组织工程学期末复习重点

1、组织工程学第一章1.组织工程学的定义组织工程学是应用生命科学和工程学的原理与方法，在正确认识哺乳动物的正常和病理状态下组织结构与功能特点的基础上，研究、开发用于人体各种组织或器官损伤后的器官修复和重建的生物替代物，从而恢复人体器官正常的功能和形态结构的一门新兴科学2.组织工程学的研究策略和方法（1）研究策略：3 将患者或捐献人体上新分离或培养的细胞及细胞群体注入受伤组织或可降解支架中，形成组织复合物后再植入体内，进行器官重塑 首先将细胞与支架在体外联合培养产生活的器官，构建成人体需要的活器官，然后再植入动物或人体内，修复欠缺或代替缺损组织 组织的原位再生。直接将支架植入到损伤部位，依靠体内自身

2、细胞的迁移进行重建局部组织，实现活体内器官或组织的自身修复（2）常用的组织器官修复方法 3 同种异体器官移植 自体组织移植 人工合成组织代用品3.组织工程学研究的基本问题（1）种子细胞的研究种子细胞的类型自体细胞、同种异体细胞、胚胎干细胞、异体细胞补：种子细胞来源及调控补：生物因子（2）支架的研究支架的重要性细胞培养的过程就是种子细胞与支架的融合并获得生长的过程，其中支架是细胞停泊和生长的支撑和环境，获得好的支架材料是细胞培养能否成功的关键之一支架的要求：7 生物相容性好、无致毒性，无致炎症反应和无致畸致癌的作用 体内降解速度与组织构建同步、产物无害、能完全被吸收或排出体外、不在体内残留 有一

3、定的力学强度 可塑性好 材料的孔径和孔隙率适度，微孔分布与走向符合器官力学特点、生长规律并配布均衡 材料具有适宜及诱导组织再生能力 细胞与支架无严重的相互作用6.常用术语：细胞类术语细胞周期、分化、染色体、成体干细胞,细胞周期依赖性蛋白激酶,脑源性神经生长因子,骨形态形成蛋白,细胞周期依赖性蛋白激酶,细胞因子,多能干细胞第二章 种子细胞种子细胞的基本要求采用非侵袭手段或微创手段即可获得；分裂增殖能力强；功能旺盛；无或仅有极微弱的免疫排斥反应；能连续传代，并且传代培养后不发生形态、功能及遗传物质的改变。种子细胞的主要种类（一）自体种子细胞（二）同种异体种子细胞（三）异种细胞（四）胚胎干细胞干细胞

4、1定义:可从胚胎、胎儿或成人组织中分离出来, 其主要特征为在特定的条件下可长期无限增殖(成体干细胞则可在个体存活期内不断自我复制), 并可分化为至少一种类型以上的特殊细胞。可简单概括为具有自我更新(增殖)和分化能力的细胞2特征:具有自我更新(增殖)和分化能力3分裂方式:对称分裂：形成两个相同的干细胞 非对称分裂：一个子细胞保持亲代的特征，仍作为干细胞保留下来，另外一个子细胞不可逆的走向分化的终端成为功能专一的分化细胞分类按照发生学来源，干细胞可以分为胚胎干细胞(embryonic stem cell，ES细胞)成体干细胞(adult stem cell) 根据不同的分化潜能，干细胞可以分为全能

5、干细胞(totipotent stem cell)多能干细胞(pluripotent stem cell)单能干细胞(unipotent stem cell)祖细胞 又叫前体细胞(progenitor or precursor cell)：是胚胎和成体组织中发生部分分化的细胞，可以分裂并形成某种类型的分化细胞。 祖细胞与干细胞的区别1当一个干细胞分裂时，两个子代细胞中至少有一个是具有自我复制能力的干细胞2当一个祖细胞分裂时，可以形成两个祖细胞or同时产生两个分化细胞，但这些细胞都失去了自我复制能力3干细胞能分化成各种类型细胞；祖细胞的分化方向已比较确定胚胎干细胞ESC来源：45日胚胎(又称囊胚

6、) 的内细胞团特点：1.具有发育全能性,在一定条件下有向3个胚层细胞分化的能力，在理论上可以诱导分化为机体中所有种类的细胞；2.具有种系传递能力，能够形成嵌合体动物；3.胚胎干细胞易于进行基因改造操作。内细胞团在形成内中外3个胚层时开始分化。内胚层将分化为肝肺肠等，中胚层将形成骨骼、血液、肌肉等，外胚层将分化为皮肤、眼睛、神经系统等成体干细胞ASC定义(adult stem cell) ：指存在于分化组织中的未分化的细胞，并能分化成该细胞来源组织中的细胞成分(如表皮干细胞)。有些成体干细胞(如骨髓间充质干细胞或脂肪干细胞)则可分化为其他组织中的细胞成分，如骨髓间充质干细胞可分化为软骨细胞等。

7、来源骨髓、血液、角膜、大脑、骨骼肌、牙髓、肝脏、皮肤、消化道上皮和胰腺等。优点（与胚胎干细胞相比，在研究和应用方面）1. 成体干细胞的自体移植避免了免疫排斥；2. 成体干细胞在正常情况下处于静止状态，只有在病理情况下才显示出一定的自我更新潜能，不像胚胎干细胞具有无限的自我更新能力，因此成体干细胞导致癌变的可能性较小；3. 成体干细胞的分化潜能比较局限，更容易向特定的组织细胞分化，也可以直接用于体内组织的原位修复；4. 某种类型的成体干细胞有向同种组织的损伤部位迁移的趋势，这有助于临床应用干细胞来进行疾病替代治疗时的定位；5. 分离和使用成体干细胞不存在伦理学问题。其应用受到的制约因素1. 目前

8、尚未在人体的所有部位分离出成体干细胞；2. 在一些遗传性疾病中，遗传错误也会出现在患者的干细胞中，这种干细胞是不适合移植的，而且由于环境因素的影响，成体干细胞有可能有基因突变等DNA异常；3. 成体干细胞没有胚胎干细胞的增殖能力强。临床应用n 骨髓移植：主要用于治疗急慢性白血病,使急性白血病的长期生存率提高到50 %70 %。n 外周血和脐血干细胞移植：用于治疗各种恶性血液病及非血液系统的实体瘤等。n 人造皮肤是开发最早的组织工程产品：Apligraft是第一种获得FDA 批准的含有人体活细胞的组织工程产品。 n 临床角膜移植、心肌细胞、骨骼肌细胞、胰岛细胞、神经细胞等。骨髓间充质干细胞BMS

9、C定义：人骨髓中所含的细胞可以分为造血类细胞和非造血类细胞。 前者中含有的干细胞主要为造血干细胞，而后者中含有间充质干细胞，能够分化为骨、软骨、肌腱、脂肪、 皮肤和其他类型的细胞。来源：存在于全身结缔组织和器官间质中，以骨髓中含量最为丰富特点：具有高度自我更新能力、多向分化潜能可分化为中胚层的骨、软骨、肌肉、脂肪细胞等，还可跨胚层分化为具有神经元or神经胶质细胞表型的细胞优势：来源广泛、取材方便、对人创伤性较小；易在体外培养、扩增和诱导；取自自体，克服了使用胎儿组织的伦理学和免疫学方面的问题；分离方法 差速贴壁筛选法 密度梯度离心法 流式细胞仪分选法 免疫磁珠分选法神经干细胞定义是一类重要的成

10、体干细胞，分布于成人及胚胎的中枢及周围神经系统。在生长因子、神经递质、激素及损伤、环境因素改变的刺激下，可分化为不同类型的神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。分布成人及胚胎的中枢及周围神经系统主要分布于：脑室管膜、室下区、纹状体、海马齿状回等区域脂肪干细胞定义:从脂肪组织中分离得到的一群多能干细胞，具有向多种组织分化的潜能。补：种子细胞的来源，原代培养以及传代培养的生物学特性，鉴定二、未分化细胞的获取培养1.胚胎干细胞：概念当受精卵分裂发育成囊胚时，内细胞团的细胞即为ESC特性具有发育的全能性，能够自我更新并具有分化成体内所有组织的潜能获取方法以昆明小鼠ESC的分离与培养为例：饲养层细胞的制备

11、囊胚的获得囊胚的培养内细胞团的分离ESC的鉴定2.成体干细胞以SD大鼠BMSC的分离与培养为例：处死、取骨、清除、漂洗收集骨髓、离心、分离重悬、接种培养传代、观察鉴定第三章 组织工程支架材料支架材料按来源分类1.天然支架材料:珊瑚、海藻（酸盐类）、黏多糖、软骨素、胶原类、壳聚糖等； 2.人工合成支架材料:各种多聚物类高分子材料、金属合金、陶瓷、硅胶等。新型生物材料 构建的基本原则须经无污染的处理：严格无菌和无毒操作，避免任何病原微生物和有毒物质的污染。 须为细胞提供生存和分化良好的微环境：根据修复材料的大小，设计其材料内部的孔隙率，使其适合种子细胞存活、生长、发育并产生功能，或使其植入生物体后

12、，体内的细胞能够沿着材料内部的孔隙进行迁移并行使功能从而逐渐替代所植入的支架材料。 植入人体后在自身修复过程中适时降解 组织工程支架材料在植入人体后必须适时降解，为人体自身修复创造出更好的空间常用生物支架特征：51) 良好的生物相容性,不引起炎症反应,排异反应和毒性反应； 2) 良好的生物降解性和可吸收性，能彻底地被自身组织替代。降解率应与组织细胞生长率相适应, 降解时间应能根据组织生长特性作人为调控。3) 良好的可塑性：可塑造为任意三维结构，与机体原有特定形状保持一致。4）良好的表面化学特性和表面微细结构：有利于细胞的粘附和生长。 5）为细胞创造良好的微环境条件：生物材料的孔径、方向、纤维结

13、构及涂层细有利于细胞的生长发育和迁徙。1.天然可降解生物材料1) 胶原 在动物体内含量丰富，是细胞外基质中的框架结构，具有高度的抗张力，有助于保持其结构的完整性 20种左右的胶原结构有共性-原胶原（胶原分子）均由三条相同或不同的链形成三螺旋结构，每条链的组成可以用(Gly-X-Y)n来表示 可塑性好，容易加工成型，有生物塑料之称 人工皮肤、人工血管、肌腱、晶体、角膜和骨等的支架材料 缝合线、烧烫伤敷料及化妆品领域等2）弹性蛋白 由两类短肽段交替排列构成（疏水肽段使分子具有弹性；含有大量丙氨酸和赖氨酸残基的a螺旋可在相邻分子间形成交联） 氨基酸组成与胶原相类似，亦富含甘氨酸及脯氨酸，但很少含有羟

14、脯氨酸，而不含羟赖氨酸，所以不具备胶原特有的Gly-X-Y序列，不能形成规则的三股螺旋结构 通过赖氨酸残基参与交联形成具有高弹性的网状结构3）藻酸盐 从褐藻中提取 带负电荷，能同带正电的分子牢固结合 具有良好的生物相容性 用作药物制剂的添加剂、伤口敷料、止血剂、药签等 用于移植材料和组织工程4）甲壳素及壳聚糖 甲壳素存在于虾蟹等的外壳、海藻真菌等的细胞壁中，资源丰富、分布广泛 壳聚糖是甲壳素的脱乙酰化产物，无毒、无味、有良好的生物相容性 都有复杂双螺旋结构，易于进行理化性质的改变，故有很多衍生物 可吸收缝合线、人工皮肤、支架材料等5）纤维素 植物和真菌细胞壁的主要成分，自然界数量最多的碳水化合

15、物 血液透析材料、人工肾、模拟人工肺、埋植材料、齿科修补材料6）透明质酸HA 带负电荷最大的粘多糖 主要来源是：鸡冠，人脐带和动物眼球，提取的透明质酸一般以游离状态存在，易于分离纯化和规模化生产 极强的吸水性天然保湿因子 是人体自身的基质成分，外源性HA抗原性极低，生物相容性极好 眼科手术、关节病治疗、组织修复等7）珊瑚 含有大量碳酸钙和少量有机质 数量很大，能够满足组织工程大量需求 呈多孔状，类似骨松质，利于血管和组织的长入。 其成分及结构与矿化骨相似，植入后可与骨组织直接结合，两者间不形成纤维组织 来源广泛，具有良好的生物相容性和可降解性，加工处理方便 新型的生物活性移植骨材料人工合成的可

16、降解生物材料优点：其组成成分、分子量、表面微结构、大体形态、机械性能、降解时间等都能预先设计和调控， 最后基本降解完全，避免了长期异物反应的危险， 缺点：缺乏细胞识别信号，不利于细胞特异性粘附及特异基因的激活。分类1聚乳酸类：PLA、PGA、PLGA等2微生物聚酯类：3-羟基丁酸等3共聚物：聚酰胺共聚物等3.新型生物材料1）纳米生物材料2）复合生物材料（分类6、优势-举例3）常用无机材料名称： 羟基磷灰石HAP 磷酸三钙TCP 生物活性玻璃陶瓷BGC无机无机复合材料，如：HAP/-TCP复合材料（双相磷酸钙BCP）。 既保持了生物活性，又使强度得到明显提高。其骨传导性优于单一的HAP或-TCP

17、BCP的成骨机理是以HAP为骨架，-TCP降解提供钙、磷源，使新骨不断长入-TCP降解后所形成的空隙中。无机金属复合材料，如：金属无机涂层材料，羟基磷灰石涂层材料。无机有机复合材料, 如：HAP/PLA复合材料。Ø 可以提高材料的韧性，满足机械强度的要求；Ø PLA的酸性降解产物可以被HAP缓冲，同时HAP的骨诱导性可提供良好的骨细胞粘附生长环境Ø 复合物的多孔结构则为细胞生长、组织再生以及血管化提供了条件，在骨组织工程中具有较高的应用前景。有机有机高分子复合材料，如：聚丙烯酰基羟乙基淀粉-PLGA复合材料 天然天然高分子复合材料，如：胶原蛋白-壳聚糖复合材料，胶

18、原蛋白-透明质酸复合材料。 天然高分子无机复合材料，如：HAP-胶原复合材料。与其它骨组织替代材料相比，HAP/胶原复合物的生物相容性是比较理想的，与骨组织也可以达成理想的结合，有利于骨组织的重生，所欠缺的是其机械性能较差。3）镁基可降解生物材料生物力学相容性-与骨密质差异小 密度：1736kg/m3弹性模量：45GPa抗拉强度：200MPa可吸收降解，无需二次手术4）智能材料（三要素：感知、驱动、控制）常用天然支架材料及其制备与应用一、胶原的制备胶原的分离和提纯(了解胶原的提取和纯化的基本方法)胶原是构成皮肤、骨骼、肌腱等组织的主要成分，所以胶原通常从这三种组织中提取。实验室中我们通常利用加

19、入酸、碱、盐或蛋白酶的方法来促进胶原的融解，然后改变pH或盐的浓度，使胶原沉积，便于离心分离。反复的融解沉积可以提高胶原的纯度。鼠尾的肌腱主要由型胶原组成，用鼠尾制备胶原是实验室中最常用的方法。（初步分离提纯保存）胶原的交联(常用方法)胶原共价交联后抗张强度进一步增强，可以降低在体内的降解速度，减轻抗原性。胶原的交联方法有脱水加热法和化学方法，其中以戊二醛化学方法最为常用四、脱细胞骨组织及其制备骨组织形成过程中，唯一能够单独诱导骨髓间充质干细胞向骨组织分化的生长因子是SMP（骨形态发生蛋白） 骨组织构成： 钙化的骨细胞外基质（骨基质）+多种细胞如骨C、成骨、破骨C等 骨组织的有机成分由成骨细胞

20、分泌形成，主要有胶原、多糖及蛋白、脂肪等 骨的无机成分中磷酸钙占83%，其它还有碳酸钙、磷酸镁、氯化钙及少量钾、钠、锶盐等。 骨的无机成分为骨提供适当的强度，而有机成分赋予高韧性、低模量以及其它高分子材料所具有的力学性能，其二者紧密结合使骨组织十分坚硬2.脱细胞骨基质理想的骨组织工程细胞外基质材料应具备以下的特性：良好的生物相容性和生物降解性；良好的骨引导性和骨诱导性；可塑性和一定的机械强度骨组织的有机成分由陈鼓细胞分泌而成，主要有胶原，多糖，蛋白，脂肪等组成第四章 生长因子在组织工程中的应用¡ 第一节 生长因子的概念与常用的生长因子 生长因子的概念：由组织和细胞产生的，对细胞生长及

21、分化具有显著调节作用的一类多肽或蛋白质。生长因子通过细胞信号转导系统，促进或抑制细胞的分裂增殖、迁移和基因表达。列出几中常用的生长因子名称（中文名+英文缩写）转化生长因子-TGF-、骨形态发生蛋白BMP、碱性成纤维细胞生长因子bFGF、表皮生长因子EGF、胰岛素样生长因子IGF、血管内皮细胞生长因子VEGF生长因子1来源：生长因子(GF)是由活细胞产生的刺激细胞生长和调节细胞活动的肽类物质， 2分子特征：它们的相对分子量大多为5000-50000的肽类或小的蛋白质，3浓度：正常时生长因子在体内的生理浓度很低，以 10-9克分子浓度起作用。 分泌方式：1.自分泌(autocrine)：由某种细胞

22、产生并作用于细胞自身；2.旁分泌(paracrine)：细胞分泌的生长因子作用于邻近的其他类型细胞，对合成、分泌该生长因子的自身细胞不发生作用，因为它缺乏相应受体。3.内分泌（endocrine）：生长因子从细胞分泌出来后，通过血液运输作用于远隔靶细胞。如：血小板源生长因子（PDGF）源于血小板，作用于结缔组织细胞。¡ 常用生长因子种类¡ 一、转化生长因子- ¡ TGF-的受体：位于细胞表面，有IV5种类型。¡ TGF-的生物学作用：¡ 1,促进细胞增殖 2,调节细胞分化¡ 3,促进细胞外基质合成，4，免疫调节作用二、骨形态发生蛋白（

23、BMP）¡ 1.性质：成熟的BMP蛋白结构是由二硫键连接的同型或异形二聚体。¡ 2.受体¡ 细胞膜表面，I型、II型；¡ 属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶受体¡ 3.BMP的生物活性：¡ 1）诱骨活性；2）胚胎发育中的作用。¡ 3）在神经发育和修复中促进神经元的成熟和突触形成。4）促进造血发生。5）诱导细胞凋亡6)促进精子发生及胚胎形成。7）促进肝细胞增殖。8）其他。三、碱性成纤维细胞生长因子¡ bFGF主要分布：垂体，脑，神经，视网膜、肾上腺和胎盘。¡ 生物学作用：16¡ 1促血管生长作用，2创伤愈

24、合与组织修复3组织再生4胚胎的发育和分化：5调节内分泌的作用6神经营养作用四、表皮生长因子 EGF¡ 分子结构：活性部分仅为53个aa残基的单链多肽，分子量6054kd生物学作用： 1. 促进低分子化合物转运的增加。 2.促进糖酵解、RNA与蛋白质合成及诱发DNA合成、促进细胞分裂等。五、胰岛素样生长因子（IGF） IGF为骨塑形改建过程中的调节因子，分子量为7.60KU，骨骼组织及非骨骼组织均可合成IGF。在体内有两种IGF存在。 IGF-I在骨细胞的代谢过程中发挥重要作用；IGF-II又称骨骼生长因子六、血管内皮细胞生长因子 VEGF在血管新生中起重要作用： VEGF促进血管腔内

25、和腔外血浆成分代谢 VEGF刺激内皮细胞产生纤溶酶原激活物(uPA和tPA)、纤溶酶原激活物抑制剂-1（PAI-1）和胶原酶，并使蛋白分解增加而引起血管外基质成分改变，为内皮细胞迁移创造条件。 VEGF刺激内皮细胞增殖 VEGF促进内皮细胞的迁移，这是从血管前体形成内皮分支重要的一步。 VEGF抑制内皮细胞的凋亡。第二节生长因子的控制释放¡ 一、概述¡ （一）生长因子控制释放的必要性¡ 生长因子在体内的应用还存在一些问题，主要原因是它的高扩散性和半衰期短使其自身的生物学活性难以长期保持。一般其半衰期是数秒至数分钟，最长不超过数小时，有的甚至不能在溶液中稳定存在。局

26、部直接应用生长因子可在较短时间内发挥作用，但在生理环境下很容易使之迅速失活，不产生预期的生理效应。 ¡ 根据高分子的疏水特性采用药物控制释放技术即采用生物降解性材料对生长因子进行保护- ¡ 使之在有水环境下既保持活性，又能防止生长因子与水接触，达到持续释放或控制释放的目的，这是使生长因子能在组织工程器官构建过程中得到有效应用的关键。（二）控制释放技术的应用¡ （理解速释、缓释、零级释药）生长因子的控释材料¡ （一）载体材料分类：¡ 1.常用的载体材料：¡ 1）按照作用特性分：¡ 膜控释型材料和骨架型控释材料¡ 2）

27、根据生物降解行材料的来源分： ¡ 天然可降解性材料（明胶、壳聚糖、纤维素、蛋白质、羟基磷灰石、珊瑚及其衍生物等），¡ 人工合成生物降解性材料（聚乳酸、聚几内酯、聚原酸酯、聚酸酐等）¡ 2合成的高分子材料PLGA作为控释材料的优点（与生物材料相比）：¡ （1）具有生物相容性； ¡ （2）生物可降解性 （3）无免疫刺激性 ¡ （4）性能的良好重现性。 三、生长因子的控制释放体系的形式¡ 1高分子微包囊¡ 2.水凝胶 ¡ 3.脂质体¡ 4.纳米控释载体 ¡ 5.胶束¡ 6.电纺丝超

28、细纤维体系¡ 7.非病毒基因载体控释系统 四、生长因子控制释放体系存在的问题¡ 1.“突释效应”造成释药早期药物大量释放的问题 ¡ 2.生长因子的活性不能持久保持的问题 ¡ 3.多因子控释和靶向控制策略有待进一步优化 ¡ 4.控释结果的评价缺乏客观性标准 第五章种子细胞与支架材料的联合培养¡ 体外构建工程化组织可归纳为两条技术路线¡ 1.将支架材料按设计要求，预成形为特定的形态，再接种细胞，经体外长时间联合培养，发育成为成熟组织，然后植入体内，修复组织缺损。¡ 2. 种子细胞与非定形、体积较小的支架材料在体外经过短

29、时间联合培养后，即植入体内，在体内正常的营养环境及生物力学条件下，继续生长发育。¡ 二、细胞与支架的接种技术 ¡ 1. 浸渍法 ¡ 2. 沉淀法 ¡ 3. 吸附法 ¡ 4. 凝胶法 5. 动态培养系统第二节 细胞示踪技术¡ 细胞示踪技术：指在体外将细胞标记上特异的标志后，植入动物体内进行追踪，研究其在体内的迁移、增殖和转归。 ¡ 主要有：病理学示踪和非病理学示踪， ¡ 病理学示踪-需在移植后的一定时间内处死实验动物，切片后进行免疫荧光或免疫组化分析； ¡ 非病理学示踪-应用于活体，主要是无创性影像学技术，

30、包括核医学分子显像技术活体示踪、磁共振成像(MRI)活体示踪。¡ 理想的活体细胞示踪剂应具备的特征： ¡ 1安全性 ¡ 2灵敏度 ¡ 3特异性 ¡ 4长久性 ¡ 5空间分辨力 ¡ 活体示踪干细胞常用的细胞标记物质（非病理学） 主要通过以下两种技术： 1. 核医学分子显像技术活体示踪干细胞 2. 磁共振成像(MRI)活体示踪干细胞第三节 生物反应器的原理和技术¡ 生物反应器的概念 ¡ 生物反应器是利用酶或生物体（如微生物）所具有的生物功能，在体外进行生化反应的装置系统，是一种生物功能模拟机，如发酵罐、固定化

31、酶或者固定化细胞反应器等。生物反应器是生物反应过程中的关键设备。¡ 生物反应器的种类：¡ 1.膜式生物反应器：膜式生物反应器的主要原理是通过一个起传质作用的透析性膜进行气体交换。用于组织培养旋转式生物反应器都是通过膜来进行气体交换的。膜式生物反应器可使气液交换分开，避免反应器内气泡和流体剪应力的产生；细胞或组织留在反应器内，反应器连续灌流；采用膜包埋技术，适合培养容易受到剪应力破坏的细胞。¡ 2.旋转壁式生物反应器¡ 旋转壁式生物反应器是一种水平旋转的、无气泡的、膜扩散式气体交换的培养系统，由内外同心圆筒组成。主要原理：内外筒绕水平轴或垂直轴旋转，带动其

32、内的培养液和培养物作绕轴运动，在动态培养环境中进行气体交换。 第七章 应用组织工程学方法修复组织和器官损伤第一节 皮肤损伤的修复和临床应用组织工程化皮肤的分类有哪些？1.表皮替代物（epidermal replacement）2.真皮替代物（dermal replacement） 3.复合皮肤替代物（composite skin replacement） 同种异体表皮细胞移植膜片最主要的抗原是什么？ （HLA-DR）。² HLA-DR主要表达于何种细胞？ （朗格汉斯细胞表面，角质形成细胞几乎不表达）。² 列举几个皮肤修复常用的生物材料： 1）聚乌拉坦、2）透明质酸、 3）纤

33、维蛋白胶、4）脱细胞真皮。² 皮肤组织工程修复主要相关的生长因子和细胞因子有： 1）表皮生长因子（EGF）， 2）转移生长因子（TGF）， 3）干扰素（IFN）。² 人工皮肤培养方法有哪些？ 1）滋养层法， 2）平皿培养法 3）气液面培养法 4）体内培养法。² 列举五种商品化的人工真皮：（1）Integra Artificial Skin （2）AlloDern （3）Biobrane：（4）Dermagraft-TM：（5）Dermagraft-TC 目前最成熟的人工皮肤是_ ，它属于_。（Apligraf，复合皮肤替代物）第二节 骨和软骨损伤的修复和临床应用组

34、织工程骨修复中支架材料的基本要求和特征： 良好的生物相容性和生物可降解性； 有一定的机械强度； 易于塑形； 具有骨或软骨的诱导性和传导性； 具备支持骨或软骨细胞生长和功能分化的表面化学性质与微结构；材料降解速度与细胞功能发挥二者相匹配； 可与其它活性分子如BMP、TGF-复合共同诱导骨的发生； 容易消毒。天然生物衍生材料的优缺点： ² 优点： 1来源丰富造价低廉， 2有天然网状孔隙结构系统。 ² 缺点： 1可塑性差， 2在生产过程中难以控制其质量、 3 性能与结构变化不成比例等。 第四节 心肌组织工程² 心肌修复治疗方法主要有几种途径？直接将细胞移植入病灶区的细胞

35、治疗、促进心脏再生组织。采用组织工程技术发展替代组织的治疗方法。 ² 什么是心肌祖细胞？心肌祖细胞：心肌中存在一群心肌祖细胞（cardiac progenitor cells，CPCs），具有干细胞表面标志Lin-,c-kit和Ki-67，并表达心肌细胞早期基因GATA-4和Nkx2.5。具有干细胞的特点：自我更新、有克隆形成能力、有多种分化潜能，可分化成肌细胞、平滑肌细胞、内皮细胞等。² 可用于心肌组织工程研究的种子细胞主要有哪些？（新生或胚胎心肌细胞、胚胎干细胞诱导分化而来的心肌细胞、骨髓间充质干细胞诱导的心肌细胞，骨骼肌成肌细胞、骨骼肌干细胞、成纤维细胞、骨髓单核细胞

36、、脐血干细胞、内皮祖细胞等也可能成为种子细胞或诱导成为种子细胞。）² 诱导种子细胞向心肌分化的诱导剂主要有哪些？（骨形成蛋白-2、转化生长因子-、碱性成纤维细胞生长因子、二甲基亚砜、视黄酸、5氮杂胞苷等）² 构建EHT （engineering heart tissue）的要求有哪些？1.生物相容性：生物材料不能引起机体免疫排斥与炎症反应。 2.机械整合性：生物材料在移植过程中要易操纵，最重要的是，其机械性能与宿主组织要相匹配，在再生过程中提供机械支持。 3.生物降解性：生物材料的降解率应与宿主组织的再生率相一致，降解产物必须无毒及易排泄。 4.仿生性：模拟宿主细胞外基质成

37、分。 5.制备容易：生物材料必须易获得并价格便宜。第八章 基因治疗在组织工程中的应用² 第一节 基因治疗概述² 一、基因治疗的概念 1广义的基因治疗（gene therapy）是指应用基因和基因产物治疗疾病的一种方法。 2 狭义的基因治疗是指将外界的正常基因或治疗基因，转移到人体的靶细胞中进行基因修饰和表达，治疗疾病的一种手段。² 组织工程和再生医学中所称基因疗法的特点是什么？ （采用某些基因转移的技术，即使目的基因和宿主细胞的基因组不发生整合，也可短暂发挥作用，产生治疗效果。目前一般称此为基因疗法（gene therapeutics）² 目前基因治疗概

38、念的扩展： （凡是采用分子生物学的方法和原理，在基因水平上开展的疾病治疗方法都可称为基因治疗）² 基因治疗的策略：1.基因置换（gene replacement）2.基因修复（gene correction）3.基因修饰（gene augmentation）4.基因失活（gene inactivation） ² 基因治疗的基本程序：1.目的基因的选择2.基因载体的选择3.靶细胞的选择4.目的基因导入靶细胞 ² 基因载体有哪些？1.质粒载体（plasmid vector）2.病毒载体（virus vector）（1）逆转录病毒载体（2）DNA病毒载体（3）慢病毒载体

39、（Lentivirus）（4）腺病毒载体² 目的基因导入靶细胞的基因转移方法有哪几种？ 物理法、化学法、融合法、基因枪及病毒载体法² 第二节 基因强化组织工程² 基因强化工程分为两种：间接体内法（ex vivo）直接体内法（in vivo）² 组织工程种子细胞的基因改造技术的基本要素是什么？1.目的基因的获得；2.基因载体的选择；3.靶细胞的选择；4.基因转移技术的选择。）² 简述基因强化组织工程的优缺点及展望：² 优势：转化细胞可持续高效表达目的基因，调控其自身及其它效应细胞的生长和分化；转染细胞合成分泌的内源性蛋白经过适当翻译后的

40、修饰过程，能更有效地同细胞表面受体结合。因此其表达产物活性更高，所需产物量更小（ng或pg水平），避免了反复使用大剂量（mg或g水平）外源性重组蛋白的副作用；质粒DNA 和病毒载体制备容易，稳定性好，半衰期长，打破了传统给药的途径，可通过直接在体内特定部位持续给药来达到治疗目的；免疫排斥反应亦可望借此技术得以解决。例如TGF-的免疫抑制作用比环孢素A 还强，同时它又可以调节软骨、骨等多种组织细胞的增殖分化， 将其转入相关细胞中，不仅能获得所需功能， 而且能抑制免疫排斥反应。第九章 组织工程产品的立法与管理² 组织工程医疗产品² 定义：应用活体细胞，并结合天然或合成的细胞外间

41、质组成，以发展可重建或替代功能的可植入的组织或器官。² 它是F04.4委员会的首要研制的标准之一，2000年11月在多伦多召开的大会上通过。 ² 1.首先描述了组织工程的定义及演化过程； ² 2.强调了此分类标准的意义和目的； ² 3.列出了分类大纲，意图是表述和汇总用于人类组织替代和修复的TEMPs开发和相关领域。² 我国公布了哪些TEMPs标准？ 我国于2007年1月31日发布了5个TEMPs标准： YY/T0606.3-2007组织工程医疗产品第3部分：通用分类； YY/T0606.4-2007组织工程医疗产品第4部分：皮肤替代品（物）的

42、术语和分类； YY/T0606.5-2007组织工程医疗产品第5部分：基质及支架的性能和测试； YY/T0606.9-2007组织工程医疗产品第9部分：透明质酸钠； YY/T0606.12-2007组织工程医疗产品第12部分：细胞、组织、器官的加工处理指南。 以上标准是参照美国ASTM相关标准的基础上编制而成，于2008年1月1日正式实施。实验题：一、骨髓间充质干细胞的分离培养1细胞培养的概念：体外培养（in vitro culture），就是将活体结构成分或活的个体从体内或其寄生体内取出，放在类似于体内生存环境的体外环境中，让其生长和发育的方法。 2体外培养的分类： 组织培养：是指从生物体内

43、取出活的组织（多指组织块）在体外进行培养的方法。 细胞培养：是指将活细胞（尤其是分散的细胞）在体外进行培养的方法。 器官培养：是指从生物体内取出的器官（一般是胚胎器官）、器官的一部分或器官原基在体外进行培养的方法。3倒置显微镜与普通显微镜的区别：n 组成和普通显微镜一样，只不过物镜与照明系统颠倒，前者在载物台之下，后者在载物台之上，用于观察培养的活细胞，具有相差物镜。 n 倒置显微镜的构造主要分为三部分：机械部分、照明部分和光学部分。 4无菌操作的原则 1.在执行无菌操作时，必须明确物品的无菌区和非无菌区。 2.执行无菌操作前，先戴帽子、口罩、洗手，并将手擦干，注意空气和环境清洁。3.夹取无菌物品，必须使用无菌持物钳。4.进行无菌操作时，凡未经消毒的手、臂、均不可直接接触无菌物品或超过无菌区取物。 5.无菌物品必须保存在无菌包或灭菌容器内，不可暴露在空气中过久。无菌物与非无菌物应分别放置。无菌包一经打开即不能视为绝对无菌，应尽早使用。凡已取出的无菌物品虽未使用也不可再放回无菌容器内。 6.无菌包应按消毒日期顺序放置在固定的柜橱内，并保持清洁干燥，与非灭菌包分开放置，并经常检查无菌包或容器是否过期，其中用物是否适量。 无菌盐水及酒精、新洁尔灭菌棉球罐每周消毒一次，