【毕业学位论文】（Word原稿）多菌灵酶联免疫分析技术研究免疫分析技术及其应用硕士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 硕士学位论文 多菌灵酶联免疫分析技术研究 : 国农业科学院硕士论文 摘要 i 摘 要 鉴于我国有机磷和氨基甲酸酯农药的大量应用，蔬果中农药残留超标不容忽视。为了满足我国农产品现场和快速检测的需要，选取应用广泛、具有广谱杀虫效果和具有 代表性 的氨基甲酸酯类农药多菌灵作为研究对象，根据酶联免疫分析的原理，试图 建立快速、低成本、适宜于现场检测的多菌灵残留的酶联免疫快速检测技术， 为 进一步 研制 剂盒 及其工艺流程定型 提供基础， 也将为蔬果 中农药残留的快速、现场检测和监控提供技术支撑。 多菌灵，通用名 子式： 学名称 ，与苯菌灵等具有相似的特异结构 苯并咪唑，与 托布津、甲基托布津的代谢物结构相同。 本研究设计了两条多菌灵半抗原的合成路线。其一，活化 苯 并 咪唑环上的 亚氨基 ， 使之带上可以利用的羟基 ，合成半抗原 1氧羰乙基丙酸 2苯并咪唑氨基甲酸甲酯 ，多菌灵中的 苯并咪唑环和氨 基甲酸甲酯部分均 被 保留 ；其二 ， 多菌灵原药在碱性条件下水解，生成 2氨基苯并咪唑氨基甲酸甲酯，再经 琥珀酰化，得到半抗原 2琥珀酰苯并咪唑。合成的两种半抗原经核磁共振和红外鉴定，证明合成成功。分别采用混合酸酐法、活性酯法使两种半抗原与蛋白质偶联制备了免疫原 包被原 联比均在 3 35： 1 之间，符合小分子免疫的要求。 经过免疫得到了抗血清，但是第一种免疫原的抗血清效价较低，不满足 法的要求。而第二种免疫原 制备 的 多克隆抗体，效价在 64000 以上，同时除了与苯菌灵具有很高的交叉率 、与噻苯达唑交叉率达到 8外，与托布津、甲基托布津等其它农药的交叉率均小于 2，符合 析技术建立对 抗 血清效价 的要求，并用辛酸一硫酸铵盐析法对抗血清进行纯化。 本研究从包被条件与方法选择、抗体 （抗血清） 工作浓度优化和基质条件优化（盐浓度、 方面初步得到间接 析的最佳工作条件，并在优化条件下建立多菌灵检测的间接 ，抑制率与多菌灵的浓度对数值呈显著的线性关系，符合回归方程Y=x)+回归 系数 ，测定范围 ， 最低 检测 10%的甲醇提取中的添加回收率平均为 109，变异 系数 16 ， 初步鉴定 满足多菌灵的实际检测需求。 采用多菌灵间接 对 结构类似 物进行交叉反应试验。当多菌灵对抗体抗原反应的抑制率为 50%时，所需多菌灵的浓度为 g，苯菌灵的浓度为 4.0 ng/g，噻苯达唑浓度为 30 ng/g，交叉反应率为 8%，甲基托布津、托布津浓度均大于 200 ng/g，交叉反应率为小于 2%， 2氨基苯并咪唑浓度大于 500 ng/g，交叉反应率小于 此法可以 用于苯菌灵及其代谢物多菌灵的检测 ，但是如何区分苯菌灵和多菌灵残留尚需进一步研究 。 以建立的 测方法对来自土壤和水中的添加样品进行回收实验，并与常规的 接 测定土壤中多菌灵的添加回收率土壤中回收率为 109，变异 系数 ，河水中的回收率为 变异 系数 ，纯水中变异 系数 16 ，平均回收率 109。 综合分析， 所 建立的多菌灵间接 ，可适用于 现场快速检测 ， 成本 和简便性等方面较传统的仪器分析 具 有明显的优势。 关键词： 多菌灵，苯菌灵，农药残留，酶 联 免疫分析 中国农业科学院硕士论文 t is of in in to of In to of in to a a to a to an of in ， as of of of as (1) To on to of 1(2) To to 2NM R of of of , of of 4000 by It to 00%), to as It to of of of of A in N of Y=x)+ is x of , , of 09% 6. of to of .0 ng/g 30 ng/g %， 00 ng/g %，00 ng/g is to 国农业科学院硕士论文 At g/ BC in 09 in % of to 国农业科学院硕士论文 目录 I 目 录 摘 要 . i . 录 . I 第一章 引 言 . 1 药残留免疫速测研究的意义 . 1 药免疫检测技术基本原理 . 2 疫与抗原抗体反应 . 2 分子免疫 . 2 药免疫检测原理 . 3 药免疫检测技术研究的方法 . 3 抗原的分子设计 . 3 抗原与载体蛋白的偶联 . 3 药人工抗原偶联比例的测定 . 4 药免疫分析的发展趋势 . 4 疫传感器 . 5 组分分析物免疫分析 (. 5 动注射免疫分析 (. 5 疫 术 （ . 5 疫亲和层析 . 6 研究的立题依据及意义 . 6 第二章 多菌灵人工抗原的合成与鉴定 . 7 料与方法 . 7 学试剂及主要仪器 . 7 菌灵结构类似物的合成与鉴定 . 8 菌灵人工抗原（免疫原和包被原）的制备及鉴定 . 10 果与分析 . 13 抗原核磁的鉴定结果 . 13 工抗原的紫外图谱 . 15 菌灵抗原的生物鉴定 . 17 论 . 19 于多菌灵半抗原结构类似物的设计 . 19 于多菌灵抗原的合成与鉴定 . 19 第三章 定量测定多菌灵的间接竞争 法的建立 . 20 料与方法 . 21 剂及主要仪器 . 21 体制备纯化及其特性考察 . 23 菌灵竞争 佳工作条件的确定 . 24 测方程的建立及添加回收试验 . 26 果与分析 . 26 体的特性 . 26 菌灵竞争 佳工作条件的确定 . 27 中国农业科学院硕士论文 目录 检测方程的建立及添加回收试验 . 31 论 . 33 于抗体的特性 . 33 于抗体最佳工作浓度的确定 . 34 于影响 测方法的系列因素 . 34 于标准曲线的实用性 . 34 第四章 主要结论 . 35 要结论 . 35 工抗原 的设计合成 . 35 多菌灵多克隆抗体的制备 . 35 菌灵残留 接竞争）的建立 . 35 菌灵残留 接竞争）的检验 . 36 参考文献 . 37 致 谢 . 43 作者简历 . 44 中国农业科学院硕士论文 第一章 引言 1 第一章 引 言 药残留免疫速测研究的意义 我国农业生产持续、稳定增长，农产品供给由长期短缺到总量基本平衡、丰年有余，同时，也付出了资源 过度消费和环境质量日益恶化的沉痛代价。化肥、化学农药、除草剂等农用化学品的长期、大量、不合理使用，对我国农业生态环境和农畜产品的安全生产及人体健康与生命构成了严重威胁。全国每年因农业污染造成的直接经济损失高达 160 多亿元。 20 世纪 90 年代以来，我国 蔬菜和水果农药残留引起人畜中毒死亡事件频繁发生。据统计， 1981 ，死亡 ， 1985 年全国农药中毒人数 ，死亡 ；近 10 年来，我国平均每年发生中毒事故约 10 万人，死亡 1 万多人（单正军等， 1997）。其中 1992 年至 1996 年全国 26个省市发生农药中毒事件 247349 例，死亡 24612 人 (陈曙阳 王鸿飞， 1997)，我国每年因农药中毒的人数占世界同类事故中毒人数的 50%。据农业部 2000 年底对我国 14 个省会城市 2110 个样品的检测结果，蔬菜中农药超标 率 高达 其中北京、天津、上海、广州、南宁、昆明等大城市蔬菜农药 残留超标率超过 50%(彭红兰 陈永宁， 2000)。近年来，我国蔬菜、茶叶出口中每年因 农药 残留超标而被进口国拒收、扣留、迟货、索赔、终止合同、拒绝入关等事件时有发生，给国家带来巨大的经济损失并丢失了国际市场，有损国家形象。随着我国加入 及人民生活水平的提高，在国际农产品贸易中，将面临更加苛刻 的 农药残留 等有毒化学品残留标准的制约。同时，我国的农贸市场小而多，中规模以上的就有 5000 多个，农药残留的检测与市场准入控制将面临大量的农药残留超标筛选，缺少快速 、 灵敏 、 准确的检测技术就难以进行，难以消除消费者的心理 影响。所以农药残留的快速检测问题，已成为我国农产品生产和贸易发展的重要制约因素之一。急需研究建立蔬、果、茶 中农药残留 快速检测技术，研发小型、便携、适于现场检测快速实用的速测产品，为农产品安全生产与 市场监控 提供技术支撑。 国内已有的检测技术和仪器设备重点是对产后农产品农药残留的精确测定， 而 对残留快速检测技术及速测产品的研制起步晚 。 随着我国人民生活现代化和生活质量的不断提高，消费者对蔬、果、茶等农产品中 的 农药 残留提出了更高的要求，现有的速测技术 不能满足我国农 产品安全生产监测及广大消费者的需求。 随着待测样本 数 量 ，特别是要求现场快速检测样品 数 量的迅速增加，迫切需要开发和运用高效 、 快速 的 新技术 和方法 。为了满足当前农药残留 检测 的要求，有效地开展快速筛选和监测农药残留的危害，一些新兴的分析技术不断涌现，如农药残留的多残留快速检测方法等均取得了进展。农药残留检测技术不断朝着更加快速、方便、灵敏与可靠的方向发展。 免疫分析法 (一种以抗体作为生物化学检测器，对化合物、酶或蛋白质等物质进行定性和定量分析的技术，它基于抗原与抗体的特异性反应，具有特异性强、灵敏度高 (检测限可达 1 1000 )、方便 快捷、分析容量大、检测成本低、安全可靠等优点。一般不需要贵重仪器 ， 可大大简化甚至省去前处理过程 ， 对使用人员的 专业 技术要求不高 ， 容易普及和推广 ，尤其适宜现场筛选和大量样品的快速分析 。 该技术开发的产品 检测试剂盒 ， 可广泛应用于大量中国农业科学院硕士论文 第一章 引言 2 样品的快速 筛选 检测 和现场检测 。 20 世纪 90 年代以来它在检测粮食、水果、蔬菜、肉、奶、水和土壤中农药的残留分析上得到迅速发展 ， 成为研究比较多的一项分析技术。世界粮农组织 ( )已向许多国家推荐此项技术。因此 ， 人们称免疫分析技术是 21 世纪最具竞争性和挑战性的检测分析技术。 药免 疫检测技术基本原理 疫与抗原抗体反应 脊椎动物机体具有免疫系统，当异源性大分子进入体内时，能刺激机体发生保护性应答反应（免疫反应），产生特异性的保护物质（免疫球蛋白 即抗体）来识别该异源物质（即抗原或免疫原）并与之结合，从而“钝化”该物质以排除其干扰。抗原与抗体的结合反应是高特异性的，主要依靠抗原与抗体间结合位点相关空间结构的精密“锲合”和范德 华 力 等维系 。抗体抗原结合反应符合质量作用定律，因而反应不仅可以在体内进行，也可以在体外进行。 分子免疫 抗原的免疫原性与分子的大小密切 相关。凡具有免疫原性的物质，分子量常大于 10000，分子量小于 5000 的一般免疫原性很弱，特别是分子量在 1000 以下的小分子几乎无免疫原性。抗原物质要求有一定的分子量，同时也要有一定的分子结构和空间构象。分子结构和空间结构复杂者抗原性强，如含有芳香族氨基酸和碱性氨基酸的蛋白质较含其他氨基酸者抗原性强。抗原分子的空间构象，即基团之间的相互立体关系，是决定抗原性重要的因素，但是空间构象是最容易受到破坏的因素。 一种抗原物质刺激机体产生相应的抗体，这种抗原只能与相应的抗体相结合发生反应，即抗原的特异性（ 也就是所谓的抗原所引起的免疫应答具有极强的针对性。抗原的的分子量，结构复杂性和特异性不决定于整个抗原分子，而决定于抗原分子表面具有特殊立体构型和 免疫活性的化学基团，这些基团易为机体的免疫应答所针对，是与抗体相结合的部位，这个区域或基团称为抗原决定簇（ 又称抗原表位（ 实验证明，将某些简单的化学基团，如羧基（ 磺酸基（ 砷酸基（ 别连接在苯胺或其他芳香胺上，通过偶氮化作用，使之与血清蛋白相连 接，形成的产物称为偶氮蛋白质。这些物质的抗原特异性决定于新结合上去的暴露于表面的简单化学基团，而不在蛋白质本身，这就是半抗原的免疫机理。 抗原特异性决定于抗原决定簇的性质、氨基酸或碳水化合物的种类、序列及空间立体构型。空间构象与抗原特异性有 密切 关系，光学异构性对免疫原性也有很大影响。 D 型低于 L 型（氨基酸中，除甘氨酸外，都有不对称碳原子，都有旋光性）。旋光性 也 影响抗原的特异性。例如，把酒石酸的光学异构物分别和对硝基苯胺缩合，经重氮化再连接到蛋白质载体上，以研 究其抗原特异性，结果表明，其免疫原性互不相同。 中国农业科学院硕士论文 第一章 引言 3 药免疫检测原理 农药的分子量大多小于 1000，这些小分子物质尽管具有反应原性，可与特异性抗体相结合形成半抗原抗体复合物，但是本身通常没有免疫原性，不能直接刺激动物机体产生特异性抗体，但当它们与蛋白质载体结合后即可获得免疫原性。此外，小分子物质本身也不能被现有的固 相 载体吸附，而必须与载体蛋白偶联后，才能通过载体蛋白的作用将农药半抗原包被在固 相 载体上。包被在固 相 载体上的半抗原（定量）和待测液中的半抗原（待测物质）竞争地与限量抗体结合，通过测定半抗原 抗体复合物的量计算待测物的含量。 药免疫检测技术研究的方法 抗原的分子设计 农药相对分子质量一般小于 1000， 不具备刺激机体产生针对农药抗原决定 簇 的特异 抗体 ，必须与大分子物质连接后才能刺激机体产生抗体，这也是小分子免疫分析的基本模式。半抗原的结构对方法的检出限和选择性至关重要，因此，首先需要合成可直接与载体 (一般为蛋白质 )偶联，并能最大程度模拟待测分子结构的半抗原。理想的半抗原，一方面应具备待测物的结构特征，特别是立体结构；另一方面与载体连接后应保证该特征结构能最大程度地 为与 免疫活 性细胞识别 ，并与之 结合，以制备出具有预期选择性和亲合性的抗体。典型的半抗原结构应具备适当 的 末端活性基团，如 ，同时活性基团与载体之间应具备一定长度的间隔臂，一般为 3 6 个碳链长度 (0.8 间隔臂一般为非极性，且除供偶联的活性基团外，不应有其它高免疫活性的结构，如苯环、杂环等，以降低抗体对间隔臂的识别和间隔臂对待测物结构特征的影响 。此外， 间隔臂还应远离待测物的特征结构部分和官能团，有利于高选择性和高亲合性抗体的产生。 研究表明，半抗原的合成应该遵循以下几个 基本原则： (1)间隔臂 (或连接分子 )应尽量避免连接在目标分子的官能团处或靠近官能团处，而是最好位于重要的特征性官能团的远端，否则会减少抗体与目标分子的识别和结合位点。 (2)对于结构类似的一类化合物，间隔臂应当在它们具有相同结构 (或类似结构 )的位置连接，以最大限度的使分子的独特部位暴露。间隔臂长 度一般以 3 或 0. 58宜。 (3)尽可能避免间隔臂含较强的决定簇 (如芳环、共轭双键或杂环等 )，通常以含末端活性基团的链烷 烃 为宜，以减少所产生的抗体对间隔臂的过度识别而降低对目标分子的识别能力。 抗原与载体蛋白的偶联 大多数农药都是小分子化合物，本身没有免疫原性，它们必须与大分子物质连接后才能刺激机体 产生特异性抗体 。 所以，需要首先合成能直接与载体偶联并能最大程度模拟待测分子结构的半抗原。半抗原通常由待测农药衍生物制备或由原料合成，在其结构的末端需有可直接与载体蛋白质偶联的活性基团，常用的活性基团有 。半抗原与载体蛋白的偶中国农业科学院硕士论文 第一章 引言 4 联即人工抗原的合成。常用的载体蛋白有牛血清白蛋白（ 人血清白蛋白 (兔血清白蛋白 (猪血清白蛋白 ( 钼 孔血蓝蛋白 (卵清蛋白 (。根据半抗原 (待测农药改造物 )的结构 特征 ，常用的连接方法主要包括：通过羧基连接的混合酸酐法和碳二亚胺 (；通过羟基连接的琥珀酸酐法；通过醛基连接的戊二醛法；通过酚基连接的重氮化法；通过氨基连接的 应和丙烯酸法；通过酮基连接的氨基氧乙酸法等。 一般 认为每个分子载体上连接的半抗原分子数以 10 左右为宜，过高结合比抗原易导致动物免疫耐受。 药人工抗原偶联比例的测定 鉴定农药人工抗原最常用的方法是紫外光谱扫描法，如果人工抗原的紫外吸收图谱 不同于原载体蛋白和半抗原的紫外扫描图谱，则证明人工抗原合成成功。半抗原、 偶联物进行紫外扫描，根据半抗原偶联物在紫外区域的吸收约等于游离蛋白和半抗原吸光值的简单加和的特点，可通过三者在 280吸光值推算其可能的结合比。本论文即采用该法。计算公式如下： K A B 式中： 偶联物中 A、 、 物质在 物质在 物质在其最大吸收波长下的吸光值。 物质在其最大吸收波长下的吸光值。 物质在 物质在 大波长下的吸光值。 物质最大吸收波长下的吸光值。 物质最大吸收波长下的吸光值。 药免疫分析的发展趋势 20世纪 90年代以来，一些新方法和新手段的出现，有力地推动了农药免疫分析技术的快速发展。如分析农药小分子的结构，深入探讨其抗原决定簇的位置，通过化学方法封闭或突出某些特定的抗原决定簇，就可制备该决定簇的特异性抗体，以增加检测的特异性，避免交叉反应；也有人提出可以考虑用能产生部分交叉反应的结构类似物，制成合适的免疫抑制原，对动物进行选择中国农业科学院硕士论文 第一章 引言 5 性免疫抑制， 然后用相应的抗原进行免疫，可提高抗原对该物质识别的特异性；把免疫分析与其它技术联用，如免疫分析与流动注射系统相结合形成流动注射免疫技术，免疫分析与传感器结合形成免疫传感技术，免疫分析与气相、液相色谱联用等，都充分利用了两种技术的优势，既可增加检测的灵敏度又可降低交叉反应；多组分分析物免疫分析的应用，为多种农药暴露检测以及混配农药分析创造了条件 ； 利用分子生物学技术进行 备具有抗原完整功能的抗体片断，并在生长繁殖迅速的生物体如大肠杆菌上进行足够量表达，就可大大缩短特异性抗体制备时间等。 疫传感器 免疫传感器（ 将免疫测定法与传感技术相结合而构建的一类新型生物传感器 ， 应用于痕量免疫原性物质的分析研究。它利用动物体内抗原、抗体能发生特异性吸附反应的性质，将抗原（或抗体）固定在传感器基体上，通过传感技术使吸附发生时产生物理、化学、电学或光学上的变化，转变成可检测的信号来测定环境中待测分子的浓度。被用于分析的对象从复杂的病毒、微生物、生物毒素，到简单的农药分子、工业有机污染物、重金属离子等各种物质，成为检测食品中痕量有害物质方法的研究热点。近年来，根据免疫化学原理研 制出的微型生物传感器在现场监测、原位分析、在线分析、微区分析、动态跟踪监控等方面显示出诱人的开发前景。 组分分析物免疫分析 (多组分分析物免疫分析（ 指在同一份样品中，同时测定两种或两种以上的相关分析物的免疫分析技术。这种技术的应用对需要检测多种物质的综合测定提供了重要信息，有利于环境、食 品 中 多种农药残留和职业中多种农药接触检测，特别是对混配农药接触分析以及对其联合作用及体内代谢动力学的探讨和研究具有重要意义。 动 注射免疫分析 (1980 年 S 等将流动注射分析 (与特异性强、灵敏度高的免疫分析 (为一体 ， 创立了流动注射免疫分析法 (它是将抗体固定在适当载体膜上制备均匀一致的抗体膜带（可分段使用），将膜带的一部分安装于密封但有样品进出口的微型槽内，从进口处注入待测样品和酶标样品的混合液，竞争性结合反应在微型槽内进行，反应所 引起的特定物理或化学参数的变化由配套的检测系统检测出来， 该法分析速度快，自动化程度高， 目前已在药物分析、环境监测及农残检测等方面得到了广泛应用。 疫 术 （ 将抗原抗体反应的高度特异性与 术的高灵敏度、高自动化、操作简便等特点结合起来，形成了免疫 术，开创了免疫检测技术的新时代。免疫 抗原抗体特异性反应与 大的扩增能力结合在一起，使免疫分析的灵敏度进一步提高，是目前为止最为敏感的检测方法之一，理论上可以检测到一个抗原分子的存在。免疫 基本原理与 第一章 引言 6 基本相似，所不同的是用一段可扩增的 子代替 的酶来放大检出信号。 疫亲和层析 将纯化后的抗体固定到适当固相载体上制成免疫吸附剂。利用农药小分子的反应原性和抗原抗体结合的特异性以及一定条件下能可逆解离的原理，以免疫吸附剂为固定相，对复杂样品中超微量农药残留进行选择性吸附，然后在适当条件下洗脱，从而选择性地提取与浓缩超微量农药残留。所得提取物可直接用 理化分析方法进行检测。大大简化了样品前处理过程，提高了提取效率。免疫亲和层析是提高农药残留 分析灵敏度、选择性、准确性和可靠性的一项具有很高实用价值的配套技术。虽然固相免疫吸附剂可再生利用，但其制备所需代价较高，使用和保存寿命有一定限度，尚待深入研究解决。 总之，免疫检测技术已广泛应用于细菌、毒素、农残、兽残，重金属等的检测。它以高特异 、灵敏 、 廉价、快速等特点，已在国外环境和食品安全检测中占有一定的位置。今后随着分子生物学、基因工程及电脑技术的发展，可望合成更高亲和力和特异性的抗体并使其操作自动化，从而推动免疫分析技术的进步，提高食品安全检测的有效性和实用性。 研究的立题依据及意义 70 年代以来，随着有机氯类农药受到禁用或限用，有机磷农药的高毒性、高残留，以及抗有机磷农药昆虫品种的日益增多，因而氨基甲酸酯类农药的使用量逐年增加，这就使得氨基甲酸酯类农药的残留情况倍受关注。多菌灵，有效成分为 一个广谱内吸性氨基甲酸脂类杀菌剂，对子囊菌、担子菌和半知菌类中大多数病原菌都有效，目前正广泛用于小麦赤霉病（特效）、水稻稻瘟病、水稻纹枯病、谷类黑穗病、棉花菌病及红薯黑斑病的防治 。 但大量使用造成在空气、土壤和水中的持久残留，不仅造成环境污染，而且对人体