糖尿病肾病患者血清中timp1水平的变化及意义

糖尿病肾病患者血清中TIMP1水平的变化及意义青岛大学硕士学位论文姓名佘正元申请学位级别硕士专业内科学（肾病）指导教师刘丽秋20030901中文摘要糖尿病肾病息者血清中TIMP一1水平的变化及意义摘要目的观察金属蛋白酶组织抑制因子一1TIMP1在糖尿病肾病不同阶段的变化规律，进而探讨TIMP。1在糖尿病肾病发生、发展过程中的作用。含量，采用方差分析和Q检验比较各组TIMP1水平的差异性；TIMP一1在不同性别间的差异分析用T检验，TIMP1水平与年龄的关系采用直线性相关分析和T检验。1259，052L病肾病肾功能衰竭组2131组及糖尿病肾功能衰竭组血清中TIMP1水平比正常对照组显著增高P均O01。临床期糖尿病肾病组比糖尿病组、糖尿病肾病肾功能衰竭组比临床期性别间的差异无统计学意义。在DM组和DNF组，TIMP1水平与年龄正相著性。结论随着糖尿病肾病的病情进展，血清中TIMP1水平逐渐增高，提示TIMP。1可能参与了糖尿病患者动脉硬化、动脉粥样斑块的形成及高血压的重塑、肾小球硬化，在糖尿病肾病发生、发展过程中起着重要作用。关键词金属蛋白酶组织抑制因子一1TIMP1糖尿病肾病动脉硬化肾小球硬化酶联免疫吸附实验ELISA糖尿病研究生余正元肾病内科导师；刘丽秋墓茎垫要MP一1INSTUDY0NSERUMLEVEKS0FTIBETL0NEPHR0PATHYPATLENTSWITHDIAABSTRACTERHMIEVEISOFTISSUEINHIBITOROFMETAECTVETOTHES0BJINVESTIGATEWITHDIABETDIFFERENTCLINICALOFSTAGESPATIENTSLIOPROTEINASE一1TIMP一1INTHEROLEOFTIMPTINTHEANDICDEVELOPMENTPROGRNEPHROPATHY,TOEXPLOREESSIONOFDIABETICNEPHROPATHYSWERETOCONDUCTTHISMETHODEIGHTYPEEPLESAMPLEDDIABETICNORMALCONTR01IIGROUPNC，N20，TYPERENALFAILUREOFDIABETICOFDIABETICSTAGESTAGENEPHROPATHYDN，N320ANDFROMALLECTSCONCENTRATIONSOFTIMP一1SUBJNEPHROPATHYDNF，N20SERUMWEREDETECTEDBYENZYMELINKEDANALYSETIMP一1LEVELSBETWEENANDBETWEENTHEDIFFERENCEOFGROUPSSTATISTICALLYTTESTTHESEXWITHOFANALYSISOFTIMP1LEVELANDWERECHECKEDWITHCORRELATIONANALYSISRELATIVITYAGEANDTTESTRESAITSERUMLEVEISOFTIMP1WERE825971259053734NGMI，1AND21IN218473142NC，NGM115083128257NGMI444125NGLMLOFTIMP一1INWITHANDDNFDM，DNDM，DNRESPECTIVELY。LEVELSPATIENTSANDDNFWEREMEREELEVATEDTHANTHOSEIANORMALCONTR01GRSIGNIFICANTLYTIMP一1LEVEIWITH1PATIENTSWITHDNHADOUPP00HIGHERCOMPAREDWITHDNFHADHIDMSIGNIFICANTLYPATIENTSP005INADDITION，PATIENTSWASNOSTATITIMP一11EVELWITHDNGHERCOMPAREDPATIENTSP0011THERETHECONCENTRATIONSOFSTICALBETWEENSIGNIFICANCESEXP005，BUTWITHINDMANDDNFCOEFFICIENTTIMP1WEREASSOCIATEDGROUPS，THEAGESOFCORRELATIONWAS04866P005AND萎奎塑墨STICALDIFFERENCEBETWEENTHECOEFFICIENTOFCOWASNOSTATIAPPARENTRRELATIONSNSERTLM1EVELS0FTIMP1WERERADUALLINCREC0ACIASI0GYCNEERESULTSASIWITHTHERESSI0NOFDIABETIPROGPHIOPATHYTHNGESTETHATT1MP一1MC0NTRIBUTET0VASCU1ARREMOSTROSUDN91YGGAYDEIIDURITHEDEVEIOENTANDRESSIONOFBL00DRE。PMPROGHIGTTPNGNGMMEDIATEREMOSSUREANDATBEROSC1EROSISMEANWHILETIMP一1AYOME0SDELI0FERULARBASEMMENTMEMBRULRANEGBMABD91NG910MAN0RTANTR0IERLTHEDEVENTANDC1EROSIANDSROG。P1AYIMPE10PMPRESSI0NOFDIABETICNROEPHPATHYKEYTISSUEINLLIBITOROFWORDMETALLOPROTEINASE一1；SCIERNSIERALOSC1EROSIDIABETIC11EHR0HEIT“0S；GIOMS；PPATHY；ATDIABETIEME11ITUSDM；ELISAZHENGYUANPOSTGRADUATESHEOFDEPARTMENTNEPHROIOGYDIGRECTEDBYLIULIQIU1前言糖尿病肾病患者血清中TIMP一1水平的变化及意义1前言近年来糖尿病、糖尿病肾病的发病率在显著升高，已成为慢性肾功能衰竭的主要病因之一，深入研究糖尿病肾病的发病机制，以延缓和逆转糖尿病肾病，阻止肾功能衰竭的发生己成为当今研究热点。糖尿病肾病最主要的病理改变为基底膜增厚、系膜基质增加、肾小球硬化。在整个病理改变过程中，肾小球细胞外基质EXTRACELLUAR作用。基质金属蛋白酶MATRIX赖的蛋白酶，它主要参与了ECM的降解、转运、组织重塑。金属蛋白酶组织INHIBITOR抑制因子TISSUE基质金属蛋白酶的特异抑制剂，其中TIMP一1最具代表性，能拘制所有MMP，对维持肾小球ECM合成与降解平衡，保证肾小球的正常生理功能发挥着重要作用。本研究拟通过对糖尿病、糖尿病肾病患者血清中TIMPL的定量研究，观病发生、发展过程中的作用。2材料与方法21研究对象岁；均为健康自愿者，无糖尿病、高血压痛等家族史，空腹、餐后血糖均在正常范围。腹血糖100MMOLL包括用药控制后，无糖尿病并发症出现。UGMIN，或常规尿蛋白定量O5924H，少部分病人有大量蛋白尿、高血压，空腹血糖100MMOLL，血BUN、CR尚在正常范围。2材料与方法液透析。上述病人近期内均无明显感染征象，所有入选病人均做血、屎常规，肝、肾功等化验检查。22主要试剂和仪器设备FI主要试剂TIMP1，HUMAN，ELISA系统英国BIOTRA公司产品10M硫酸本院免疫学教研室提供微量滴定盘128孔有抗TIMP一1覆盖的备用盘试剂缓冲液L磷酸盐缓冲液浓缩物标准品100NG冻干TIMP1过氧化物酶结合物冻千抗TIMP一1辣根过氧化物酶洗涤缓冲液125ML磷酸盐缓冲液浓缩物TMB底物3，3，5，5一四甲基联苯胺TMBK2氧化氢2主要仪器设备微量移液器法国GILSON公司产品超净工作台上海仪器设备公司低温台式离心机3K30型德国全自动酶免仪BIORADCODA型德国附院检验科提供23标本制备取患者和健康自愿者空腹外周血3ML置于普通试管内I封口，室温下自中，冻存在20冰箱中备用。24实验方法具体步骤如下1标准品的配制313NGML，625NGML，125NML，25NGML和50NGML。2分别吸取500UL试剂缓冲液1置上述每个管中。3吸取500UL储备标准品TIMPL100NGM1至试管5，并旋转混匀。4从5号管中吸取500UL至4号管中，旋转混匀。2材料与方法复至2号、L号管，标准品配制完毕等待备用。2反应物准备原试剂瓶，并最终将容积调整至100ML，充分混匀。2过氧化物酶结合物的准备将LLML稀释的试剂缓冲液1加入到过氧化物酶结合物试剂瓶中，盖上塞子，摇匀。3洗涤液的配制将洗涤液移入500ML量筒中，反复冲洗原瓶，将冲洗液一并倒入该量筒中，调整最终容积为500M14血清准备将已溶解的各组血清，参照有关文献，按下列标准进行稀释正常对照组按140倍稀释用试剂缓冲液1，糖尿病组和临床期糖尿病肾病组和糖尿病肾病肾功能衰竭组血清按160倍稀释。3TIMP一1ELISA反应程序，见图1SOLIDSTANDARDSUBSTRATEPHASECONJUGATEWELLREACTIONSTOPMEASUREODWASHWASH竺业坐垫墼竺旦垒堡翌翌。过坐些苎垫坠过TIMP1图1ELISA反应程序25统计学分析J结果均表示为均值标准差趸S，4组TIMP一1水平之间比较采用单因素方差分析和Q检验，不同性别之间的比较用T检验，P005为差异有显著性，并将TIMP1水平与年龄作相关分析。3结果3结果秘份标本，经ELISA双抗体夹心法反应均获得了在标准曲线对照范围肉的OD值，并由OD值和标准曲线应用计算机而计算出相应的T1MP1值。31研究对象的TIMP一1水平311标准曲线见图一2图1TIMP1铡定标准曲线312各组观察对象TLMP1含量见表一12343结果表1正常对照组TIMP1水平绳呈丝型生监生丛也型里L男6298098295789男573女63756714男56887805女55695726男67708，667女59976238男6067728968男11501610女589891511女587706212男70698，8513男628672714男626568515男657648416女59。8423817女639470718男626812519男557238520女5678576608582597137343结果表一2DM组TIMP1水平塑呈壁型生鉴生M二也世堡111女681480662I166820112848964081573324；612824471385490125076152387102156162365980231384569762L145088123776LOO孑251223951327，429“他”HM”堪垮加女男女女男男女男女男男男女男男男男女女们卯强弱2鳃卯船记跖醯毋矾“1190686245125905士21847与正常比PO01表3DN组TIMP1水平壁型生坠星塑呈坚璺G塑坠167148570女12924220L501481257661764484，623102471305761L880279148579158227132503145875M坦B1685601523291708711020581695281566251623，52M“M“他挣加雒引3卵弘配卯臼酡酡矾甜甜女女女男女女男女女女男男男男男男女女男139310648015083L士28257与DM比P00573结果表一4DNF组TIMP1水平生监坚里垄F型里塑量壁型178270573男2233502女663女7527196846L152547男5女55184449674242946男7女7L1961318女632470989女682355481069253146男1L男7025182L12女6318707413男6515807414女6817620815男5615765016女6217658717男6316233918女6621124819男6530000020文67204L，206625213142444125与DN比P0013结果32各组研究对象TL胛一1水平对比分析见图一3图3为NC、DM、DN、DNF的、TIMPI水平定量分析图。比0P00533按年龄分层后TIUPI水平对比分析见图4、5图一455各组TIMP1永平对比图图56P各组LIMPI水平对比图与NC比DM、DN、DNF,P001与NC比，DM、DN、DNF,P001DN与DMDNF与DN，P00IDN与DM，帅005，DNF与DN，PO0193结果34各组TIMP1水平与年龄相关性分析，见图一6，7，一8，一9图一6NC组TIMP1水平与年龄相关性分析散点图图7DM组TIMP1水平与年龄相关分析散点图图8DN组TIMP1水平与年龄相关性分析散点图0图一9DNF组TIMP1水平与年龄相关性分析散点图L35各组TMP1水平与年龄的相关系数，见表一5表5各组TIMP1水平与年龄相关性分析NCDMDN组别DNFR003650，4866口0327706229N2020202055P001口P00P0036不同性别TLMP1水平对比分析，见表一6袭一6不同性别之间TIMP1水平分析PO054讨论41MMPSTIMPS系统411MMPS超家族基质金属蛋TGMATRIX活性依赖于钙离子的具有高度同源性的水解酶类，能降解细胞外基质EXTRACE4讨论主要由体内的单核细胞、组织中的巨噬细胞如肺泡巨噬细胞及相关的组织细的潜酶形式分泌，能被蛋白酶或有机汞等活化而激活，也能被金属蛋白酶组INHIBITOROF织抑制因子TISSUE主要功能是降解细胞外基质膜有效成分，调节细胞粘附，作用于细胞外组分或其他蛋白成分而启动潜在的生物学功能。直接或间接参与子宫退化、胚胎发育、血管生成和伤口愈合等一系列正常生理过程；在许多疾病的病理的发生发展也起着重要作用，如类风湿性关节炎、骨关节炎、肿瘤的侵袭和转移、角膜溃疡、肝纤维化、高血压和动脉硬化等。412TIMPS家族迄今已发现4种，构成TIMPS家族。根据所发现之先后，结构同源性及功能液中，主要由巨噬细胞和结缔组织产生。TIMPS的结构具有一定的同源性，有两个功能区N一末端功能区为一大三环结构，其中的半胱氨酸残基为与MMPS锌离子活性中心结合的区域，N末端功能区相对保守，特别是前端的22个氨基酸残基同源性较高。各型TIMPS在此22个氨基酸区域的同源性差异为其测序诊断的标志【5】。C末端功能区研究相对较少，为一较小的三环结构，该功能区在TIMPS定位和或与前MMPS形成复合物方面有重要意义。外基质ECM的代谢中起着重要的作用。其作用方式较为复杂，大多数情形下细胞生长、繁殖及刺激血管生成、肿瘤的侵袭与转移方面发挥着一定的作用【“。此外，TIMPS对细胞的增殖、凋亡亦有作用，这种作用与其对MMPS的抑制作用无关。42TIMPI的特点及功能R2，4讨论转录但不翻译、内含子1、外显子2含有转录起始点和一些内含子2始外显子L，它可以被转录，但不能被翻译，因为翻译起始点位于外显子2上。JDEAN【8NS的研究提示内含子1的序列可能抑制了TIMPL的基因表达。OREG的研究也证实人类TIMP一1的基因中内含子1强烈地抑制基因表达，然而在内含子内部存在一些能够诱导表达的元件，当在活体和或对细胞因子和生长因子的反应导致基因表达受抑制时，这些元件可能参与减轻这种基因抑制。、TIMP一1由巨噬细胞和结缔组织产生，以可溶性小分子量多肽的形式分抑制区域结合部位基因的点突变，使MMP抑制区解耦联而失去活性91，TIMP1的抑制MMP活性与促进细胞增殖的活性是互不依赖的【LOJ；TIMP一1与肿瘤细胞的生长密切相关坦1；TIMP1能抑制细胞的凋亡，且这种作用与TIMP一1抑制MMP的活性无关LI31。TIMP1的表达调控主要是受细胞内的某些激酶以及胞内外的某些激素和一些信息分子、效应分子所诱导。一系列启动6、白介素一11、白血病抑制因子、肿瘤抑制因子M。在对成纤维细胞的研究1等均能明显调节其表达，有研究揭示TIMP1至少间接受RAS原癌基因的调控，这些表达调控均发生在转录水平。43TLNPI与糖尿病糖尿病由于糖代谢、脂代谢紊乱，使多脏器、微血管、神经等出现病理改变，发生高血压、动脉硬化及周围神经病变等临床症状。ERWELL“】等通水平发现与对照组健康组相比，糖尿病人血浆中TIMP1水平明显升高，MMP一2没有明显不同，MMP9在健康组中没有检测出，在糖尿病人中部分检出35，三者之间无明显相关性，而且各自与病人年龄、病史长短、血压、糖化血红蛋白HBALC无相关性，从而提示无微量蛋白尿的I型糖尿病人在因表达。WUK151通过糖尿病动物实验证实糖尿病大鼠早期肾脏未发生特征性的结构改变之前，肾脏ECM成分就己发生了合成增加而降解减少而在4讨论同样，DEL果。这些研究说明，TIMPL与糖尿病的发生发展密切相关。我们的研究结果脉粥样斑块的形成及血管重塑，对糖尿病动脉硬化的发生发展起着重要作用。44TIMP1与糖尿病肾病441肾小球ECM的构成正常的肾小球ECM位于肾小球毛细血管袢基膜和系膜区，也称为肾小球基膜和系膜区。肾小球毛细血管袢基底膜区含量最丰富的是型胶原，它是一个三维螺旋空间构型，构成肾小球基底膜GBM的基本网络状框架结构。其次是层粘连蛋白、小分子糖蛋白、结构层粘连蛋白和硫酸肝素蛋白聚糖HSPO等，在型胶原的网络状结构中穿插。系膜区基质在成分上与多ECM通过特异性受体的相互作用，对肾小球的粘连、生长、转移、分化和修复均起重要作用。442TIMP一1对肾小球ECM的作用要作用。肾脏本身。肾小管间质细胞、上皮细胞【L训、肾小球上皮细胞819】和系21膜细胞20解平衡，保证肾小球正常生理功能均发挥着重要作用。目前有资料显示【231膜性肾炎、IGA肾病、肾小球硬化和肾间质纤维化、多囊肾中表达显著增多。脏ECM降解的作用。因此我们认为TIMP1是比较重要的一种参与肾小球硬化的降解酶，它通过抑制ECM的降解过程来促进ECM增加，最终导致肾脏硬化和肾衰竭。44讨论443TIMP一1在临床期糖尿病肾病组中血清水平及意义糖尿病L厝病是糖尿病的主要并发症，也是糖尿病患者的主要死亡原因之一，目前糖尿病肾病的确切发病机制不清。糖尿病肾病的主要病理改变过程6J认为整个病理改变过程发生在不同的时间段，GBM增厚主要发生于糖尿病肾病DN的早期，它与蛋白尿的产生有密切相关性。系膜基质的扩展即系膜容量的增加与DN5肾功能进行性减退密切相关即肾小球滤过功能的减退是由于系膜基质在周围的毛细血管表面沉积，使肾小球滤过功能下降。因此，糖尿病肾病的发生是一个复杂的病理改变过程，它受各种细胞因子、蛋白酶及抑制因子的调控。早期人们认为DN的发生是由于促进ECM增加的因素如细胞因子等增多，而降解ECM的因素减少，因而导致ECM堆积，肾小球硬化F2”。随着研究的深入人们发现，肾小球系膜细胞在长期高血糖或己糖化和交联的基质中培养其IV型胶原合成受到抑制【281。有学者在免疫荧光显微镜下是增加的。在严重的糖尿病肾病患者的GBM中，经典的IV型胶原减少，而新一1可能抑制了ECM的降解，促使GBM重塑，肾小球硬化，肾功能进行性减的作用，包含着一个复杂的调控过程。45TIMP1与糖尿病肾病肾功能衰竭及血液透析慢性肾功能衰竭维持性透析患者表现出的主要慢性并发症为动脉硬化，且动脉硬化被认为在血液透析过程中是加速的，与它的生存率和死亡率密切相关P1”J。病理学研究已提示在动脉硬化中，动脉粥样硬化斑块中主要细胞构成是泡沫细胞，它来源于外周血单核和巨噬细胞。CHOU和酶谱技术检测血液透析病人血浆IV型胶原酶及抑制酶水平证实，血液透析响。本实验观察对象中糖尿病肾功衰竭组均为血液透析患者，其血清中TIMP1水平达到最高。糖尿病肾病患者随着年龄的增加和病史的延长，一些慢性并发症如高血压、动脉硬化等也相继出现和加重；另外，长期高血糖环境下，IL1、4讨论实验结果显示糖尿病组和糖尿病肾病肾功衰竭组TIMP一1水平与年龄正相关，使ECM积聚持续加重，肾功能进行性减退。同时也加速了糖尿病肾病肾功能衰竭血液透析患者的动脉硬化过程。综上所述，TIMP一1在糖尿病、临床期糖尿病肾病和糖尿病肾功能衰竭血液透析患者血清中的水平显著升高。TIMPL可能参与了糖尿病的动脉硬化，动脉粥样斑块的形成及血管重塑。在糖尿病肾病肾小球GBM重塑，L肾小球硬化的发生发展中起着重要作用同时可能加速了糖尿病肾病肾功能衰竭血液控机制等问题，尚待进一步研究和探讨。5小结1TIMP一1在糖尿病、临床期糖尿病肾病、糖尿病肾病肾功能衰竭血液透析患者血清水平逐渐增高，其水平可能与年龄相关。，2TIMP一1可能参与了糖尿病动脉硬化、动脉粥样斑块形成及高血压血管重塑过程。3TIMP一1可能介导了肾小球ECM积聚、GBM重塑和肾小球硬化。4TIMP一1可能加速了糖尿病肾病肾功能衰竭血液透析患者的动脉硬化过程。参考文献参考文献1TMLEBERFRBOFMMP一9CTIONTNFSLKWILLREGULATIONM0110CYTEPRODUBYORRIVEDOFANDATUMOUDESOUBLEFACTORTISHJOURNALCAL2CERMMPSFBR，1998787247322EDWARDSLAZARUSCAILLPBLLJ，CURYJ，DAVIJMENOCYTECATHYANDTISSUERLHIBITOROFBIOT5862METALLOPROTEINASEJCHEM，1987；2621L58683KMOWLDENESMHUMANJ，MARTINJ，DAVIMETALLOPROTEILQASEBYGENERATION910ITIERULARCELLS9954716821689EPITHELIALKIDNEYINT，L4WHILHEIMSCOTTM、C011IERIVANLSV40TRANSFORMEDHUMANE，MARMERBARRYFIBREBLASTSSECREATEDA92KDAIVWHICHISIDENTICALIUNGTYPECOLLAGENASETOTHATSECREATEDNORMALHUMANBI01BYMAEROPHAGEJCHEM，1989；264172L3L72215GREENEA1MELECUIARANDCHARACTERIZATIONOFHUJ，WANGM，LIUYE，ETCLONINGMANTISSHEINHIBITOROFBI01METAILOPROTEINASE一4【J】JCHEM，130375303806BAKERAH，ZALTSMANEFFECTSONRATVASEULARMUAB，GEOGESJ，ETA1DIVERGENTSCLEINVASIONCELLRELIFERATIONANDDEATHINCIIN01PVITROJ】JINVEST，1998；1147814877YOSOMEZONHIJIH，GDE，THORSSUPENHANCEDRNARESSIONRGEIEXPOFTISSUEINHIBITOFOFMETALTONANHUMANBRPIOTEISEITIMP一1IEAANCEREDONC99131134STJ】INTCRPOI，196；68GDEAN，DAVIDREDWARDSETA1THEHUMANTISSUEINHIBREGAYOUNG，DYLANITOROF1GENECONTAINSSIREELEMENTSWMETALLOPROTEINASESTIMP1REPRESITHINTHEPANDREMOTORINTRONL2002；JBIOI9CHESLERDL，GOLDEW，BERSCHROTEINASEINHIBITIONANDEN，ETA1METALLOPRYTHREIDAREACTIVITIESOFTISSUEINHIBITOROFPETENTIAFIONINDEPENDENTMETALLOP5RETEINASES1B100D，1995；86450645110CHESLERDRSCHOFL，G01DEW，BENETA1CONSTITUTIVEACTIVATIONTRANSCRIPTIONFACTOR245064515，AP1B1COD，1995L11KOSSAKOWSKAASOFROTEIE，URBANSKIJEDWARDSTISSUEINHIBITORMETALLOPISSSEDATELEVATEDSINNOHENASE一1TIMP一1MRNA1EVEIEXPIEMALIGNANTDGKINSLYMPHOMALB100D，I991772475248112STETIEPSTEVENSONRALIMMM，MALLSOOSETOFMATRIXMETAA1EXPRESSIONRETOINASESALLDTISSUEINHIBITORSOFINIIOPREACTIVEANDNEMETAIIOPROTEINAS708I71OPIASTIC99789I5LYMPHOMASBIOOD，IIZ参考文献13A1INOFMETGUEDEZL，STETLERSTEVENSONWG，WOIFFL，ETVITRORESSIONSUPP一998；10220022010ALLOPROTEINASESTJCLIN，1NVES，L14PRRANTETA1PEBLOOD1EVELALTERATWELL，PMTIMNIS，SCHANDRIPHERALIONOFT1MP一1MMP2ANDMMP一9INWITHIDIABETESDIABETESPATIENTSTYP。EUK，DIABETICMEDICINE，200118777N7801R5SM，ETA1ALTEREDKIDNMATRIXRESSIONINEAWUK，SETTYS，MALLEEYGENEEXP1OFDIABETESACTAANAT997158L55165RLYSTAGESEXPERIMENTAL16F，FORINOOFRULARMETADE】PRETED，ANGLANIM，ETA1DOWNREGULATIONGLOMEINHUMAN4491454110PROTEINASE2GENENIDDMDIABETOTOGIA。199740117KIHINERDEJRSTETLERSTEVNSONEGSTRUCTURALBIOCHEMJANDACTIVATIONSTRYOFMATRIXCELLMETALLOPROTEINASESCURROPINIONBIAL，1993；589189718JOHNSONYPETA1GIOMERUFARCELLSSECRETR，YAMABEH，CHENEPITHELIALGLOMERULARBASEMENTMEMBRANEAMSOCDEGRADINGMETALLOPROTEINASESJNEPHR01，199221388I39719AP，CORTEZSL，BARICOSWHR01EOFANDINEXTRACELLWANGPLAMINGELATINASEULARMATRIXRADARIONCULTURERATCELLS，AMDEGBYMESANGIALJPHYSI01，1992；1112LLL820JOHAMARTIN，JANICEKNOWLDEN，MALCOLMDAVIESIDENTIFICATIONANDINDEPENDENTOF,HUMANEELLREGULATIONMESANGIALINT，199446877885，21BARICOSWH，SVASMEDIATORSOFSHU“PROTEOIYTICENZYMESGLOMERULARINJUINT，1981；40L6L173RYKIDNEY22DAVISTHOMASPROTEINASESANDMATRIXTURNOVERM，JMATIN，GTGLOMERULAR1671768KIDNEYINT，1992；423王建中，陈香美，师锁柱等。基质金属蛋白酶。9和金属蛋白酶组织抑制物1在IG24BARICASWH，CROTEZSL，DAHRSS，ETA1ECMCULTUREDHUMANDEGRADATIONBYMECELISISAMEDIATEDSANGIALBYPAPLASMINMMP一2CASCADEKIDNEYINT，03910471995；47125林洪丽，陈香美，于志恒。金属蛋白酶组织抑制剂1基因转染对系膜细66I70。胞表达纤连蛋白和型胶原的影响。中华内科杂志，2002L83L26RSTRUCTURALINTHECMETABOSTERBYDIABETIENDOCRINECHANGESKIDNEYCLIN19861573375127程庆文，黄字闻，周同。肾小球系膜细胞，胞外基质及细胞园子与肾小球疾病。国外医学泌尿系统分册，1994；L44952。28RETS，CSSBANZMASIBIGEROULAGA1NONENZYMATICGLYCATIONOFMESANGIALTRIXTOELEVATEDREDUCESANDGLUCOSECOLLAGENSYNTHESISCHARGEPROTEOGLYEAN18叁耋壅塑INT，199343853860KIDNEY29王金泉。肾小球细胞外基质结构和功能的改变与糖尿病肾病。肾脏病透59263析与移植，I995；42A1突变型生长激素基因小鼠对STZ诱导的肾小30刘志江，黎融LIJIADEJ，ET996；515，球损伤具有保护作用肾脏病透析与移植，1OFRISKFACTORTO31ROSTRANDRETESRKKA，ETA1REIATIONSHJCORNARYSG，GJC，KIPISCHENIICHEARTDIINT1SASSOCIATEDSEASEKIDNEY982；22304HEMODIALYSI308JETAI，ENHANCEDRR32ANDOKVISTSCAVENGERRECEPTOEXPM，LUNDI，BERGSTROMSIILSISESSIONIOMACINT，1996；49M0110CYTEROPHAGEDIALYPATIENTSKIDNEY773780ONTHELEVELOF33CHOUALEFFECTOFHF，CHUS，CHENGM，ETEMODIALYSISPLASMATHEIR83IVANDINHIBITORSCLINBIOCHEM，2002；355；3COLLAGENASESTYPE388致谢致谢值此论文完成之际，谨向尊敬的导师刘丽秋教授致以衷心的感谢。在实整个实验设计、实施过程中，导师严谨、科学、认真的工作态度，忘我求实的工作作风和无私的奉献精神给学生留下了深刻的印象，对学生的培养倾注了大量心血，我在此表示真诚的感谢。同时也衷心感谢肾内科的全体老师对我的指教和帮助。1E傩及其降解系统综述IMMPSTMPS与糖尿病肾病C糖尿病爵病DIABETILIAR是糖尿病患者的主要死亡原因之一，系膜区细胞外基质EXTRACELL织，而且影响细胞的生长、粘附、迁移、增殖、分化和修复。ECM生成和降解失衡可以引起其大量增加，最终导致肾小球硬化和肾问质纤维化，是引起肾功能衰竭的主要原因。过去十多年里，人们对糖尿病状态下各种生长因子和细胞组织ECM产生增多已有了较多的研究，而对肾组织ECM降解则研究得较少。探讨ECM降解的调节机制已成为人们关注的焦点之一。大量实验证实，基质金属蛋白酶MATRIXINHIBITOROF年有关MMPSTIMPS在糖尿病肾病发生发展中的作用作一综述。1ECM及其降解系统11ECM的组成成份ECM主要包括胶原、蛋白多糖、糖蛋白、糖胺多糖和弹力纤维等五大类物质。胶原是ECM中最丰富的结构成分，现已发现19型不同的胶原分子，构成了胶原分子超家族。根据胶原分子结构、功能和分布部位可分为5大类1纤维形成胶原包括I、II、V、型胶原2基底膜胶原，主要是型胶原IIX型胶亮氨酸的小蛋白多糖和调节蛋白多糖两类，参与基底膜和基质中蛋白与蛋白间的相互作用。糖蛋白是由一条或数条肽链与一定含量的粘多糖组成的结合蛋白，根据其分布不同分为间质糖蛋白和基底膜糖蛋白。糖胺多糖依其糖基和硫酸基2埘PS超家族4硫酸角质素四类。除透明质酸为独立的分子结构外，其它的糖胺多糖均与蛋白结合构成蛋白多糖。糖胺多糖有高度亲水性，形成水化性胶质；填充ECM的纤维网架间隙，起支持作用；带有大量负电荷，参与某些殊特结构如肾小球基底膜电荷屏障的形成。弹力纤维由弹性蛋白构成，赋予ECM弹性。12ECM降解酶系成员降解蛋白多糖和糖蛋白，有其相应的抑制因子，如N一抗胰蛋白酶、卵白蛋白、的一大酶系。2MMPS超家族21分类和特点基质金属蛋白酶MMPS是一类含有锌离子、其活性依赖于钙离子的具有高度同源性的水解酶类，可以降解细胞外基质ECM中的主要生物大分子，至今原酶，激活因子在蛋白酶及有机汞作用激活。在最适条件25下，间质胶原酶选择作用于肽链中甘氨酸一异亮氨酸肽链和A2肽链中的甘氨酸一亮氮酸肽链，2涮PS超家族胞，分解底物同MMPMMP14，MTMMP一2又称MMPL结构和功能上，IMPS有以下特点1均以潜酶形式分泌，其前肽内含有一个半胱氨酸开关和两个高度保守区，一个高度保守区位于催化中心含锌结合位点，另一个高度保守区位于N末端类血红素结合区。2均含有2个锌离子，其中一个位于催化活性中心，为酶活性所必需的辅助因子。3均含有2个钙离子，参与酶活性的激活，并为酶活性的稳定所必需。4均为内肽酶INHIBITORSOF性抑制因子TISSUE22活化及调节MMPS存在方式有前酶型、活化酶型及与组织抑制因子结合的复合物型，所有MMPS均以无活性的潜酶形式分泌，其活性的封闭是由于在其锌离子活性中心的旁边结合有该MMP前区肽链内所含的一个半胱氨酸，该半胱氨酸阻断了活化中心与底物的结合所致。一般认为MMP的活化是一由其他MMP及血清蛋白酶介导的级联水解过程，切除N一末端前肽域并将半胱氨酸与锌离子分离，从而暴激活MMP一9等，在体外可被一系列有机汞试剂、烷基化试剂、氧化试剂及一些水解酶试剂活化。MMPS可以有基础表达，也可以有许多生长因子，细胞因子或激素诱导表达和调控，且对MMPS的调控可以在几个水平“11转录水平调节大多数细胞内并不贮存MMP，受适宜刺激后由细胞临时合成与释放，此种调节多发TATA盒及一些非调节素元件，可被一些细胞酶、生长因子及原癌基因表达物介导调节。但MMP一2基因调节序列有别于此，不含TATA盒，故较少被诱导调节，表现出管家基因的特征。一些细胞因子，如肿瘤坏死因子TNF一、白介素道未放疗、化疗的腺癌患者外周血单核细胞中MMP一9MRNA表达受TNFA和肿瘤引发MMPS的溶解因子MMPSF调控。台湾的HONGYUANHUANGNL等在子宫内膜基底细胞中应用定量竞争方法检测发现IL一12MMPS超家族0、TGF一0刺激子宫内膜基底细TIMP一3有明显的调控作用。HUANG”1等用ILL胞，24小时后受刺激的子宫内膜基底细胞MMP一9和TIMP一3表达下调，且有明显的剂量依赖性。而正常的子宫内膜基底细胞无TDIPS发现TNFO和TGFB能明显增强MMP一1、2、3和TIMPLMRNA的表达。PDGFBB使MMP一2MRNA表达上调。TGF一0、ILL3的分泌，TGF一口能刺激MT2一MMP的表达和TIMP1的分泌。JOHN”1在肾小球3的表达均有上调作用，且PMA与IL一1通过同一基因起动序列。诸多研究说明表皮生生长因子PDGF、白介素一1IL一1及一些细胞外环境均能促进MMPMRNA的转录，甚或影响其半衰期。而肝素、考的松、干扰素一IFNY则有相反的作用”1。2酶自身代谢的调节代谢调节即MMPS的合成与分解，包括前酶的合成分泌、前酶的前肽域水解、酶的活化、酶的降解失活。代谢过程中酶的活化又有生理的激活和病理的激活。前者是由血浆纤溶酶系统和间质溶解素介导，由MMP级联效应激活，尿激酶型或组织型纤溶酶原激活物激活纤溶酶原，活化的纤溶酶再激活基质金属蛋白酶。后者由许多细胞内外信息传导分子诱导而产生病理天然抑制因子的调节抑制因子的调节有特异性和非特异性。特异性抑制因子活化型的MMP可导致后者功能的丧失。非特异性抑制因子则是某些蛋白质如N巨球蛋白及一些肽类衍生物或非肽类衍生物，它们以结合MMPS的锌离子活性另一方面又诱导产生纤溶酶原激活抑制因子一Y，使纤溶酶的产生受限，从而使纤溶酶的激活不至于过度。纤溶酶诱导产生纤溶酶原激活抑制因子一Y的机制较复杂，可能系由于ECM降解导致细胞骨架改变或由于ECM降解产物引起的受体调节所致。最近有报道。，T细胞和单核细胞的相互作用可导致MMPS的释因表达的重要调控因子。3TIKIPS家族3TIMPS家族31分类和特点族。根据所发现之先后分子结构同源性及功能上的相关性将该家族分为四类组织产生。TIMPS的结构具有一定的同源性，有两个功能区N末端功能区为一大三环结构，其中的半胱氨酸残基为与MMPS锌离子活性中心结合的区域，N一末端功能区相对保守，特别是前端的22个氨基酸残基同源性较高，各型TIMPS在此22个氨基酸残基区域的同源性差异为其测序诊断的标志“E一末端功能形成复合物方面有重要意义。TIMP一1，一2，一4以可溶性小分子量多肽形式分泌，而小分子量多肽TIMP一3以不溶性形式分泌，且与分泌细胞和基质组分间的相胞和结缔组织产生，广泛存在于组织和体液中，能被多种细胞因子诱导产生含有用224个氨基酸，在心脏有高表达，在肾、胰、结肠、睾丸有低表达，肝、肺、脾、甲状腺等无表达，具有器官特异性3。32功能和调控TIMPS的主要功能是天然地抑制删PS，在调节细胞外基质的代谢中起着重要作用。其作用方式较为复杂，大多数情形下以L1的比例二者结合成复合的调控机制研究不多。一般认为其表达调控主要是受细胞内的某些激酶以及胞内外的某些激素和一些信息分子效应分子所诱导。各类TIMPS表达的调控有4涮PS个IMPS主要生理和病理生理功能示其特殊的调控机制尚不得而知。4MMPSTIMPS主要生理和病理生理功能研究结果表明，MMPS主要由体内的单核细胞，组织中的巨噬细胞如肺泡巨噬细胞及相关的组织细胞”“、肾小球上皮细胞”“、人皮肤纤维细胞、U937ERO“6。1962年在变形蝌蚪尾巴中发现的，这种酶在尾相关组织的吸收和蛙LAPI组织成熟过程中起着非常关键的作用。基于最初的发现和后来一系列有关MT4PS的研究，学者们发现MMPS的主要功能有簿解细胞外基质膜有效成分，调节细胞粘附，作用于细胞外组分或其他蛋白成分而启动潜在的生物学功能、直接或问接参与胚胎发育、组织模型再塑及创伤修复等正常生理过程。相当多的研究集中在疾病病理的发生与发展，特别是肿瘤的侵袭与转移。一般认为TIMPS天然抑制MMPS，在某些条件下却表现出调节MMPS活性，这是通过与后者的类血红素结合区作用而实现的；此外，TIMPS还在细胞生长、繁殖及刺激血管生成、肿瘤的侵袭转移方面发挥一定作用”。在妇产科方面，MMPS参与了”胚胎生长发育、产后子宫修复、排卵”“等组织重塑过程。在骨科方面，MMPS参与了正常骨吸收及骨和皮肤组织损伤的修复和愈合过程“。在风湿病方面，DEAN“”等认为在风湿病和关节炎发病过程中病过程起了重要作用。在高血压和动脉硬化方面，MANDAL”等的试验证实，与无左心室扩大的高血压患者相比，具有左室扩大的高血压患者MMP一1水平低，水平降低。GALIS。”等研究已证实，在人动脉粥样硬化斑块中，删PSMRNA表达是明显增加的，他认为在动脉硬化发生发展过程中MMPS通过增加ECM的降解和转运，参与动脉粥样硬化斑块的形成和血管重塑过程。在肿瘤方面，SANG”的研究表明，MMP一1、一2、一9在分解胞外基底膜的同时，还启动血管生成，这PLASMINGEN生成ANGIOSTATAIN，由后者阻断血管生成，间接地控制肿瘤细胞的循环周期中发挥特有的诱导细胞凋亡的作用；TIMP4既能抑制肿瘤侵袭，也能抑制肿瘤转移，其在心脏中高表