蜚蠊目RNA干扰的应用研究进展及展望

1、    蜚蠊目rna干扰的应用研究进展及展望    马云峰 李绍斌 杨松 黎玄钢摘 要蜚蠊目昆虫的一些成员是世界公认的害虫，严重影响人类生活健康，采用rna干扰（rnai）技术可以减少蜚蠊目昆虫的数量以及疾病的传播。rna干扰是外源性或内源性双链rna经过dicer酶加工处理为小干扰rna（sirna）与标靶基因结合，使相应标靶基因沉默的现象，从而阻止某一基因功能在细胞或整体水平上的表达，具有高效性和特异性等优势。rnai技术作为研究基因功能的研究工具被广泛运用，并显示出开发新型有害生物管理策略的巨大潜力。近年来，此技术已被广泛成功应用于多种昆虫中，目前

2、为止，只有较少文献关于蜚蠊目昆虫rnai的报道。本文综述了rnai在蜚蠊目中的应用研究进展，并展望了今后的研究方向。关键词蜚蠊目;基因;rna干扰;双链rna;研究进展0 前言蜚蠊俗称蟑螂，属于昆虫纲（insecta）、蜚蠊目（blattaria），其中一些种类在医学与经济方面有巨大的危害性，它是世界性卫生害虫，包括美洲大蠊（periplaneta americana）、澳洲大蠊（periplaneta australasiae）、东方蟑螂（blatta orientalis）、德国小蠊（blattaria germanica），能够机械性传播多种致病菌，如痢疾杆菌、沙门杆菌、变形杆菌和寄生虫

3、卵等病原体，是人类诸多疾病的传播媒介;其排泄物和蜕落的表皮可能会带有过敏原，从而引起过敏性疾病的发生1。1 rnai抑制蜚蠊产卵及疾病的传播作为世界公认的卫生性害虫之一的蜚蠊1，严重影响人类生活和健康。蜚蠊类害虫具有惊人的繁殖速度，導致其种群数量庞大，而且粪便中携带七种过敏原8，直接暴露与人类的接触，增加人类发病率。因此，利用rnai是一种有效控制蜚蠊数量及疾病传播的方法。有实验研究表明，蜚蠊粪便中含有过敏原且是蜚蠊体内的blag 1蛋白起作用8，通过注射dsrna抑制蜚蠊体内blag 1 mrna的表达，使蜚蠊消化能力下降，排便较少。经检测，注射dsrna的蜚蠊blag 1 蛋白的含量远远低

4、于对照组的blag 1 蛋白的含量，且在第6天后，未注射的蜚蠊blag 1 蛋白的含量将近注射dsrna的蜚蠊的9倍8，注射dsrna减少了过敏原的排出，从而降低了与人类接触的几率，从而降低人类发病率。注射dsrna还会影响蜚蠊体内保幼激素的合成量，从而影响蜚蠊的正常发育，而且还会影响卵黄细胞的成熟。注射dsoks（double-stranded orcokinins）会降低ok（orcokinin）基因mrna的表达，影响卵母细胞的生长9，降低了雌性蜚蠊受精成功率，从而减少蜚蠊的出生率。总的来说，利用rnai技术能够有效控制蜚蠊种群数量和疾病的传播，特别是过敏原的传播。2 dsrna导入蜚蠊

5、体内的方法目前，对昆虫的然rnai技术的研究已比较成熟，将dsrna导入昆虫体内普遍使用的方法有注射法和喂食法两种。注射法：将体外合成的dsrna通过微量注射器注射到昆虫体内，是目前应用最普遍的导入方法。kennerdell和carthew用显微注射的方法将dsrna注入果蝇胚胎中，实现了用rnai技术对昆虫基因功能的研究。继 rnai技术在果蝇的成功应用之后，通过人工介导的方式引入dsrna昆虫体内，产生缺陷型个体来研究基因的功能已被越来越多的昆虫学家应用5。采用rnai技术注射dsrna，抑制蜚蠊目昆虫相应标靶基因的表达。利用注射的方式向蜚蠊目昆虫体内导入dsrna，注射位置通常在第三腹节

6、和第四腹节之间8，据其他文献报道，小蠊的头部和胸部也可以注射，但只有腹部注射效果最好9，原因是注射头部，头部神经比较多，容易造成死亡，成功率不高，注射胸部，肌肉过多，不易注射。注射需控制注射量，加入注射量过少，干扰效果不明显，随着注射量的增加一定量之前，干扰效果会更加明显8，但超过一定量后，会致死小蠊。但是rnai产生显著干扰效果持续时间不长，在一段时间后抑制效果会减弱甚至消失一般在6天或12天10。由于德国小蠊血液中含有的少量能够降解dsrna的物质10，因此，为了注射的dsrna作用效果更好，采用脂质体将其包裹，注射进入血液循环，更加容易与标靶细胞结合。由于注射法的适用范围较为限制，只能在

7、实验室使用，从而可以采用另一种适用范围较广的方法-喂食法。喂食法：根据昆虫都具有取食的行为特点，科学家使用喂食dsrna将其导入昆虫体内。喂食dsrna操作简单方便，容易实现，且对昆虫损失小6，因此在大多数情况下，可能是运用范围较广且比较普遍适用的一种dsrna导入方法。通过将dsrna从小蠊口器中进入食道，小肠上皮细胞吸收dsrna进入细胞。对昆虫的相关研究表明，dsrna的摄取与网格蛋白依赖性内吞作用和巨胞吞作用有关3。细胞摄取 dsrna的机制为系统性rna干扰缺陷型2（systemic rna interference defective 2，sid2）的肠腔内跨膜蛋白的被动转运，在其中它充当昆虫中摄入的 dsrna的内吞受体，进入细胞后，细胞通过网格蛋白依赖性和其他内吞途径摄取的 dsrna通过内体转运到这些细胞质位点，将喂食的dsrna转化为 sirna3，让sirna与标靶基因接触，使相应的mrna沉默。但是由于小蠊中肠中存在能够分解dsrna的液体10（以下简称中肠液），对刚进入食道内的dsrna及食物一道进行分解，很难让其进入细胞发挥作用，因此采用一种能够抗中肠液分解物质-脂质体将其包裹，其进入食道，避