用血红蛋白的提取与分离

1、根据蛋白质各种特性的差异：根据蛋白质各种特性的差异： 分子的形状、大小分子的形状、大小 电荷性质和多少电荷性质和多少 溶解度溶解度 吸附性质吸附性质 对其他分子亲和力对其他分子亲和力 （二）蛋白质提取和分离的方法（二）蛋白质提取和分离的方法 凝胶色谱法：凝胶色谱法：又称分配色谱法又称分配色谱法 电泳法电泳法 凝胶是凝胶是微小的多孔性球体微小的多孔性球体，如，如葡聚糖葡聚糖 或琼脂糖或琼脂糖。内部有许多贯穿的。内部有许多贯穿的通道通道。 凝胶色谱柱凝胶色谱柱 洗脱：洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲从色谱柱上端不断注入缓冲 液，促使蛋白质分子的差速流动。液，促使蛋白质分子的差速流动。 利用了待分离样

2、品中各分子利用了待分离样品中各分子带电性质带电性质的的 差异以及分子本身的差异以及分子本身的大小、形状大小、形状的不同，的不同， 使带电分子产生不同的使带电分子产生不同的迁移速度迁移速度，从而实，从而实 现样品中各种分子的分离。现样品中各种分子的分离。 如如HH2 2COCO3 3/NaHCO/NaHCO3 3，NaHNaH2 2POPO4 4/Na/Na2 2HPOHPO4 4 通常由通常由1 12 2种缓冲剂种缓冲剂溶解于水中配溶解于水中配 制而成。调节缓冲剂的制而成。调节缓冲剂的使用比例使用比例就可以就可以 制得在不同制得在不同PHPH范围内使用的缓冲液。范围内使用的缓冲液。 （二）操作

3、过程（二）操作过程 本课题可选用猪、牛、羊或其他脊椎本课题可选用猪、牛、羊或其他脊椎 动物的血液来分离血红蛋白。动物的血液来分离血红蛋白。 血液血液 100mL100mL 3g3g柠檬酸钠柠檬酸钠 低速离心低速离心 2 min2 min 红细胞红细胞 血血 浆浆 吸出血浆吸出血浆 红细胞红细胞 5 5倍体积生理盐水倍体积生理盐水 搅拌搅拌10min10min 重复洗涤重复洗涤3 3次，直至上清液没有黄色次，直至上清液没有黄色 速度越高和时间越长，会使白细胞和淋巴细胞速度越高和时间越长，会使白细胞和淋巴细胞 等一同沉淀，达不到分离的效果等一同沉淀，达不到分离的效果 阅读思考：阅读思考： 1.1.

4、 释放血红蛋白过程中，在洗涤好的红细胞加入释放血红蛋白过程中，在洗涤好的红细胞加入 了哪些物质？了哪些物质？ 2.2.为了加速释放过程，采取了什么措施？为了加速释放过程，采取了什么措施？ 目的分析：目的分析： 1.1. 蒸馏水的作用是蒸馏水的作用是_。 2.2. 加入甲苯的作用是加入甲苯的作用是_。 3.3. 充分搅拌的目的是充分搅拌的目的是_。 使红细胞大量吸水胀裂使红细胞大量吸水胀裂 溶解红细胞的细胞膜溶解红细胞的细胞膜 加速红细胞的破裂加速红细胞的破裂 分离过程分离过程 红细胞破红细胞破 碎混合液碎混合液 高速离心高速离心 10min 离心管离心管 滤纸滤纸 过滤过滤 脂类物质脂类物质

5、烧杯烧杯 2000r/min的速的速 度度 将搅拌好混合液转移到离心管内，以将搅拌好混合液转移到离心管内，以 2000r/min2000r/min的速度离心的速度离心10 min10 min。 第第1 1层（最上层）：甲苯层（层（最上层）：甲苯层（无色无色 透明透明）；第）；第2 2层（中上层）：脂溶性物质沉淀层（层（中上层）：脂溶性物质沉淀层（白白 色薄层固体色薄层固体）；第）；第3 3层（中下层）：血红蛋白的水溶层（中下层）：血红蛋白的水溶 液层（液层（红色透明液体红色透明液体）；第）；第4 4层（最下层）：杂质沉层（最下层）：杂质沉 淀层（淀层（暗红色暗红色）。）。 用滤纸过滤，除去脂溶

6、性沉淀层，于分液漏用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏 斗中静置片刻后，分出下层的斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体红色透明液体。 取取1ml1ml的血红蛋白溶液装入的血红蛋白溶液装入透析袋透析袋中，将透中，将透 析袋放入盛有析袋放入盛有300ml300ml的物质的量浓度为的物质的量浓度为20mmol/l20mmol/l的的 磷酸缓冲液磷酸缓冲液中（中（pHpH为为7.07.0），透析），透析1212小时。小时。 除去样品中分子量较小的杂质除去样品中分子量较小的杂质。 正确的加样操作正确的加样操作（1 1）不要触及和破坏凝胶面（不要触及和破坏凝胶面（2 2） 贴壁加样（贴壁加样（3 3）

7、使吸管管口沿管壁环绕移动。）使吸管管口沿管壁环绕移动。 凝胶是凝胶是微小的多孔性球体微小的多孔性球体，如，如葡聚糖葡聚糖 或琼脂糖或琼脂糖。内部有许多贯穿的。内部有许多贯穿的通道通道。 （二）操作过程（二）操作过程 本课题可选用猪、牛、羊或其他脊椎本课题可选用猪、牛、羊或其他脊椎 动物的血液来分离血红蛋白。动物的血液来分离血红蛋白。 分离过程分离过程 红细胞破红细胞破 碎混合液碎混合液 高速离心高速离心 10min 离心管离心管 滤纸滤纸 过滤过滤 脂类物质脂类物质 烧杯烧杯 2000r/min的速的速 度度 取取1ml1ml的血红蛋白溶液装入的血红蛋白溶液装入透析袋透析袋中，将透中，将透 析袋放入盛有析袋放入盛有300ml300ml的物质的量浓度为的物质的量浓度为20mmol/l20mmol/l的的 磷酸缓冲液磷酸缓冲液中（中（pHpH为为7.07.0），透析），透析1212小时。小时。 除