蛋白复习总结

1 蛋白质测序策略 蛋白质测序策略 确定蛋白质的纯度在 97 以上 测定多肽链的数目 拆分多肽链 分析每一条多肽链的氨基酸组成 鉴定多肽链的 N 末端和 C 末端氨基酸残基 用两种以上方法把多肽链裂解成较小的肽段 测定各肽段的氨基酸序列 把各肽段拼接成完整的多肽链 确定二硫键的位置 2 蛋白质组学的研究特点 蛋白质组学的研究特点 同一性与多样性 有限与无限 静态与动态 时间与空间 孤立行为与相互作用 单一手段和多种技术 互补与互助 3 蛋白质组学研究任务 蛋白质组学研究任务 内容 内容 了解某种特定的细胞 组织或器官制造的蛋白质种类 明确各种蛋白质分子是如何 让形成类似于电路的网络的 描绘蛋白质的精确三维结构 揭示其结构上的关键部分 如 与药物结合并且决定其活性的部位 当前任务 当前任务 发展高通量 高灵敏度 高准确性的研究技术平台 研究目的 研究目的 分离蛋白 显示差异 将表现型与功能联系起来 寻找蛋白质之间的相互作用 动态地反映生物体所处的状态 4 蛋白质组学研究的两种策略 蛋白质组学研究的两种策略 1 竭泽法 采用高通量的蛋白质组研究技术分析生物体内尽可能多的乃至全部的蛋白质 2 功能法 研究不同时期细胞内蛋白质组成的变化 如蛋白质在不同环境下的差异表 达 以发现有差异的蛋白质种类为主要目标 5 蛋白质化学和蛋白质组学的不同蛋白质化学和蛋白质组学的不同 蛋白质化学 蛋白质组学 单一蛋白质 复杂混合物 全序列分析 部分序列分析 强调结构与功能 强调通过数据库匹配进行蛋白质鉴定 结构生物学 系统生物学 6 氨基酸的分类及结构特点氨基酸的分类及结构特点 1 非极性 R 基氨基酸 Ala Val Leu Ile Pro Phe Trp Met 共 8 种 这类氨基酸 在水中的溶解度较小 2 极性 R 基氨基酸 不带电荷的极性 R 基氨基酸 Ser Thr Tyr Asn Gln Cys Gly 带正电荷的 R 基氨基酸 Lys Arg His 带负电荷的 R 基氨基酸 Asp Glu 7 脂肪族氨基酸 脂肪族氨基酸 甘氨酸 Glycine 丙氨酸 Alanine 缬氨酸 Valine 亮氨酸 Leucine 异亮氨酸 Ileucine 亚氨基酸 亚氨基酸 脯氨酸 Proline 含硫氨基酸含硫氨基酸 甲硫氨酸 Methionine 半胱氨酸 Cysteine 芳香族氨基酸芳香族氨基酸 苯丙氨酸 Phenylalanine 酪氨酸 Tyrosine 色氨酸 Trytophan 碱性氨基酸碱性氨基酸 精氨酸 Arginine 赖氨酸 Lysine 组氨酸 Histidine 酸性氨基酸酸性氨基酸 天冬氨酸 Aspartate 谷氨酸 Glutamate 含羟基氨基酸含羟基氨基酸 丝氨酸 Serine 含酰胺氨基酸含酰胺氨基酸 天冬酰胺 Asnaragine 谷氨酰胺 Glutamine 8 残基 残基 在肽链中氨基酸之间脱去一个水分子 脱水后的残余部分叫残基 residue 因 此蛋白质肽链中的氨基酸统统是残基形式 9 氨基酸的特性氨基酸的特性 一般一氨基一羧基的氨基酸等电点在 pH 6 左右 这是由于羧基的解离 程度大于氨基 故 pI 偏酸 碱性氨基酸 pI 在 pH 10 左右 酸性氨基酸的 pI 在 pH 3 左右 氨基酸水溶液中其解离度与溶液的氨基酸水溶液中其解离度与溶液的 pH 有关 有关 向氨基酸溶液中加酸时 羧基接受质子 使 氨基酸带正电 加碱时 氨基释放质子 与 OH 中和 使氨基酸带负电 当溶液的 pH pI 时 氨基酸以两性离子存在 当溶液的 pH pI 时 氨基酸溶液中正离子占优势 当溶液的 pH pI 时 氨基酸溶液中负离子占优势 10 氨基酸的化学性质氨基酸的化学性质 与亚硝酸的反应 Van Slyke 定氮 与甲醛的反应 氨基滴 与酰化试剂的反应 氨基保护基 与二甲基氨基萘磺酰氯 DNS Cl 的反应 测序 与 2 4 二硝基氟苯 FDNB 的反应 测序 与 Edman 试剂 PITC 苯异硫氢酸酯 测序 羧基参加的反应 羧基参加的反应 1 成盐和成酯反应 可用于羧基的保护 2 成酰氯反应 可用于羧基的活化 3 脱羧基反应 是生成胺类的重要反应 4 叠氮反应 可用于羧基的活化 11 蛋白质功能的多样性 蛋白质功能的多样性 a 催化 大多数酶是蛋白质 b 调节 如激素和反式作用因子 c 转运 如血红蛋白 血清蛋白 载酯蛋白 膜转运蛋白等 d 贮存 如种子蛋白和卵清蛋白 e 运动 如肌肉 微管蛋白等 f 结构成分 如角蛋白 胶原蛋白等 g 支架作用 如锚定蛋白 连接蛋白等 h 防御和进攻 如抗体 毒蛋白等 i 特殊功能 如甜蛋白 胶质蛋白等 12 氨基酸组成的分析氨基酸组成的分析 a Edman 化学降解法 用此原理已制成蛋白质序列分析仪 若每次循环的准确度为 99 经 60 次循环 准确度为 0 9960 0 54 b 降解法 可用氨肽酶和羧肽酶 只能测出末端的几个氨基酸 羧肽酶 Y 可作用 于任何氨基酸 有可能以此为基础开发出新的氨基酸的顺序测定仪 c 根据核苷酸序列推定法 分离 mRNA 经反转录测定 cDNA 的核苷酸序列 再用 遗传密码推定氨基酸序列 d 质谱法 可分析微量的肽链 短肽在第一台质谱仪中经电喷射电离 按荷质比分 离 依次在经碰撞池被裂解成离子碎片 在第二台质谱仪中测出各个离子碎片的 谱线 推算出短肽的氨基酸序列 在蛋白质组学中应用广泛 但不能区分亮氨酸 和异亮氨酸 13 为何要进行作图分析为何要进行作图分析 1 基因组计划的基本目标是获得全基因组顺序 在此基础之上再对所获得的序列进行解 读 获取基因组顺序的主要方法是进行 DNA 测序 然后再将所获取的顺序进行组装 以得到完整的基因组序列 2 基因组测序的第一步是构建基因组图 然后将基因组区段分解后逐个测序 最后进行 组装 3 基因组作图的基本构想 在长链 DNA 分子的不同位置寻找特征性的分子标记 根据 标记将包括这些序列的克隆进行连锁定位 绘制基因组图 该图一旦构建好 即可着 手进行全基因组测序 14 以基因组作图为指导的 以基因组作图为指导的 2 种测序策略 种测序策略 1 直接鸟枪法 首先进行全基因组鸟枪法测序 再以基因组图的分子标记为起点将鸟 枪法 DNA 片段进行组装 高密度的基因组图分子标记可以检测组装的 DNA 片段是 否处在正确的位置 并校正因重复顺序的干扰产生的序列误排 这是一种由下至上 bottom to up 的测序策略 2 重叠群 contig 法 重叠群是指相互间存在重叠顺序的一组克隆 根据重叠顺序的相 对位置将各个克隆首尾连接 覆盖的物理长度可达 Mbp 在单个的重叠群中 采用 鸟枪法测序 然后在重叠群内组装 这是一种从上至下 up to down 的测序策略 15 遗传图的绘制 遗传图的绘制 有性杂交实验 根据需要有计划地实施杂交方案而后进行连锁分析 如果蝇 老鼠以及 玉米 水稻等动植物的遗传学实验 系谱分析 不能进行有计划的遗传实验 只能收集家系成员的相关资料进行连锁分析 主要涉及人类以及多年生的树木等 DNA 转移 不发生减数分裂的生物 如细菌与病毒基因组的连锁分析 16 为什么要绘制物理图 遗传分析绘制的基因组图为何不能指导基因组计划的测序 为什么要绘制物理图 遗传分析绘制的基因组图为何不能指导基因组计划的测序 遗传图的分辨率有限 这一点对微生物不成问题 因为微生物基因组较小 记录成百上 千次实验就能获得十分详尽的遗传图 其标记分布密度仅为数千个核苷酸 而人类及大多 数高等真核生物由于不可能获得大量的后代 只有少数的减数分裂事件可供研究 连锁分 析的分辨力受到很大的限制 因而难以达到基因组测序对基因组图的标记分辨率的要求 遗传图的精确性较低 由于重组热点的存在使得染色体某一区段的交换频率高于其他区段 尤其是倒位区段 由于受到交换限制 无法绘制精确的遗传图 由于存在以上两个局限 因而在进行大规模的 DNA 测序之前 对大多数的真核生 物的遗传图必须进行验证并利用其他的作图技术予以校正和补充 17 常用的物理作图技术 常用的物理作图技术 限制性作图 restriction mapping 将限制性酶切位点标定在 DNA 分子的相对位置 依靠克隆的基因组作图 clone based mapping 根据欲克隆的 DNA 片段之间的重叠顺 序构建重叠群 contig 绘制物理连锁图 荧光标记原位杂交 fluorescent in situ hybridization FISH 将荧光标记的探针与染色体杂 交确定分子标记的所在位置 顺序标签位点 sequence tagged site STS 通过 PCR 或分子杂交将小段 DNA 顺序定位 在基因组的 DNA 区段中 18 脉冲场凝胶电泳脉冲场凝胶电泳 PFGE pulsed field gel electrophoresis 是一种分离大分子 DNA 的方法 在普通凝胶电泳 中 大的 DNA 分子 10kb 移动速度接近 在凝胶中难以形成足以区分的条带 在 PFGE 中 电场不断在两种方向上 有一定夹角 而不是相反的两个方向 变动 DNA 分 子带有负电荷 会朝正极移动 相对较小的分子在电场转换后可较快转变移动方向 而较 大的分子转向较为困难 因此小分子向前移动的速度比大分子快 PFGE 可用来分离从 10kb 10Mb 的 DNA 分子 19 常用的指纹分析方法 常用的指纹分析方法 A 限制性带型 restriction patterns 指纹 B 重复顺序 DNA 指纹 repetitive DNA fingerprints C STS 目录作图 STS content mapping D 重复 DNA PCR repetitive DNA PCR 或分散重复顺序 PCR interspersed repeat element PCR IRE PCR 指纹 20 STS 作图原理作图原理 1 序列标签位点或 STS sequence tagged site STS 是基因组中任何单拷贝长度在 100 500bp 之间的 DNA 序列 与限制性核酸内切酶的识别序列相关联 每个基因组 中仅 1 份拷贝 很易分辨 2 将染色体 DNA 随机打断 2 个标记所处的物理位置越近 位于同一片段的机率越高 3 随机打断的染色体 DNA 长度不一 彼此靠近的 2 个标记有很大的机率位于同一片段 相距较远的标记分开的机率很高 21 作为合格的 作为合格的 STS 必须要满足必须要满足 2 个条件 个条件 它应是一段序列已知的片段 可据此设计 PCR 反应来检测不同的 DNA 片段中是否存 在这一顺序 STS 必须在染色体上有独一无二的位置 如果某个 STS 在基因组中多个位点出现 则由 此得出的作图数据将是含混不清的 22 寻找寻找 STS 的常用方法 的常用方法 表达顺序标签 expression sequence tag EST 这是一些从 cDNA 克隆中找到的小段序列 EST 转变成 STS 的条件是 这个 EST 来自单拷贝基因而非基因家族成员 后者常常含有相 同或相似的序列 简单序列长度多态性 simple sequence length polymorphism SSLP SSLP 产生于重复顺 序的可变排列 同一位点重复顺序的重复次数不同 表现出 DNA 序列的长度变化 与 RFLP 不同的是 SSLP 具有多等位性 multiallelic 每个 SSLP 都有多个长度不一的变异体 具有多态性并已在连锁分析中定位的 SSLP 具有特别的价值 因其可直接建立遗传图与物 理图之间的联系 随机基因组顺序 从克隆的 DNA 中随机测序可获得有用的序列 也可从数据库中寻找 感兴趣的某些序列 23 SAGE 特点 特点 1 进行转录物组研究 也就是转录水平的研究 2 通过快速和详细分析成千上万个 EST 来寻找出表达丰度不同的 SAGE 标签序列 从而 接近完整地获得基因组的表达信息 3 SAGE 区别于差异显示 消减杂交等其它技术的主要特点是可用于寻找那些较低丰度 的转录物 最大限度地收集基因组的基因表达信息 这使之成为从总体上全面研究基 因表达 构建基因表达图谱的首选策略 4 SAGE 可用于在不同环境 不同生理状态及不同生长阶段的细胞和组织表达图谱构建 对不同状态下基因表达水平的定量或定性比较 特别是对疾病组织与正常组织的比较 发展迅速 理论依据 理论依据 1 来自转录物内特定位置的一小段寡核苷酸序列 9 11 bp 含有鉴定一个转录物特异性 的足够信息 可作为区别转录物的标签 tag 2 通过简单的方法将这些标签串联在一起 形成大量多联体 concatemer 对每个克隆 到载体的多联体进行测序 并应用 SAGE 软件分析 可确定表达的基因种类 并可 根据标签出现的频率确定基因的表达风度 abundance 步骤 步骤 a 将 5 g 含有 oligo dT 引物 的磁珠与 RNA 混合 b 合成双链 cDNA c 用 Nla 酶消化形成一条链末端有标签的产物 d 将样品分成两份 连接成含有识别序列的产物 以备用 BsmF1 消化 e 用 Mme I 切割每一个样品形成约 60bp 的标签 f 延伸 5 秒 连接成约 130bp 的双链标签 g PCR 扩增 h 用 Nla 酶切 130bp 产物释放 34bp 双链标签 i 连接片断形成串联体 j 克隆到 pZErO 1 里 并测序 24 基因芯片的主要应用 基因芯片的主要应用 1 基因表达检测 拟南芥 酵母基因表达研究等 2 突变检测 BRCA 基因外显子 CFTR 基因 地中海贫血 酵母突变菌株 HIV 1 逆转录酶及蛋白酶基因等的突变检测等 3 基因组多态性分析 人类基因组单核苷酸多态性的鉴定及分析及人线粒体 16 6kb 基 因组多态性的研究等 4 基因文库作图 通过确定重叠克隆的次序从而对酵母基因组进行作图 25 生物大分子的制备的主要特点 生物大分子的制备的主要特点 生物材料的组成极其复杂 常含有数百种乃至上千种化合物 许多生物大分子在生物材料中的含量极微 分离纯化步骤繁多 流程长 许多生物大分子一旦离开了生物的体内环境就极易失活 因此在分离过程中如何防止其 失活 就是生物大分子制备的最困难之处 生物大分子中的各种具体物质的组成比例不同 制备几乎都是在溶液中进行的 温度 pH 值 离子强度等各种参数对溶液中各种组成 的综合影响 很难准确估计和判断 26 生物大分子的制备步骤 生物大分子的制备步骤 明确生物大分子制备的目的和要求 建立相应可靠的分析测定方法 通过文献调研和预备性实验 生物大分子制备方案的选择和探索 生物材料的破碎和预处理 目的产物的提取及进一步的分离纯化 生物大分子制备物的均一性 即纯度 鉴定 目的产物的浓缩 干燥 和 保存 27 生物大分子的分离纯化方法可粗略地分类如下 生物大分子的分离纯化方法可粗略地分类如下 以分子大小和形态差异为依据的方法 差速离心 区带离心 超滤 透析和凝胶过滤等 以溶解度差异为依据的方法 盐析 萃取 分配层析 选择性沉淀和结晶等 以电荷差异为依据的方法 电泳 电渗析 等电点沉淀 吸附层析和离子交换层析等 以生物学功能专一性为依据的方法 亲和层析等 28 生物大分子样品的早期分离纯化 生物大分子样品的早期分离纯化 1 特点 特点 粗提取液中物质成份十分复杂 欲制备的生物大分子浓度很稀 物理化学性质相 近的物质很多 希望能除去大部分与目的产物的理化性质差异较大的杂质 2 对所选方法的要求 对所选方法的要求 要快速 粗放 能较大地缩小体积 分辨力不必太高 负荷能力要大 3 可选用的方法 可选用的方法 吸附 萃取 沉淀法 热变性 盐析 有机溶剂沉淀等 离子交换 批量吸附 胖柱交换 亲和层析 29 生物大分子样品的晚期分离纯化 生物大分子样品的晚期分离纯化 1 可选用的方法 可选用的方法 吸附层析 盐析 凝胶过滤 离子交换层析 亲和层析 等电聚焦制 备电泳 制备 HPLC 等 2 要注意的一些问题 要注意的一些问题 盐析后要及时脱盐 用凝胶过滤时如何缩小上样体积 因为凝胶层析柱的上样体积只能是柱床体积的 1 10 1 6 也可使用串联柱以加大柱床体积 必要时也可重复使用同一种分离纯化方法 如分级有机溶剂沉淀 分级盐析 连续两次 凝胶过滤 离子交换层析等 分离纯化步骤前后要有科学的安排和衔接 尽可能减少工序 提高效率 如吸附不可放 在盐析之后 以免大量盐离子影响吸附效率 离子交换要放在凝胶过滤之前 因为离子交 换层析的上样量可以不受限制 只要不超过柱交换容量即可 分离纯化后期 目的产物的纯度和浓度都大大提高 此时对于很多敏感的酶极易变性失 活 因此操作步骤要连续 紧凑 尽可能在低温下 如在冷室中 进行 得到最终产品后 必要时要立即冰冻干燥 分装并写明标签 20 或 70 保存 30 蛋白质样品制备原则与纯化方法 蛋白质样品制备原则与纯化方法 原则 1 在适宜盐浓度下 可重复溶解所有蛋白质 包括疏水性蛋白质 并使样品中的 分子以分离的形式存在 2 避免溶解性低的蛋白质 如胰蛋白 在等电聚焦时由于溶解度降低而沉淀析出 3 防止蛋白质的化学修饰 包括蛋白质降解 蛋白酶或尿素热分解后所引起的修饰 4 排除核酸 多糖 脂类和其他干扰分子 5 获得的目标蛋白质应在可探测水平 有时需要去除高丰度蛋白质和不相关蛋白质 纯化方法 纯化方法 1 沉淀法 有机溶剂沉淀法 选择性沉淀法 等电点沉淀法 共沉淀法 2 根据形态差异建立的方法 透析 超滤 离心分析 3 依据电荷特性设计的分离方法 吸附交换分离法 聚焦层析 电泳法 4 根据稳定性建立的分离纯化方法 热变性法 酸碱变性法 表面变性法 5 根据亲和作用建立的纯化方法 亲和电泳 免疫吸附层析 疏水作用层析 共价层析 金属螯合层析 6 高效液相色谱分离分析法 体积排阻色谱 离子交换色谱法 反相色谱法 高效疏水 作用色谱 31 双向凝胶电泳的基本原理 双向凝胶电泳的基本原理 双向电泳的第一向是等电聚焦电泳 根据蛋白质的 PI 不同进行分离 第二向为变性聚丙烯 酰胺凝胶电泳 根据分子量不同进行分离 样品经过电荷和质量两次分离后 得到等电点 和分子量的信息 32 双向电泳的分类 双向电泳的分类 非变性 2D PAGE 非变性 SDS 2D PAGE 非变性 还原 SDS 2D PAGE 变性 2D PAGE 33 双向电泳分析中的样品制备 双向电泳分析中的样品制备 1 应使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态 包括多数疏水性蛋白 且制备方法应 具有可重现性 2 防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀 3 防止在样品制备过程中发生样品的抽提后化学修饰 如酶性或化学性降解等 4 完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白 5 尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白 从而保证待研究蛋白的可检测性 3434 双向凝胶电泳的基本流程 双向凝胶电泳的基本流程 1 等电聚焦 标记胶条 样品上样及水化 置于聚焦盘内 设定 IEF 电泳程序 加矿 物油覆盖胶面 2 胶条平衡 先在含有 SDS 还原剂 DTT 但不含碘乙酰胺的平衡液中平衡 再在含碘 乙酰胺的平衡液中平衡 3 SDS PAGE 制胶 样品制备 加缓冲液 连接电源 电泳 4 染色 染色液及脱色液的配制 染色 脱色 3535 双向电泳中第一向到第二向进行平衡过程的机理 双向电泳中第一向到第二向进行平衡过程的机理 平衡 buffer 1 还原 将 S S 键转化为 SH DTT 平衡 buffer 2 烷基化物 使每个 SH 均烷基化以防止 S S 键的重新形成 碘乙酰胺 36 有机染料和银染有机染料和银染 1 考染灵敏度为 30 100ng 线性范围是 20 倍 银染的线性范围是 40 倍 灵敏度是考染 的 100 倍 2 胶体考马斯亮蓝染色技术可实现 PAGE 的无背景染色 其极限灵敏度为 8 10ng 但这 种染液会对蛋白质进行修饰而影响质谱分析的结果 3 胺基黑常用于转印至聚偏二氟乙烯 PVDF 和 或硝酸纤维素膜上的蛋白质的染色 4 银染的缺点是 对某些种类的蛋白质染色效果差 对其后的蛋白质测序和质谱分析造 成影响 5 这两种染色技术都可减少胶内蛋白质产量 37 预防酶自解和微生物的污染 预防酶自解和微生物的污染 使用较好的测序级 TPCK Trysin 在加酶使胶块吸胀后 一定要去掉多余的酶液 不要认为这样会影响酶解效率 酶解时间不宜过长 24hr 电泳玻板 染胶的器皿等用前要清洗 所用试剂和溶液的纯度要高 以保证质谱分析的可靠性 尽量用干净的乳胶手套和洁净的 EP 管及 Milliq 水 尽量减少不必要的操作步骤 简化操作程序 要有一个洁净的操作环境 38 胶内酶解注意事项 胶内酶解注意事项 若样品种类较多 应将离心管编号 样品对号入管 考染方案各注释均适用银染方案 整个操作过程应注意角蛋白等的污染 佩戴一次性乳胶手套 使用洁净的离心管及 Millipore 水 不同公司的酶需要不同的最适的 pH 因此 需调 pH 值 39 样品的纯化与浓缩 样品的纯化与浓缩 操作步骤 配制适当的溶液 对不同质量范围的蛋白质或肽段的提取效率应事先估计 注意事项 整个操作过程润湿体积 0 6 l 因填料为 0 6 l pH 4 整个过程不能引入气泡 注意流速 最好速度均匀 40 蛋白质定量分析策略 蛋白质定量分析策略 41 定量蛋白质组学 定量蛋白质组学 内容 内容 是把一个基因组表达的全部蛋白质或一个复杂的混合体系中所有的蛋白质进行精确 的定量和鉴定的一门学科 通常情况是只需对两种不同状态细胞的蛋白质进行比较 只需相对含量的变化进行准 确的定量即可 意义 意义 研究方法 研究方法 1 体内标记 体内标记 15N 体内代谢标记 体内代谢标记 用富含 15N 的介质来培养细胞 15N 被渗入合成的蛋白质中 从而 充当其定量的内部标准 每结合一个 15N 该肽比正常 14N 的相同肽大一个质量单位 使得不同细胞状态来源的肽段得以区分 肽质谱峰信号成对出现 从而根据质谱峰的 信号强度来进行准确的定量 缺点 由于相同肽段的不同同位素标记形式之间的质量变化依赖于氮原子数目 因 此对未知蛋白难以进行定量 稳定同位素标记的必需氨基酸标记 稳定同位素标记的必需氨基酸标记 在培养介质中加入稳定同位素标记的必需氨基酸 如 Lys Leu Phe 等 这主要用于高等动物细胞中蛋白质的定量以及鉴定 优点 省去了标记化学反应和分离纯化等步骤 因而减少了样品的损失 有利于低丰 度蛋白质的高灵敏度检测 缺点 1 不能对组织来源的蛋白质进行分析 2 同位素介质可能会影响蛋白质的表达水 平 3 受成本限制 不能对整个动物体进行标记 4 无法确定标记物与肽段之间量的关系 2 同位素亲和标签技术同位素亲和标签技术 ICAT ICAT 试剂包括三部分 1 反应基团 可特异地与蛋白质侧链上的半胱氨酸 Cys 残基的 SH 进行反应 使试剂共价结合在蛋白质侧链上 2 同位素标记的接头 含有稳定同位素 H 和 D 的标记 3 亲和标记的生物素 用于分离标记的蛋白质或多肽 ICAT 试剂中 8 个 X 位置被 H 取代时 称为轻试剂 D0 8 个 X 位置被 D 取代时 称 为重试剂 D8 轻试剂和重试剂的相对分子量差 8Da 或 4Da 肽段带两个电荷 在质谱图上这对标记蛋白质的肽段离子峰 m z 相差 8 或 4 从而能将来自不同样品的同 一蛋白质分离开 ICAT 策略的优点策略的优点 a 若一种蛋白质酶切产生至少一个 Cys 残基的肽段的话 就可以对其进行鉴别和定 量 含有 Cys 残基的肽段越多 结果对照得出的结论就越准确 b 鉴定的肽段中肯定都会有至少一个 Cys 因此在进行数据库搜索时就增加了一个 有效的约束条件 c 肽段根据标记情况有选择性地得到了富集 从而减少了下游质谱分析的复杂程度 d 分离出来的标记多肽可直接与后面的 RP LC MS 分析系统在线偶联操作 e 可直接对混合样品进行分析 f 可对低丰度蛋白质直接捕获和快速定性 定量鉴定 尤其是对膜蛋白等疏水性蛋 白质 g 可快速找出功能性蛋白质 h 无需繁冗的双向凝胶电泳分析分离 i ICAT 软件及质谱技术平台系统可用于全自动快速鉴定蛋白质 ICAT 策略的缺陷 策略的缺陷 a 不能获得不含 Cys 的肽段 同时翻译后修饰的检出率较低 而酵母细胞中约有 10 左 右的蛋白质肽链上没有 Cys 残基 因而得不到鉴定 b ICAT 试剂的分子质量为 500Da 左右 相对肽段而言较大 增加了数据库检索算 法的复杂性 对于较小片段的修饰可能会影响数据库搜索 c 耗时太长 数据存储消耗在表达量没有改变的蛋白质上 而这些蛋白质可能与研 究的问题没有太大的关联 d 相对于双向凝胶电泳技术 该方法有高分子量偏性 ICAT 策略的改进措施 策略的改进措施 a 采用了固相氨基酸同位素标记试剂来代替 ICAT 试剂 b 采用多维 LC MS MS 分析系统 把鉴定和定量分开 c 双向凝胶电泳技术与 ICAT 技术互补结合测定蛋白质在两样品中的相对含量 d 磷酸化蛋白质同位素标记亲和标签 Phosphoprotein isotope coded Affinity Tags PhIAT 技术 42 同位素亲和标签 同位素亲和标签 ICAT 标记方法的步骤 标记方法的步骤 a 将来自一种状态下的细胞的蛋白质混合物分离纯化后用 D0 试剂标记蛋白质侧链 上的 Cys 残基 将来自另一状态下的同种细胞的蛋白质混合物分离纯化后用 D8 试剂标记 b 将两种样品混合在一起 用 trypsin 酶切 产生多肽片段 包括标记的和未标记的 c 样品经 SCX RPLC 两维色谱分离 除去消化酶 去垢剂 还原剂和 ICAT 试剂 d 混合物经过抗生物素和色谱柱分离 得到只含有同位素标记的多肽混合物 e 将分离得到的标记多肽混合物再用 RP lC MS 分离和鉴定 43 不同染色方法的比较 不同染色方法的比较 1 考马斯亮蓝 优点 选择性地对蛋白质进行染色 大大地降低了化学噪音 提高了灵 敏度 2 银染 优点 大大提高了灵敏度 扩展了动态线性范围兼容质谱 去除戊二醛后 快 速 方便 3 缺点 银离子可与半胱氨酸残基结合 银染试剂戊二醛和甲醛都会对蛋白质的 和 氨基烷基化 妨碍后续分析 4 荧光染色 优 与质谱兼容性好 在 2 2000ng 间效果与量成线性正比 5 缺 范围窄 试剂贵 需要较高的设备 44 亚细胞蛋白质组的研究意义和策略 亚细胞蛋白质组的研究意义和策略 意义 意义 富集低丰度蛋白 对特定成份的蛋白质的研究 提供亚细胞定位信息 提供结构与 功能的信息 对细胞分子的生理分子预测 差异表达谱 策略 策略 亚细胞组分的分离 亚细胞蛋白质组学技术 蛋白质亚细胞定位技术 蛋白质亚细 胞定位预测技术 定位实验技术 定位实验技术 分离 TAP 串联亲和纯化 免疫电阱或免疫荧光 确认 转基因 GFP 基因缺失突变 45 蛋白质相互作用和研究策略 蛋白质相互作用和研究策略 作用 多亚基蛋白质的形成 多成分蛋白质的相互作用 瞬时的蛋白质相互作用 控制着一些重要的生命活动 研究方法 生化方法 亲和层析 亲和印迹 免疫共沉淀 化学交联 荧光共振能量转移 生物传感 器 分子生物学方法 酵母双杂交系统 噬菌体展示技术 串联亲和纯化技术 TAP 遗传学方法 基因外抑制子 合成致死 46 荧光共振能量转移原理 荧光共振能量转移原理 是指在两个不同的荧光基团中 如果一个荧光基团 供体 Donor 的发射光谱与另一个基 团 受体 Acceptor 的吸收光谱有一定的重叠 当这两个荧光基团间的距离合适时 一般 小于 100 就可观察到荧光能量由供体向受体转移的现象 即以前一种基团的激发波长 激发时 可观察到后一个基团发射的荧光 47 噬菌体展示技术 噬菌体展示技术 是一种基因表达产物和亲和选择相结合的技术 他以改构的噬菌体为载体 把待选基因片 段定向插入噬菌体外壳蛋白质基因区 使外源多肽或蛋白质表达并展示于噬菌体表面 进 而通过亲和富集法表达有特异肽或蛋白质的噬菌体 48 生物传感器 生物传感器 biosensor 由固定化的生物敏感材料作识别元件与适当的理化换能器及信号放大装置构成的分析工具 或系统 特点特点 1 采用固定化生物活性物质作催化剂 价值昂贵的试剂可多次重复使用 克服了过去酶 法分析试剂费用高和化学分析繁琐复杂的缺点 2 专一性强 只对特定的底物起反应 而且不受颜色 浊度的影响 3 分析速度快 可以在一分钟得到结果 4 准确度高 一般相对误差可以达到 1 5 操作系统比较简单 容易实现自动分析 6 成本低 在连续使用时 每例测定仅需要几分钱人民币 7 有的生物传感器能可靠地指示微生物培养系统内的供氧状况和副产物的产生 能得到 许多复杂的物理化学传感器综合作用才能获得的信息 同时还可指明增加产物得率的方向 49 质谱原理特点及质谱系统 质谱原理特点及质谱系统 MS 原理 原理 待测化合物分子吸收能量 在离子源的电离室中 后产生电离 生成分子离子 分 子离子由于具有较高的能量 会进一步按化合物自身特有的碎裂规律分裂 生成一系列确 定组成的碎片离子 将所有不同质量的离子和各离子的多少按质荷比记录下来 就得到一 张质谱图 由于在相同实验条件下每种化合物都有其确定的质谱图 因此将所得谱图与已 知谱图对照 就可确定待测化合物 特点 特点 信息量大 应用范围广 是研究分子结构的有力工具 由于分子离子峰可以提供样品分子的相对分子量的信息 所以质谱法也是测定分子量 的常用方法 分析速度快 灵敏度高 高分辨率的质谱仪可以提供分子或离子的精密测定 质谱仪器较为精密 价格昂贵 工作环境要求较高 系统 系统 质谱仪结构由 7 部分组成 进样系统 离子源室 质量分析器 检测器 数据处理 系统 真空系统和供电系统 其中离子源室 质量分析器 检测器必须处于高真空状态 离子源要求 10 4 10 5Pa 质量分析器要求 10 6Pa 以降低背景以及减少离子间或离子与分 子的碰撞 进样系统 把样品从室内常压转移到离子源 离子源室 把样品分子转换成样品离子 在质量分析器里 电场或者磁场 或者两者都有的分析器 被用来控制样品离子的运动 这样便可根据其质量不同而将其分离 检测器 可以感知已经被分离的离子的到达 放大极其微小的离子的电流以便进一步的电子 处理 记录仪接受检测器的信号 将其放大并记录 这样就得到了质谱图 质谱要在真空系统运行减少空气中成分的干扰 离子源 质量分析器和检测器在真空系统 里 50 四级杆质谱与飞行时间质谱 四级杆质谱与飞行时间质谱 四级杆质谱 四级杆质谱 物质气化后以分子状态进入质谱仪后 经过灯丝发射的电子轰击后 成各种 不同的碎片 有的是只掉了一个 H 有的是掉了一个基团 有的成为更小的碎片 各种各 样的 然后这些碎片进入四极杆后 四极杆通过不同的电的方向变换 这些碎片在通过四 极杆时 由于碎片的质量和所带的电核不同 质荷比 所以 也随着四极杆电的方向变换 而改变前进方向 带电碎片到达终点 接收端 的时间不同 质荷比太小或太大的带电碎 片它们的方向变换也会过快或过慢 这个可以设置 会撞到四极杆而不能被检测 中间的 碎片会按质荷比由小到大的顺序先后到达接受端 而被检测到 飞行时间质谱 飞行时间质谱 TOF MS 分析方法的原理非常简单 这种质谱仪的质量分析器是一个离子 漂移管 样品在离子源中离子化后即被电场加速 由离子源产生的离子加速后进入无场 漂移管 并以恒定速度飞向离子接收器 假设离子在电场方向上初始位移和初速度都为 零 所带电荷数为 q 质量数为 m 加速电场的电势差为 V 则加速后其动能应为 m v2 2 qe V 其中 v 为离子在电场方向上的速度 离子以此速度穿过负极板上的栅条 飞向检测器 离子从负极板到达检测器的飞行时间 t 就是 TOFMS 进行质量分析的判据 51 生物质谱的基本原理 生物质谱的基本原理 分析样品在特定的条件下转变为高速运动的离子 这些离子根据质量 电荷比的不同在静电 场和磁场的作用下得到分离 用特定的检测器可以记录不同质荷比的各种离子的相对强度 并形成质谱图 主要部分组成 主要部分组成 基本部分 1 离子源 2 质量分析器 3 检测器 检测由质量分析器分离的离子 其他部分 1 复杂计算机 2 真空泵系统 主要类型 主要类型 52 生物质谱的电离方式 生物质谱的电离方式 硬电离方法 能给样品较大能量 生成较多碎片离子的电离方法 电子轰击离子化 EI 软电离方法 给样品较小能量 碎片离子较少或不生成碎片离子的电离方法 电喷雾电离 ESI 基质辅助激光解吸电离 MALDI 53 ESI 和和 MALDI 的比较的比较 离子化方式 可在线联用的方式 离子电荷形式 对杂质容忍程度 ESI 液相 多电荷 直接进样时差 MALDI 固相 一般为 1 或 2 个电荷 较好 5454 比较 比较 MALDIMALDI 和和 ESIESI 的异同点 的异同点 MALDI 离子源工作原理 1 以脉冲方式使样品离子化 从固相标本中产生的离子 并在飞行管中测定分子量 2 将分析物分散在基质分子 尼古丁酸及其同系物 中并形成晶体 用激光照射晶体 由 于基质分子经辐射所吸收的能量导致能量蓄积并迅速产热 从而使基质晶体升华 导致基 质和分析物膨胀并进入气相 3 样品被包裹在基质中 大部分激光能量被基质的发色基团首先吸收 从而保护了样品分 子的完整性 MALDI 优点 能够耐受高盐 具有较高的质测上限 能分析混合物 敏感度为 fmol 可发展为蛋 白及核酸测序手段 缺点 质量分辨率 500 质量测定精确度为 0 1 0 01 不能与液相色谱联用 ESI 离子源工作原理 原理 样品通过液流流动 通常从 HPLC 进入离子源 穿过有持续高压的不锈钢锥体或进 样针 随着液流利开进样针样品分散为细雾状微滴 微滴含有肽离子以及 HPLC 流动相组分 水 乙腈 醋酸等 离子源进一步从溶液组分中分离肽离子 将离子转移到质量分析器 ESI 优点 能与 HPLC CZE 联用 能形成多价离子 可更为准确地测定分子量 质量分辨率为 2000 以上 可以直接从水相观察非共价复合物 敏感度为 fmol pmol 质量测定精确度 为 0 01 缺点 在分析混合物时 多价离子形成会使结果分析比较困难 仅在低盐 1mmol L 条 件下给出理想信号 样品组成过于复杂时可能不产生信号信号 55 什么是串联质谱 碰撞诱导解离 什么是串联质谱 碰撞诱导解离 串联质谱 两个或更多的质谱连接在一起称为串联质谱 最简单的是由两个质谱串联而成 其中第一个质量分析器将离子预分离或加能量修饰 由第二级质量分析器分析结果 常见 的有串联四级杆质谱 四级杆离子阱质谱等 作用 作用 1 诱导第一级质谱产生的分子离子裂解 有利于研究子离子和母离子的关系 进而 给出该分子离子的结构信息 2 从干扰严重的质谱中抽取有用数据 大大提高质谱检测的选择性 从而能够测定混合物 中的痕量物质 碰撞诱导解离 碰撞诱导解离 CID 碰撞活化解离在碰撞室内进行 带有一定能量的离子进入碰撞室后 与室内情性气体的分子或原子发生碰撞 离子发生碎裂 为了使离子碰撞碎裂 必须使离 子具有一定动能 对于磁式质谱仪 离子加速电压可以超过 1000V 而对于四极杆 离子 阱等 加速电压不超过 100V 二者得到的子离子谱是有差别的 56 肽质量指纹图谱是如何鉴定蛋白质的 肽质量指纹图谱是如何鉴定蛋白质的 PMF 原理 将由质谱获得的肽段实验质量数据与数据库中已知蛋白的肽段理论数