溶菌酶及其应用

1、Lysozyme Action Lysozyme Action And Application And Application 溶菌酶及其应用溶菌酶及其应用 05生物技术生物技术 江浩江浩 81050423 溶菌酶的诞生溶菌酶的诞生 溶菌酶的分子结构溶菌酶的分子结构 溶菌酶的种类溶菌酶的种类 影响溶菌酶活性的因素影响溶菌酶活性的因素 溶菌酶的作用溶菌酶的作用 溶菌酶的应用溶菌酶的应用 溶菌酶溶菌酶（Lysozyme，EC3.2.1.17）又称细胞壁质酶（Murami dase）或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶（N-Acetyl muramide Glycanohydralase）。在人和动物的多种组

2、织、分泌液及某些植物、微生物中均发现了溶菌酶的存在。随着研究的不断深入，发现不仅有溶解细菌细胞壁的溶菌酶，还有作用于真菌细胞壁的种类，同时对其作用机制也有了更进一步的了解。近几年，人们根据溶菌酶的溶菌特性，将其应用于医疗、食品防腐、畜牧及生物工程中，具有一定的应用价值。 亚历山大弗莱明(Alexander Fleming)，1881年8月6日出生于苏格兰艾尔郡洛奇菲尔德。他是苏格兰农民的后裔，家境贫寒。 因发现了青霉素以及它对多种传染性疾病的治疗作用，荣获1945年诺贝尔生理学或医学奖。1922年的一天，正在感冒的英国细菌学家Alexander Fleming发现，把一些鼻粘液加入细菌的培养基

3、后会引起细胞的溶解。而这种存在于鼻粘液中的能杀死细菌的重要物质被认为是一种酶， Fleming命名其为溶菌酶（ Lysozyme ）。 溶菌酶相对分子质量为14.6X103，由129个氨基酸组成的单肽链蛋白质，含有4对二硫键。 溶菌酶分子近椭圆形，大小为4.5nmX3.0nmX3.0nm。它的构象比较复杂，螺旋仅占25%，在分子的一些区域有伸展着的片层构象。 在1965年,David Phillips和他在牛津的同事以0.2nm分辨率的X射线晶体（X-ray crystallography）结构分析法阐明了溶菌酶的三维结构(tertiary structure)。 其三维立体结构主要是由多肽链

4、借助于各种次级键盘绕成具有特定走向的紧密球状结构，维持这种结构的作用力主要是氢键力、范德华力、疏水作用力和盐键力。 溶菌酶的三溶菌酶的三维立体结构维立体结构 按其作用可分类按其作用可分类 按出处分类按出处分类 1.1.细菌细胞壁溶菌酶细菌细胞壁溶菌酶 作用于-1，4糖苷键的细胞壁溶解酶 另一种是作用于肽“尾”和酰胺部分的细胞 壁溶解酶 2.2.真菌细胞壁溶菌酶真菌细胞壁溶菌酶 酵母菌细胞壁溶解酶 霉菌细胞壁溶解酶。 按出处分类按出处分类 1. 1. 鸡蛋清溶菌酶鸡蛋清溶菌酶 鸡蛋清溶菌酶占蛋清总蛋白的3.4%3.5%，作为溶菌酶类的典型代表，是目前重点研究的对象，也是了解最清楚的溶菌酶之一。它

5、由18种129个氨基酸残基组成，具有4个S-S键，分子量为14 000，等电点为11.1，最适温度为50，最适pH值为67，其化学性质非常稳定，在pH1.211.3范围内剧烈变化时，结构仍稳定不变。遇热也很稳定，在pH47、100处理1min不失活，是一种稳定的碱性蛋白质，但在碱性条件下对热稳定性较差。 其它鸟类如鹌鹑、珍珠鸡、火鸡等的蛋清中也分离纯化出溶菌酶，与鸡蛋清溶菌酶活性非常相似，也由129个氨基酸组成，虽排列顺序有所不同，但活性部位的氨基酸排列则大体相同。 2. 2. 人及哺乳动物溶菌酶人及哺乳动物溶菌酶 人溶菌酶存在于眼泪、唾液、鼻粘液、乳汁等分泌液以及淋巴腺、白血球、肝、肾、淋巴

6、组织中，1ml眼泪中含7mg溶菌酶，1ml乳汁中含0.10.5mg。人溶菌酶由130个氨基酸残基组成，有4个S-S键，分子量为14 600，其溶菌活性比鸡蛋清溶菌酶高3倍。 对于哺乳动物溶菌酶，目前已从牛、猪、猫、兔、猴、马、羊等动物的乳汁中分离出溶菌酶，其化学性质与人溶菌酶相似，但结构尚不清楚，其溶菌活性也远低于人溶菌酶约3 000倍。曾林（1999）采用琼脂平板法测定家兔初乳溶菌酶含量。结果表明：初乳溶菌酶含量为（7.962.01）g/ml，常乳溶菌酶含量(5.011.32)g/ml。人及哺乳动物溶菌酶的作用机制与鸡蛋清溶菌酶相同。 3. 3. 植物溶菌酶植物溶菌酶 目前已从木瓜、无花果、

7、芜菁、大麦等植物中分离出溶菌酶，其分子量较大，约为24 00029 100。植物溶菌酶对溶壁小球菌的溶菌活性不超过鸡蛋清溶菌酶的1/3，但对胶体状甲壳质的分解活性则是鸡蛋清溶菌酶的10倍。周泽文（1994）从菜心分离溶菌酶表明，酶比活力达3 414. 6U/mg，纯化倍数为197.4。菜心溶菌酶在较宽的温度和pH植范围内均有活性，最适温度为60，最适pH值为5.8。高向阳（1997）研究了萝卜溶菌酶对白色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆3种革兰氏阳性菌和变形菌、大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏杆菌、多杀巴斯德氏杆菌、雏白痢沙门氏菌、产气杆菌6种革兰氏阴性菌及酿酒酵母、总状毛霉、黑根霉、黑曲霉、青霉5种真

8、菌的抑菌效果。同时还研究了萝卜溶菌酶对白菜软腐病菌、柑橘溃疡病菌、番茄青枯病菌、水稻细条病菌、水稻白叶枯病菌及烟草青枯病菌6种植物病原细菌的抑菌效果。试验证明：萝卜溶菌酶对上述参试的菌种都有不同程度的抑菌作用。 4. 4. 微生物产生的溶菌酶微生物产生的溶菌酶 目前微生物产生的溶菌酶分为7类：内N-乙酰已糖胺酶，此酶同于鸡蛋清溶菌酶，破坏细菌细胞壁肽聚糖中的-1，4糖苷键；酰胺酶，切断细菌细胞壁肽聚糖中NAM与肽“尾”之间的N-乙酰胞壁酸-L-丙氨酸键；内肽酶，使肽“尾”及肽“桥”内的肽键断裂；-1，3、-1，6葡聚糖酶和甘露聚糖酶，此酶分解酵母细胞的细胞壁；壳多糖酶，与葡聚糖酶共同作用，可分

9、解霉菌和酵母；磷酸甘露糖酶，与葡甘露糖酶共同作用，可分解原生质；脱乙酰壳多糖酶，主要分解毛霉和根霉。 5. 5. 噬菌体产生的溶菌酶噬菌体产生的溶菌酶 该酶是一种特异性的酶，由噬菌体感染、诱导产生，但未被感染的宿主细胞上不存在该酶。 影响溶菌酶活性的因素影响溶菌酶活性的因素 1. 1. 温度对溶菌酶活性的影响温度对溶菌酶活性的影响 Weaver等发现在60以上牛乳中的溶菌酶活性下降。Hayase等发现溶菌酶通过二硫键聚合，180时聚合和降解同时进行，当200时肽键的断裂和重组发生，聚合和降解变得更为剧烈。Genentech和Genencor两公司用遗传工程的方法生产出一种改性T4溶菌酶，此酶中

10、有一个新的二硫键，这个键通过稳定酶的四级结构而增加了溶菌酶的热力学稳定性，使其在食品防腐方面更为有效。 Frasco等用红外光谱研究了溶菌酶的热变性机理，发现它是和水结构密切相关的。其它外侧非极性氨基酸残基对变性无重要影响，从外侧极性氨基酸游离出的水在其始变性过程中起重要作用，水进入内部肽-肽键中，使蛋白质膨胀和伸展。研究者们假定变性通过减少蛋白质结晶化、增加整个表面积和可利用的极性水合位促进水变构，这使肽-肽键向肽-水键转化，引起进一步的蛋白膨胀和伸展，当水加入体系时，其它水形成分子单层直至达到新加入的水不再影响蛋白电荷的层数为止。 2. pH2. pH对溶菌酶活性的影响对溶菌酶活性的影响

11、溶菌酶在酸性pH下是稳定的，此时100的加热对溶菌酶仅有很小的活性损失，Matsuoka等报道pH4.5（100、3min）、pH5.29（100，30min）的加热溶菌酶是稳定的。Beychok等报道溶菌酶在pH5.5最为稳定，Cunningham等，Gorini等均发现溶菌酶在酸性时稳定，在碱性时不稳定的试验结果。 3. 3. 化学物质对溶菌酶的影响化学物质对溶菌酶的影响 Back等研究表明糖和聚烯烃类能增加溶菌酶的热稳定牲，Hidaka等发现NaCl对溶菌酶也有抗热变性作用，同时Kravchenko等发现盐溶液的存在对溶菌酶的活性是十分必要的， Chang的研究也发现溶菌酶的活性在低盐浓

12、度时和离子强度密切相关的， 在高盐浓度时溶菌酶的活性受到抑制， 阳离子的价态愈高则其抑制作用愈强。Yashitake等发现具有-COOH和-SH3OH基的多糖对溶菌酶活性有抑制作用。 4. 4. 加工过程对溶菌酶活性的影响加工过程对溶菌酶活性的影响 Schaich发现溶菌酶和过氧化甲基亚油酸盐一起培养，导致蛋白质溶解度的下降和增加了溶解部分的分子量，Schaich等后来发现是由于在溶菌酶中产生了游离基，而导致其和过氧化的甲基亚油酸作用，研究表明溶菌酶中游离基浓度随水活性的上升而下降，其原因可能是因为基团的重构和交换。Funes等继续进行溶菌酶和过氧化甲基亚油酸的作用研究，发现铁在一个冷冻干燥的

13、模拟体系中溶菌酶在空气中和过氧化甲基亚油酸作用，有聚合、生物活性损失和其它化学变化。Kanner等发现溶菌酶和过氧亚油酸的反应生成了二聚和高聚体；多聚是因为随水活性增加共价键交联度、蛋白质不溶性和酶活性损失增加引起的。 .5 5 络合作用对溶菌酶活性的影响络合作用对溶菌酶活性的影响 溶菌酶可和许多物质形成络合物导致其活性丧失。Fleming等（1924）报道了等量蛋清和蛋黄的混合物其溶菌酶无活性，Hartsell报道脱水整蛋仅保留部分溶菌酶活性，Cunningoham等研究表明蛋黄在pH6.2磷酸盐缓冲液中使纯溶菌酶失活，他们观察发现蛋黄污染蛋清仅有两个离子交换色谱峰，而不是无污染的3个峰。P

14、arkinson报道了整蛋的色谱分离时无溶菌酶。研究者认为抑制机理是在溶菌酶和蛋黄化合物间形成静电相互作用的络合物所致。N-乙酰葡萄糖胺的（1-4）键多聚物是溶菌酶的底物，它们间形成一聚、二聚、三聚、四聚体，是溶菌酶的抑制剂。Imoto分析了SDS和溶菌酶的相互作用，NMR、荧光和UV谱表明在没有引起酶分子整个构象变化的情况下它们之间形成稳定的络合物。XRD分析表明SDS结合到活性位上强烈抑制了溶菌酶活性，除此之外其它和溶菌酶形成络合物的物质有：胸腺泡核、酵母泡核、甲状腺素、甲状腺球蛋白、-La、咪唑核吲哚衍生物。阳离子如Co2+、Mg2+、Hg2+、Cu2+等均可抑制溶菌酶的活性（10-31

15、0-2mol/l）。 溶菌酶的作用溶菌酶的作用 .1 1 抗菌消炎抗菌消炎 溶菌酶是一种能水解粘多糖的碱性水解酶，此类粘多糖是细菌细胞壁的主要成分之一，该酶能催化水解细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡萄糖之间的-1，4糖苷键，使细胞壁不溶性多糖分解成可溶性糖肽，细菌内容物逸出而使细胞壁溶解。溶菌酶能直接水解革兰氏阳性菌，在分泌型免疫球蛋白A、补体的参与下，还能水解革兰氏阴性菌如大肠杆菌等。此外，它还可与各种诱发炎症的酸性物质结合，使其失活，并能增强抗生素和其它药物的疗效，改善组织基质的粘多糖代谢，从而达到消炎、修复组织的目的。 梁爱华（2001）考察在不同温度下鸡蛋清溶菌酶与-内酰胺类抗

16、生素联合应用对大肠埃希氏菌的生长及内毒素释放的影响。结果：在不同的培养温度下，氨苄西林或头孢噻肟50 g/ml均可导致细菌溶解，并诱导 Escherichia coli释放大量的内毒素到培养上清液中，这些培养上清液在体外培养的巨噬细胞上可诱导大量的肿瘤坏死因子（TNF）和白细胞介素6（IL-6）产生。而鸡蛋清溶菌酶与-内酰胺类抗生素联合使用能阻止细菌溶解，降低细菌内毒素的释放，并减少巨噬细胞TNF-和IL-6的产生。 2 2 抗病毒抗病毒 溶菌酶能与带负电荷的病毒蛋白直接作用，与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。该酶也可以预防和治疗病毒性肝炎，尤其对输血后肝炎及急性肝炎的效果较为

17、显著。在机体内它还有抗流感病毒的活性，其与胆酸盐的复合物能强烈抑制流感病毒和腺病毒的生长，并能防止疱疹性病毒感染。 3 3 增强免疫力增强免疫力 溶菌酶作为机体非特异免疫因子之一，参与机体多种免疫反应，在机体正常防御功能和非特异免疫中，具有保持机体生理平衡的重要作用。可改善和增强巨嗜细胞吞噬和消化功能，激活白细胞吞噬功能，并能改善细胞抑制剂所导致的白细胞减少，从而增强机体的抵抗力。 4 4 其它方面的药理作用其它方面的药理作用 溶菌酶还具有激活血小板的功能，可以改善组织局部血液循环障碍，分泌脓液，增强局部防卫功能，从而体现其止血、消肿等作用。它还可以作为一种宿主抵抗因子，对组织局部起保护作用。

18、2.5 促进双歧乳酸杆菌增殖 溶菌酶在婴儿体内可以直接或间接促进婴儿肠道细菌双歧乳酸杆菌的增殖，促进婴儿消化吸收，可以促进人工喂养婴儿肠道细菌的正常化；能够加强血清灭菌蛋白（Properdin），-球蛋白（-globulin）等体内防御因子对感染的抵抗力，特别对早产婴儿有防御体重减轻、预防消化器官疾病、增进体重等功效。 抗菌机理抗菌机理 细菌的细胞壁由胞壁质组成，胞壁质是由N-乙酰氨基葡萄糖（N-acetylglucosamine）及N-乙酰胞壁酸（N-acetylmuramic acid）交替组成的多聚物，胞壁酸残基上可以连接多肽，称为肽聚糖（Peptidoglycan）。肽聚糖是细菌细胞壁

19、的主要成分，它是由NAM、NAG和肽“尾”（一般是4个氨基酸）组成，NAM与NAG通过-1，4糖苷键相连，肽“尾”则是通过-乳酰羧基连接在NAM第的3位碳原子上，肽尾之间通过肽“桥”（肽键或少数几个氨基酸）连接，NAM、NAG、肽“尾”与肽“桥”共同组成了肽聚糖的多层网状结构，作为细胞壁的骨架，上述结构中的任何化学键断裂，皆能导致细菌细胞壁的损伤。溶菌酶能有效地水解细菌细胞壁的肽聚糖，其水解位点是N-乙酰胞壁酸（NAM）的1位碳原子和N-乙酰葡萄糖胺（NAG）的4位碳原子间的-1，4糖苷键，结果使细菌细胞壁变得松弛，失去对细胞的保护作用，最后细胞溶解死亡。 溶菌酶的应用溶菌酶的应用 1 1 溶

20、菌酶在医学上的应用溶菌酶在医学上的应用 溶菌酶作为一种存在于人体正常体液及组织中的非特异性免疫因素，具有多种药理作用，它具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤的功效。溶菌酶首先适用于五官科各种炎症。研究表明它对眼、耳、喉、口腔等的急、慢性炎症均有一定疗效。溶菌酶也可用于扁平疣、传染性软疣、尖锐湿疣、带状疱疹等多种皮肤病。另外，人体溶菌酶浓度还可以作为多种疾病的诊断指标。目前日本已生产出医用溶菌酶，其适应症为出血、血尿、血痰和鼻炎等。 2 2 溶菌酶在食品工业中的应用溶菌酶在食品工业中的应用 溶菌酶是一种无毒、无副作用的蛋白质，又具有一定的溶菌作用，因此可用作食品防腐剂。现已广泛应用于水产品、肉食品、蛋糕、清酒、料酒及饮料中的防腐；日本用15mg/kg溶菌酶用于低度酒的防腐，还可以添入乳粉中，使牛乳人乳化，以抑制肠道中腐败微生物的生存，同时直接或间接地促进肠道中双歧杆菌的增殖。溶菌酶杀菌防腐，由于不经过加热，属于冷杀菌，因而避免了高温杀菌对食品风味的破坏作用，尤其对热敏感的物质更具有重要意义。此外，溶菌酶对人体安全、无毒、无害，且具有一定的保健作用。 3 3 溶菌