIAC技术的优势？答：iTRAQ技术：(1) 可同时对多达8个样本进行定量分析，降低反复实验引入的误差；(2) 8个样品之间可进行任意两两比较，增加实验设计灵活性；(3) 为体外标记，可标记各种动物组织、植物组织、微生物、体

19、液、细胞等样本；(4) 重复性好，灵敏度高，蛋白覆盖范围广，可在单张谱图中同时进行定性与定量；(5) 标记完全，标记效率高达97%以上，等质量的同位素标签不增加样品的复杂程度； SLIAC技术：(1) 多个样品混合后同时进行分离、酶切和鉴定；后续实验对样品的影响是一致的，减少了实验操作和仪器设备引入的实验误差； (2) 体内标记技术，标记效率高达99%； (3) 应用广泛，可对多种在DMEM/DMEM-F12/1640三种培养基中培养的细胞进行标记；(4) 体内标记，标记效率不受裂解液成分影响，标记效果稳定。7. 修饰定量组学需要做生物学重复么？答：严格的来说，任何实验为确保结果的准确性都需要

20、生物学重复。但是修饰定量组学本身费用较高，客户一般也不会做重复；当客户样本数量较多时，可考虑将多个样本混合。8. 数据分析包括哪些内容？如何看？答：分析主要包括GO分析（biological process, cellular compartment, molecular function）、Protein domain分析、Cellular pathway分析与Protein complex 分析。具体分类见“生物信息学分析内容分类”表，里面有详细的标注。9 如何做iTRAQ修饰定量，我需要提供组织有多大？细胞要多少个呢？答：首先，做修饰定量，本身要求蛋白量要比普通组学要高，建议客户提供尽可

21、能多的样品。其次，不同的组织，蛋白丰度不同，不能一概而论，下面提供的为最低值供参考。(1)动物组织：不低于100mg(2)植物组织：保证研磨后不低于1g(3)细胞：一般细胞修饰定量最好用SILAC，选择用iTRAQ做的多是一些不可传代的原代细胞，无法SILAC标记，因此提供的是细胞沉淀，要求细胞数5*107-1*108。10. 组织内包括血管、血液等杂质细胞，如何保证数据结果不受这些杂质细胞的影响呢？答：动物组织样本中的内部血管是无法完全除去的，但我们可以通过用PBS等缓冲液清洗处理，去掉溶血的部分等杂质，尽可能地除去杂质细胞，无法除去的内部血管等对结果的影响可以忽略不计。11. 血液可以做修

22、饰定量组学吗？答：血液的组学一般分为三大类：(1) 全血；(2) 血细胞：红细胞、白细胞、淋巴细胞（含B细胞、T细胞等）等；(3) 血清12. HPLC是按照什么来分组的？答：我们用的HPLC，是通过一个固相材料为C18的反相柱，根据蛋白或肽段疏水性来分离的。疏水性越小的越早洗脱下来，疏水性越大的后洗脱下来。如果说这是一个明的分组，那么在质谱进样前，通过LC-MS还会有一个看不到的分组，原理是一样的。13. 单一蛋白的修饰是否可以做定量？答：我们目前做的定量都是基于标记、对比的，也就是基于组学水平的。单一蛋白非要做定量的话，应该是所谓的非标定量，我们暂时不涉及。14. 单一蛋白修饰鉴定的技术策

23、略是什么？答：胶内酶解后质谱分析。15. 样本做组学，但没数据库（植物）怎么办？答：只能用来源最接近的种属数据库来搜库，但提供的实验结果仅供参考。16. 常见的修饰分别对应多少质量位移答：17. 看到你们公司网站上，乙酰化抗体偶联树脂有普通和优质2种，而且价格差别很大，请问是为什么？规格是多少？我如果做IP的话，一次需要用多少？答：优质的乙酰化抗体偶联树脂是同时偶联了来自不同克隆株的乙酰化的单抗和多抗，抗体识别范围扩大，从而增加了树脂的捕捉抗体能力。而普通树脂只用了乙酰化的单抗。我们的树脂规格是0.25ml的干树脂溶在含有50%甘油的slurry里，总体积是0.5ml, 偶联的抗体可高达1 m

24、g（4mg/ml），相当于10支标准包装的乙酰化泛抗体（2880 元/支。100微升），所以说优质树脂售价14380元是性价比很高的。每个树脂可以做15次IP, 一次只需用15微升左右，可以用于1-2mg的肽段溶液样品。18. 用你们公司的抗体偶联树脂，进行蛋白富集，然后进行WB鉴定或质谱鉴定可以么？答：(1) 首先，我们的抗体偶联树脂适用于修饰性肽段的富集，也可以用于直接的蛋白富集，但效果不佳，我们也不建议这么做。原因蛋白是大分子，直接用抗体偶联树脂来富集很困难，修饰性的抗体及偶联树脂都是识别被修饰的肽段残基，对于整个蛋白而言，修饰性位点可能在蛋白表面，也可能被蛋白三维结构包裹在内部，这样抗

25、体及其树脂是很难识别到的。而蛋白经酶解后的肽段，修饰位点可以完全暴露在外面，肽段分子量很小，非常利于富集。(2) 其次，您如果是想鉴定目的蛋白某种修饰的有无，我们建议您直接用我们的修饰泛抗体进行WB鉴定，或者将蛋白进行SDS-PAGE，胶内酶解后鉴定。19. 你们的平台所用仪器是什么？答：我们有Thermo Scientific的Orbitrap Elite，QE等先进质谱仪器，都是目前市面上性能最好的。加上高水平的技术团队和生物信息学分析队伍，我们的平台绝对值得您的信赖。20. 做单一蛋白或混合物鉴定的流程是什么？对样品有什么要求？怎么收费？答：(1) 流程：分离纯化酶解HPLC质谱分析(2

26、) 样品要求：要求蛋白样品经SDS-PAGE鉴定，考染清晰；割胶时需注意无菌操作；寄送样品时冰袋（低温）环境。(3) 收费：根据样品不同，1500-2000元/胶条。21. 翻译后修饰定量的流程是什么？可以保证通量么？项目周期多长？价格上有无优惠？答：1. 根据样品的不同，我们一般采用2中不同的方法：(1) iTRAQ方法：可以同时在体外对8种不同蛋白质样品加上同位素标签，然后等量混合样品，酶解后进行质谱分析。流程：蛋白质混合酶解iTRAQ标记HPLC质谱分析。(2) SILAC方法：细胞在稳定同位素标记的培养基中培养，细胞经6代传代后，细胞的所有蛋白质被轻、重稳定同位素标记。等量混合标记稳定

27、同位素的蛋白质，酶解后进行质谱分析。流程：细胞SLIAC标记培养提蛋白混合酶解HPLC质谱分析。2. 物种不同，生理病理条件不同，同种修饰均有可能不同，因此很难预测修饰组学鉴定的通量，尤其对WB检测表明修饰的底丰度和新修饰种类而言。但是，对一些常见的修饰类型，如乙酰化修饰，就哺乳类细胞样品和组织而言，在样品合格的前提下，我们可以保证有1000个Kac位点的鉴定。而且我们的技术水准是有保证的，我们的许多客户在影响因子很不错的期刊杂志上发了文章。3. 对定量蛋白质组学而言，体外iTRAQ标记需要20个工作日；体内SILAC标记需要30个工作日。另外，质谱和抗体富集也都需要大约一周的时间。因此蛋白质

28、组学项目在4050个工作日内，蛋白质修饰组学项目在6070个工作日内完成。4. 关于项目报价，我会请负责您所在区域的技术服务销售工程师尽快和您联系，他会根据样品和实验设计，在他权限范围内，给出您最优惠的价格及详细的报价单。22. 一对细胞做蛋白质组学，用SLIAC做需要4W，而用iTRAQ做只需2*9400元，那我为什么不选择iTRAQ方法？答：可以从两者的技术优势区别来分析，SLIAC是体内标记，标记效率不受裂解液成分影响，标记效果稳定，且多个样品混合后同时进行分离、酶切和鉴定，可以后续实验对样品的影响是一致的，减少了实验操作和仪器设备引入的实验误差，但它最大的劣势在于只能用于细胞样本。而i

29、TRAQ最大的优势在于体外标记，标记范围可标记各种动物组织、植物组织、微生物、体液、细胞等样本。对于可以传代培养，用SLIAC标记的细胞样品，肯定优先选择SILAC，而对于一些不可传代的原代细胞，无法SILAC标记，只能提供细胞沉淀，用iTRAQ。23. 比较iTRAQ和SILAC技术答：1. SILAC定量主要是在一级质谱，iTRAQ主要是在二级质谱定量；2. SILAC是体内标记，需要在进行材料培养的时候就加入标记，主要使用在动物或植物细胞培养的过程中，针对其他类型的组织等样品不适用，但是iTRAQ是体外标记，是将蛋白质提取后再进行标记，可以适用几乎所有材料样品；3. 两者的定量准确性及蛋白分辨率方面差