植物细胞的选育与改良

第三章植物细胞的选育与改良,南昌大学生命科学学院罗丽萍副教授,植物细胞的筛选,植物细胞的诱变,植物原生质体融合,植物细胞的基因重组与转移,离体培养下的遗传与变异特点,LarkinandScowcroft(1981)提出把由任何形式的细胞培养所产生的植株统称为体细胞无性系（somaclones），而把这些植株所表现出来的变异称之为体细胞无性系变异（somaclonalvariation）,从对生物遗传的影响而言，细胞工程技术本身即包含了双重性：遗传稳定性和变异性。对于单纯的繁殖技术而言，离体培养的技术操作是细胞或组织或个体的不断复制，因而一般来讲其繁殖群体具有较好的遗传稳定性。细胞工程还有一类技术操作，其目的就在于创造变异，如体细胞人工突变、基因转移、体细胞融合等。这些离体操作技术，在某种程度上说具有一定的目的性和方向性，可在短期内获得从自然界可能要经过几年乃至上百年的进化才能获得的性状，从而加速生物进化的进程。,第一节离体培养下的遗传与变异特点,离体培养中的遗传稳定性,影响体细胞遗传与变异的因素,离体培养下的变异,一、离体培养中的遗传稳定性,离体培养的细胞学基础是有丝分裂。有丝分裂的DNA半保留复制和染色体均等分裂机制，从理论上可以保证离体培养物在一般情况下的遗传稳定性。,在准确选择培养方式的前提下，离体无性繁殖可以具有较高的遗传稳定性（Phillip等，1994）。正是基于这一理论，利用离体培养技术建立了多种植物的无性繁殖体系。离体培养的遗传稳定性表现的另一个方面是，即使发生某些变异，也可以即时淘汰变异。,二、离体培养下变异特点,变异的普遍性,嵌合性,变异的局限性,变异的普遍性,变异发生在各种培养类型中,不同培养类型变异频率不同,与有性重组相比，体细胞突变性状具有一定局限性从表型上看，在不同植物类型中经常发生的变异主要是植株形态（株高、叶形、叶色等）、生长势、育性、某些抗性等性状的变异。从生理生化特性上看容易出现同功酶谱、次生代谢的消长等变异。,嵌合性：体细胞变异常以嵌合体的形式存在。嵌合体可能不同倍性的形式也有其它类型。嵌合体必须通过分离培养才能纯化。,三、影响体细胞遗传与变异的因素,供体植物培养基和培养方式继代培养的次数,供体植物遗传背景,倍性水平：处于二倍体水平上的细胞比处于单倍体水平上的细胞较为稳定。基因型：植物种内基因型间变异频率差异较大。,供体植物,供体植物生理状态,以分生组织为外植体的再生植株通常可以维持供体植物的典型性，体细胞变异频率很低。以分化组织为外植体的再生植株容易发生体细胞变异，其频率与分化程度有关。,供体植物,培养基激素,培养基激素浓度和不同激素配比对再生植株的染色体倍性有一定影响。激素引起的变异大多为倍性增加。少数情况下，激素引起类减数分裂而使倍性减少。,培养基及培养方式,培养基物理状态,一般来讲，悬浮培养的细胞较半固体培养的细胞易产生变异。,培养基及培养方式,培养类型,原生质体培养的体细胞变异大于细胞培养，而细胞培养的变异又大于组织器官培养的变异。在细胞培养中，性细胞培养再生植株的变异要大于体细胞培养的植株。在因培养类型引起的变异中，不仅有染色体倍性的异常变异，同时基因突变、染色体结构变异、以及非DNA水平引起的变异亦相继增加。,培养类型,继代次数,由继代次数引起的体细胞变异几乎在各种类型的植物中均有报道。一般来讲，继代时间越长，继代次数越多，细胞变异的机率就越高。烟草继代培养5年的愈伤，其再生植株与供体基因型相比，几乎没有形态正常的植株，染色体分析显示，这些植株大多为非整倍体和多倍体。玉米从刚诱导愈伤组织中分化植株，在形态上与供体基因型基本一致，但培养3年后愈伤组织的再生能力显著下降，再生植株生长异常，细胞学分析显示出染色体断裂和带型变异。,继代培养的次数,培养时间越长，变异越大,天南星科植物，块茎,菖蒲属、海芋属、魔芋属、天南星属,第二节植物细胞的筛选,植物细胞的突变包括自发突变和诱发突变。植物细胞在体外培养过程中往往发生不可期的突变，且突变性状可以稳定遗传，这种变异被称为体细胞无性系变异。如防风体细胞。植物细胞培养中，自发突变频率约为10-810-5，而诱变处理可将频率提高到10-3，同时还能获得自发突变中很难产生的新突变。诱变方法：物理法，如X射线、射线、紫外线、中子等，化学法：如甲基磺酸乙酯、亚硝基胍、亚硝基脲等。,一、细胞筛选的方法,1、小细胞团筛选法小细胞团筛选法是经常采用的常规筛选法，首先制备得到单细胞，然后在常规的培养基中经过单细胞培养，形成细胞团，通过观测细胞团的形态、颜色或者测定细胞代谢物的种类和含量，从而选出所需的细胞的选育方法。,例一：在长春花的愈伤组织培养过程中，得到不同颜色的组织块，将它们分开继代培养，3周后测定不同细胞株系的长春质碱的产量，发现白色细胞株系产量最高，以白色株系为原株进行紫外诱变，选择压为色氨酸乙酯盐酸盐，因为长春质碱合成的前体物主要有色氨酸和甲瓦龙酸，色氨酸乙酯盐酸盐是色氨酸的结构类似物，筛选得到抗色氨酸乙酯盐酸盐突变株，其中一株长春质的产量增加2.7倍。,例二：采用小细胞团筛选法，筛选花色苷含量高的玫瑰茄细胞系，获得一株高产细胞，用其进行液体悬浮培养，花色苷含量和产量分别比对照提高了14.5倍和16倍。例三：将黄连的幼叶切块诱导出愈伤组织，选择较松散的愈伤组织转入液体悬浮培养，获得游离细胞和细胞聚集体。经60Co、射线辐射诱变和平板培养，筛选出小檗碱含量相当于6年生亲本植物根茎含量的有8个细胞系，最高的细胞系含量为6.12%。,花色苷含量高的玫瑰茄细胞系筛选,(1)愈伤组织的诱导采用B5培养基，玫瑰茄未成熟的花萼或其他组织、器官为外植体，诱导培养获得愈伤组织。(2)愈伤组织继代培养及悬浮培养继代培养采用B5培养基。培养基中添加2，4-D1.0mg/L。KT：固体培养时为0.2mg/L，悬浮培养时为0.1mg/L。蔗糖：20g/L。于25、光照培养，17d继代一次。悬浮培养采用B5培养液，106r/min旋转摇床培养，其他条件同愈伤组织培养。,(3)平板培养悬浮培养至对数生长期的玫瑰茄细胞过250m铜网，单细胞得率为85.37%，23个细胞小团率为8.95%，48个细胞小团占5.68%。调整细胞密度，取一定量的细胞悬液与冷却至35以下的B5固体培养基混匀，铺于9cm培养皿平板。培养条件同上。植板率(PE%)以培养20d平板上出现的细胞团数占植板细胞总数的百分数来计算。(4)小细胞团培养采用B5培养基。于玫瑰茄愈伤组织的高色素区选择色深且颜色均一的小细胞团置于9cm平板上，每板放置16小团，密封。培养条件同前。20d后转接于50mL三角瓶中，进行继代培养。,(5)花色苷含量、产量的测定：培养细胞收获，低于40干燥至恒重，称重。取湿细胞1g，用1%HCl甲醇溶液于4浸提24h，然后测定花色苷含量。将色素含量乘以培养物产量即得花色苷的产量。结果为三次重复试验的平均值。(6)根据花色苷含量和产量测定结果，选择出高含量和产量的细胞，继代培养，获得高产细胞系。,选择,2、选择压力筛选法,即通过添加某些对不同的细胞有不同作用效果的物质，淘汰部分敏感细胞，而选择得到所需细胞的选育方法。分为正选择和负选择两种。正选择就是把受选择的细胞群体置于一定的选择压力之下，部分细胞在选择压力的作用下受到淘汰，而有一些耐受抗选择压力的细胞可以生长，从而选择得到所需的细胞。正选择适用于对抗性突变体的选择，如耐盐突变体，抗除草剂突变体等。,负选择法也叫富集选择法，经过诱变剂处理后的细胞需要及时进行选择。在最低培养基上，与未突变的细胞相比，突变细胞往往会被淘汰，选择的对象是在一定选择压的作用下不能生长的那些细胞，而能够生长的细胞受到选择。适用于对营养缺陷型突变体（通过互补作用对于体细胞杂种的选择具有重要价值）的选择。,例：负选择法分离烟草营养缺陷型突变体,单倍体细胞诱变处理基本培养基中培养96h营养缺陷型不能继续生长，野生型生长旺盛把BudR(5-溴脱氧尿苷)加入培养基中，暗培养36h所有悬浮细胞植板于完全培养基上繁殖者即为突变细胞人工加倍纯合二倍体的营养缺陷型再生植株。由于BudR只能与活跃生长的细胞中的DNA结合，并使与它结合的DNA获得光敏特性，因此当把培养物再转到光下时，BudR的光解就引起了能在基本培养基上生长的那些野生型细胞的DNA的严重损伤。而营养缺陷型细胞由于没有结合BudR，因此不是光敏的，故不受损伤。,二、影响细胞筛选效果的因素,1、亲本材料对筛选效果的影响选用优良的、仅存在个别缺点需要改进的基因型。尽量利用染色体数目稳定的细胞系，避免采用非整倍体的细胞系，因为对后者进行遗传和生化分析较困难。必须注意染色体的倍数性水平：在离体选择隐性突变的实验中应当尽量使用单倍体材料。但是单倍体细胞在体外培养不稳定，易产生多倍体。实验目的是获得显性突变或胞质突变，就不一定使用单倍体细胞系。培养细胞再生植株的能力：如果亲本细胞系不能再生植株，从其中筛选出来的变异细胞系很可能不能再生植株。故要使用再生能力强的细胞系。,2、培养方式对细胞筛选效果的影响,方式：愈伤组织、细胞悬浮、细胞固体和原生质体培养。（1）、愈伤组织培养：最常用。但存在如下缺点：和悬浮培养相比，愈伤组织的生长速率比较慢，这在某些生化突变体的选择实验中，可能会产生不利的结果。一块愈伤组织中的细胞不可能均匀地受到选择压力的作用，贴近培养基表面的细胞受到的选择压力较大；在一块愈伤组织中，细胞之间的接触相当紧密，很容易产生互馈作用，使它们有可能逃脱选择压力的作用；个别突变细胞由于周围大量非突变细胞的影响，很难生长。存活的愈伤组织很可能是嵌合体，其中有大量细胞可能只是简单地逃脱了选择压力的作用，而并非是所需要的突变体。,（2）、细胞悬浮培养方式：细胞生长较为迅速，但细胞团大小不一，过大者由于其内、外层细胞所处的环境差别较大，所受到的选择压力可能不同，不利于优良细胞的筛选。方法：可用适当孔径筛网过滤，以除去较大的细胞团。细胞悬浮培养往往与细胞固体培养结合起来，以达到较好的筛选效果。（3）、原生质体培养物：理论上讲是用于筛选突变体的最理想材料。可从植株或细胞培养物中分离原生质体，都可得到单细胞群体，在诱变剂处理和选择剂使用时比较均匀，细胞团和再生植株均来自于单个细胞，因此不可能形成嵌合体。,3、细胞生长速度对细胞筛选效果的影响细胞生长速度可能会影响离体分离突变体的成败。一些抗代谢产物在培养基中只有很短的半衰期。如果有关的细胞系生长很慢，那么抗代谢产物可能在敏感细胞死亡前降解。因此，敏感的变异体可能会在不允许其生长的条件下存活下来。生长缓慢的细胞也易发生染色体变化。4、选择压力的施加方式对细胞筛选效果的影响选择压力可一次性，也可以逐步施加。有的情况下，选择压力的施加方式直接影响选择的成败。例如，如果选择一个细胞器基因突变，最好采用逐步施加的方式。,第三节植物细胞的诱变,诱变是指通过各种诱变剂的作用，使细胞发生变异的过程。一、诱变剂物理诱变剂和化学诱变剂两大类。1、物理诱变剂包括X射线、射线、中子、粒子、粒子、紫外线等。紫外线的能量较低，不能引起被照射物质的离子化，叫做非电离诱变因子；其余物理诱变剂均能引起被照射物质的离子化，称为电离诱变因子。,物理诱变,选择辐射类型应根据培养类型进行。以组织器官为诱导材料，可以选择辐射强度较大的射线、快中子等进行辐射。以细胞或原生质体，则可以选择X射线、紫外线等。特别是以原生质体为诱导材料，可以使用紫外线照射，因为常用紫外线的波长为270nm，与DNA吸收波长260nm相近，而原生质因为没有细胞壁的屏障，对紫外线的敏感性较强，从而可以达到较好的诱变效果。,采用物理诱变剂处理的方法：外照射：射线由被照射物质的外部透入内部诱发突变。这种方法比较简单安全，可进行大量处理。又分为急照射和慢照射，前者指在较短时间内把全部剂量照完，后者指在较长时间内照射完全部剂量。内照射：将放射源引入到植物组织或细胞内使其放出射线诱发突变。常用的有浸泡法、注射法和饲入法。,2、化学诱变剂,主要分三类，包括碱基类似物、烷化剂、叠氮化合物。此外一些抗菌素也可以作为诱变剂。作用机理：(1)在DNA复制时，诱发配对错误：碱基类似物（5溴尿嘧啶是胸腺嘧啶类似物，2氨基嘌呤是腺嘌呤类似物等），在细胞内核酸复制时，这些类似物可以掺入到新合成的DNA分子中引起错配；(2)诱发染色体断裂(3)改变DNA的化学结构：烷化剂（硫酸二乙酯DES，乙基磺酸乙酯EES，甲基磺酸乙酯EMS，环氧乙烷EO，乙烯亚胺EI），此类诱变剂有一个或多个活化烷基，可与DNA分子中的碱基或磷酸基结合，改变DNA的结构而引起突变。,2、化学诱变剂,为什么双功能和多功能烷化剂的毒性要比单功能烷化剂强，对改变DNA化学结构的诱变力也大？烷化剂的活烷基能够转移到其他分子中电子密度极高的位置上去。这种通过烷基在分子内的置换作用称为烷基化作用。烷化剂通过对磷酸基、嘌呤、嘧啶基的烷基化而与DNA作用，最终生物学结果是引起遗传物质的破坏、修复与错误修复。烷化剂使用含量：甲基磺酸乙酯0.31.5%、乙烯亚胺0.050.15%、亚硝基乙基脲烷0.010.03%、硫酸二乙酯0.10.6%。,二、诱变的基本过程,单细胞制备预培养诱发突变突变细胞株的选择1、制备单细胞(1)材料的选择：用于突变体筛选的最理想的材料为单细胞或原生质体。也可以用茎尖、腋芽等，但容易诱发嵌合体，目前用得最多的材料是愈伤组织。(2)预处理：根据植物种类需对诱变剂的含量、时间进行筛选，选用最适含量、最适处理时间。(3)细胞材料的制备：愈伤组织，振荡培养，获得小细胞团和单细胞的悬浮培养物。,2、预培养：3、诱发突变一般采用平板培养法，并在培养基中加入某种选择因子，长时间饲喂，使细胞发生拟定目标的突变。4、突变细胞的选择将在具有选择因子的培养基中培养数月的细胞团，转入不加选择因子的培养基中培养，数周后，再转入具有选择因子的培养基上，选择能旺盛分裂的细胞团(或细胞株)，说明该细胞团具有抗某种选择因子的突变细胞株。5、突变细胞的遗传分析和鉴定.生化分析、细胞学观察、性状分析。分析突变是属于遗传的变异，还是属于非遗传的。,第四节植物原生质体融合,两种异源(种、属间)原生质体，在诱导剂的诱发下，相互接触，从而发生膜融合、胞质融合和核融合形成融合体，再经过细胞壁再生形成杂种细胞的过程，称为原生质体融合或称为细胞融合。受精作用是一种自发的融合，而原生质体由于质膜表面带有负电荷，它们之间通常是相互排斥的，所以自然融合频率极低。所以要采用一定的方法加以诱导以促进原生质体的融合。,理论上说任何细胞，都可能通过体细胞杂交而成为新的生物资源。这对于种质资源的开发和利用具有深远的意义。融合过程不存在有性杂交过程中的种性隔离机制的限制，为远缘物种间的遗传物质交换提供了有效途径。体细胞杂交产生的杂种细胞有来自双亲的核外遗传系统，在杂种的分裂和增殖过程中双亲的叶绿体、线粒体DNA亦可发生重组，从而产生新的核外遗传系统。,几个重要进展,1960年，Cocking用酶法制备高等植物原生质体首次获得成功；1970年，Power首次用硝酸钠为诱导剂进行了较大规模的原生质体诱导融合；1971年，Takebe首次从离体烟草原生质体培养中获得再生完整植株；1972年，Carlson首次获得粉蓝烟草和郎氏烟草的细胞杂种，这也是第一个植物细胞杂种；1974年，Kao将聚乙二醇诱导融合法应用于植物细胞融合并建立了相应的融合技术；1978年，Melchers获得了第一个属间细胞杂种（番茄马铃薯）；1981年，Zimmerman发明了电融合仪，并首次提出了电融合概念；1987年，Schweiger建立了单对原生质体电融合技术程序。,GeneticTransferinPlantsthroughInterspecificProtoplastFusion,根据融合时细胞的完整程度，原生质体融合可分为两大类：对称融合：两个完整的细胞原生质体融合。非对称融合：利用物理或化学方法使某亲本的核或细胞质失活后再进行融合，它可以分为几种。(亲本供体仅以胞质基因或部分核基因转移到受体一方),用于细胞核或细胞质失活的方法分为物理和化学两大类：,物理方法常采用射线处理，如X射线、射线等，它们能使细胞核失活；化学处理目前常用的试剂有：核失活：碘乙酰胺（IOA）、碘乙酸(Iodoacetate)；质失活：罗丹明（R-6-G，它是一种亲脂染料，能够抑制线粒体的氧化磷酸化过程而达到失活作用。,体细胞融合与有性杂交的比较,2、细胞融合情况,1、正反有性杂交情况,原生质体的融合过程包括三个主要阶段：一是凝聚作用阶段，其间两个或两个以上的原生质体的质膜彼此靠近；二是在很小的局部区域质膜紧密粘连，彼此融合，在两个原生质体之间细胞质呈现连续状态，或是出现桥；三是由于细胞质桥的扩展，融合完成，形成球形的异核体或同核体。,一、原生质体融合的方法,1.无机盐诱导融合用来做融合剂的无机盐是硝酸钠。1972年Carlson就是用它来融合烟草的原生质体，并首次获得种间的体细胞杂种。原理：硝酸钠中和了质膜的负电荷，使原生质体不再相互排斥，而紧密结合在一起。但硝酸钠对原生质体有害作用，且诱导频率也很低，所以目前很少有人采用。,2.PEG诱导融合法PEG诱导融合的特点：用此方法的诱导频率可以高达10-50%。并无种属特性，几乎可以诱导任何原生质体之间的融合。优点是融合成本低，勿需特殊设备；融合子产生的异核率较高；融合过程不受物种限制。缺点是过程繁琐，PEG可能对细胞有毒害。作用机理：由于PEG分子具有轻微的负极性，故可以与具有正极性基团的水、蛋白质和碳水化合物等形成H键，从而在原生质体之间形成分子桥，其结果是使原生质体发生粘连进而促使原生质体的融合；另外，PEG能增加类脂膜的流动性，也使原生质体的核、细胞器发生融合成为可能。,方法：（1）以常规的方法收集原生质体，将两亲本的原生质体高密度等体积混合。（2）滴3滴混合的原生质体悬浮液于载玻片上，放置10分钟。（3）加PEG450L。PEG的制备方法：1gPEG加入pH5.5的2ml的0.1mol/L的