分子生物学课后习题改 6.19

1 基于晶体结构 简图显示基于晶体结构 简图显示 RNA 聚合酶核心酶的大致结构 指出亚基 催化活聚合酶核心酶的大致结构 指出亚基 催化活 性中心和利福平结合位点的位置 根据结构 提出利福平抑制转录的可能机制 性中心和利福平结合位点的位置 根据结构 提出利福平抑制转录的可能机制 答 X 射线晶体图像显示 RNA 聚合酶核心酶性状类似一个蟹螯 转录的过程中 DNA 被夹在中间的孔道中 核心酶组成为两个 亚基 一个 亚基 一个 亚基 亚基具有 DNA 结合和合成 RNA 磷酸二酯键的作用 为催化 RNA 合成的活性中心的一部分 同时也是利福平结合的位置 利福平与 RNA 聚合酶的 亚基牢固结合 抑制细菌 RNA 的合成 从而阻断 RNA 转录过程 图略 2 全酶的晶体结构中没有包括全酶的晶体结构中没有包括 sigma1 1 区 推断区 推断 sigma1 1 区在全酶的位置 并区在全酶的位置 并 说明支持的理由 说明支持的理由 答 sigma1 1 区可能位于全酶 蟹螯 的孔道的位置 sigma1 1 区使孔道撑开 保持了孔道的开放 使得 DNA 链有机会进入 在 DNA 进入孔道后 sigma1 1 便 被全酶所遗弃 孔道因此闭合 所以在全酶晶体结构中没有观察到 sigma1 1 区 Sigma 亚基缺失前 91 个氨基酸 region1 1 后 全酶结构中有一个狭窄的裂隙 以至于不能接纳 DNA 模板 表明缺失结构域有可能帮助撬开酶的裂隙 以与 DNA 结合 从而推断出 sigma1 1 区的存在 3 如何理解如何理解 sigma 因子转换控制转录过程 因子转换控制转录过程 答 sigma 因子包含于 RNA 聚合酶全酶中 其与 RNA 聚合酶核心酶统称为 RNA 聚合酶全酶 它的存在决定着 RNA 聚合酶所转录的基因的特异性 不同 的 sigma 因子识别特定的基因的启动子 从而使得不同的基因得到表达 例如 在噬菌体 SPO1 侵染枯草芽孢杆菌的过程中 再侵染的前 5 分钟内 SPO1 的 RNA 聚合酶与宿主的 sigma 因子结合 表达早起基因 其中包括 gp28 一种中 期表达的 sigma 因子 在 5 10 分钟的时候 RNA 聚合酶与 gp28 结合 进行中 期表达 表达出 gp33 gp34 这两种蛋白则是 SPO1 晚期表达所需的 sigma 因子 的两个亚基 在 10 分钟以后的阶段 RNA 聚合酶结合以上的 sigma 因子 从 而进行晚期表达 这种 sigma 因子的转换控制转录的过程也在细菌孢子形成 细菌应对热激和饥饿时 表达不同基因以应对环境压力方面起到很重要的作用 4 4 解释解释 N N 和和 NusANusA 在转录终止和抗终止中的作用 在转录终止和抗终止中的作用 答 在延伸复合物 EC 通过 TL和 TR1区合成 U 串时 第 7 个 U 后暂停 持续 2s 如发夹形成则终止 当没有 N 和 NusA 存在时 准发夹上游部分与核心聚合酶上 游结合位点 UBS 结合 蛋白质 RNA 键断裂 发夹迅速形成 转录终止 当只有 NusA 存在时 NusA 帮助打开 UBS 和准发夹上游部分的结合 加速发夹在暂停结 束前形成 促使终止发生 当只有 N 存在时 N 蛋白与准发夹上游部分结合 减缓发夹形成 使终止不易发生 当 N 和 NusA 同时存在时 N 蛋白不仅与准发 夹的上游结合 也使 NusA 容易与邻近位置结合 使发夹形成更慢 终止更不易 发生 5 利用模型解释利用模型解释 lambda 噬菌体感染的大肠杆菌中噬菌体感染的大肠杆菌中 cI 和和 cro 的竞争是如何导致的竞争是如何导致 溶源态或裂解态的建立 溶源态或裂解态的建立 答 cI 的大量表达可以阻止早期基因的表达 从而使 lambda 噬菌体保持溶源态 而 cro 和 N 的大量表达则使之进入裂解态 Cro 和 N 的基因的操纵子 OR和 OL 可细化分为 3 个部分 cI 可以二聚体的形式 以 OR1 OR2 OR3的顺序依次结合 于 OR和 OL 导致 Cro 和 N 基因转录的抑制 并激活 PRm 进一步增加 cI 的表达 抑制早期基因的表达 使得 lambda 噬菌体维持溶源态 而 Cro 则可以二聚体的 形式 以 OR3 OR2 OR1的顺序依次结合于 OR 抑制 cI 以及其自身的表达 这 样 Cro 便使阻止溶原化的 维持 循环不能实现 从而使 lambda 噬菌体进入溶 菌周期 6 100 引起裂解态的引起裂解态的 lambda 噬菌体中 什么可能发生了突变 噬菌体中 什么可能发生了突变 100 引起溶源引起溶源 态的态的 lambda 噬菌体 如果噬菌体 如果 N 基因突变失活 期望得到什么样的细菌 基因突变失活 期望得到什么样的细菌 答 100 引起裂解态的 lambda 噬菌体中 cI cII cIII 基因其中之一或全部可能 发生了突变或缺失 因为 cI 是使 lambda 噬菌体保持溶源态的主要基因 而 cI 的表达需要 cII 的诱导 而 cII 在没有 cIII 结合的情况下很快就会被 HflA 蛋白 所降解 因此 这三种基因对于 lambda 噬菌体维持溶源态都至关重要 而 100 引 起溶源态的 lambda 噬菌体可能是 Cro 基因发生了突变或缺失 因为 Cro 蛋白与 cI 蛋白竞争结合于 OR是引发 lambda 噬菌体进入溶菌态的主要原因 N 基因的 作用是转录抗终止 如果 N 基因突变失活 使得 RNA 聚合酶无法越过 TL和 TR1 而继续表达延迟早期基因 导致 lambda 噬菌体负责整合自身 DNA 于宿主基因组 上的整合酶以及裂解宿主菌的裂解酶等都无法表达 致使宿主菌既不进入溶源 周期也不进入溶菌周期 然而其仍然可以利用宿主菌的 RNA 聚合酶和营养持续 表达 蛋白和 Cro 蛋白 而这两种蛋白对宿主菌是无用的 因此 其对宿主菌 的影响除了施加一定的生长压力外无太大影响 7 在蛋白质在蛋白质 DNA 相互作用中 相互作用中 氢键网络氢键网络有何作用 有何作用 答 氢键网络的作用主要还是加强蛋白质与 DNA 的结合能力 使蛋白以正确的 空间位置嵌入 DNA 双链的大沟或小沟中 从而充当转录调控原件 调控 DNA 的转录 8 谷氨酰胺和精氨酸侧链与谷氨酰胺和精氨酸侧链与 DNA 之间倾向于何种作用 之间倾向于何种作用 答 这二者之间倾向于氢键作用 9 氨基酸的亚甲基和甲基基团与氨基酸的亚甲基和甲基基团与 DNA 之间倾向于产生何种作用 之间倾向于产生何种作用 答 氨基酸的亚甲基和甲基基团与 DNA 之间倾向于疏水相互作用 如甲硫氨 酸的侧链甲基如 DNA 的疏水部位之间的相互作用 10 色氨酸加入色氨酸加入 trp 阻遏蛋白后引起蛋白质构象的怎样变化 阻遏蛋白后引起蛋白质构象的怎样变化 答 色氨酸加入后 识别螺旋 E 的位置发生移动 由下向上 进入操纵基因大 沟 与该位置上的 DNA 完美结合 Sigler 称之为阅读头 reading head 类似 录音机加载或退盘的情况 色氨酸与阻遏物离开 留下的空隙允许阅读头离开 大沟匹配位置 Trp 阻遏物中色氨酸的邻近分子 上方 Arg84 下方 Arg54 形成 三明治结构 Arg54 位于阻遏蛋白二聚体中心 Arg84 位于阅读头的结合面上 因此插入色氨酸使阅读头推向大沟 无色氨酸时 两个精氨酸连在一起 填补 空位 11 E coli sigma54 如何发挥增强子作用 如何发挥增强子作用 答 大肠杆菌 sigma54 sigmaN 氮源缺乏时 可以从另一个启动子转录 glnA 基因 Sigma54 可引起全酶稳定结合到 glnA 启动子 但本身不能形成开放 复合物 而是由另一个蛋白 NtrC 结合到增强子上帮助形成开放复合体 即使增强子与启动子不在同一个 DNA 环上 如能形成连体环 也能发挥作用 12 描述表位附加法 描述表位附加法 Epitope Tagging 从酵母中纯化 从酵母中纯化 RNA 聚合酶聚合酶 II 的原理和的原理和 过程 过程 答 原理 通过基因工程方法 将一外源功能域重组到酵母 RNA 聚合酶 II 的 Rpb3 亚基上 其它正常亚基仍能够与改变了的 Rpb3 亚基组装成有活性的聚合 酶 从而通过免疫共沉淀反应可以将与 Rpb3 结合的 RNA 聚合酶 II 其他组分一 同分离出来 过程 在含有放射性标记氨基酸的培养基中培养酵母细胞 使该聚合酶被标记 将添加识别表位的酵母 RNA 聚合酶 II 与其抗体进行免疫共沉淀反应 使 RNA 聚合酶与其它杂质蛋白分离 一步获得高纯度的酶 加入强去污剂 SDS 使聚合 酶中各个亚基分离变性 凝胶电泳检测变性的聚合酶亚基 获得电泳图 13 在在 RNA 聚合酶聚合酶 II 的催化活性中心有多少个的催化活性中心有多少个 Mg 离子参与催化反应 为什么离子参与催化反应 为什么 在酵母在酵母 RNA 聚合酶聚合酶 II 的晶体中只检测到一个的晶体中只检测到一个 Mg 离子的存在 离子的存在 答 RNA 聚合酶 II 的催化活性中心结合两个 Mg 离子 一个信号较弱 信号强 的 Mg 离子与活性中心结合紧密 弱的离子结合松散 可能参与结合核苷酸底 物 因此酶晶体中检测不到 14 RNA 聚合酶的盖 舵及叉环 聚合酶的盖 舵及叉环 fork loop 的功能 的功能 答 Rpb1 的盖结构与 DNA RNA 杂交分子作用 使新形成的 8 个碱基杂交分子 之前的 DNA RNA 杂交分子发生解离 然后保持 RNA 单链的解离状态 Rpb1 的舵结构与盖配合作用 通过与 9 和 10 碱基相互作用而保持杂交分子的解离 Rpb2 的环结构通过与 RNA 的 5 6 和 7 位相互作用而保持 DNA RNA 的杂交 状态 15 RNA 聚合酶聚合酶 II 的的 A 位点和位点和 E 位点有何功能 位点有何功能 答 E 位点是核糖核苷酸的进入位点 A 位点是磷酸二酯键的形成位点 16 接头扫描突变的原理和过程接头扫描突变的原理和过程 答 原理 在 DNA 上用已知无启动子活性的短 DNA 片段替换原有片段 根据 其转录活性变化与否来判断启动子的位置 过程 在 DNA 上进行单一位点限制酶切割 造成缺口并消化缺口两端 使酶 切位点附近缺失 10bp 左右的核苷酸 然后用已知无启动子活性的 10bp 的接头 接入切割为点 观察其转录活性 从而判断所切位点是否具有启动子活性 17 分别说明分别说明 I 类 类 II 类和类和 III 类启动子的特点 类启动子的特点 答 I 类启动子的特点 其在物种之间的保守性不高 但基本结构比较保守 具 有两个元件 核心启动子 位于转录起始位点附近 和上游启动元件 这二者 之间隔距离对于起始转录效率的影响很大 而序列的删除比插入更易影响启动 子的起始转录效率 I 类启动子为一双元启动子 UBF 结合于上游的 UPE 增加 了核心结合因子于核心启动子的结合 从而使 RNA 聚合酶 I 定位于转录起始点 这些元件在转录起始过程中的作用都是至关重要的 II 类启动子的特点 主要分两大部分 核心启动子和上游启动原件 其中核心 启动子又可分为 4 大部分 BRE TFIIB 识别元件 TATAbox 起始子和下有启 动子元件 这四部分中即使缺失一个或几个 其仍具有正常的功能 下有启动 子元件可以取代 TATAbox 这两个元件很少同时出现在同一个启动子中 上游 启动子元件具有方向非依赖性而位置依赖性 III 类启动子的特点 其主要存在于 5srRNA 和 tRNA 编码基因的上游 其拥有 两种启动子 上游启动子和下游启动子 上游启动子包含 3 个短的共有序列 可以被转录因子结合 下有启动子又称内部启动子 位于转录区的内部 可以 诱发上游一定距离的转录起始 18 试说明试说明 II 类前起始复合物中 聚合酶 启动子 类前起始复合物中 聚合酶 启动子 TBP 及及 TFIIB TFIIE TFIIF TFIIH 的相互作用关系 的相互作用关系 答 TBP 和 8 10 个拷贝的 TAFIIs 组成 TFIID TFIID 在 TFIIA 的帮助下结合于 TATAbox 形成 DA 复合体 紧接着 TFIIB 结合于之上形成 DAB 复合体 TFIIF 帮助 RNA 聚合酶结合于 DNA 链上的 34 到 17 之间 形成 DABPolF 复 合体 最后 TFIIE TFIIH 依次结合形成完整的转录起始前复合体 DABPolFEH 19 说明前起始复合物与三类无说明前起始复合物与三类无 TATA 盒启动子的结合 区分每种情况的组装因盒启动子的结合 区分每种情况的组装因 子 子 答 三类无 TATA 盒启动子 其组装因子的区别主要是利用的 TAFII 不同 第一种 启动子区只包含起始子 启动子的识别除 TBP 外还需要 TAFII250 和 TAFII150 来帮助 TBP 识别并结合起始子 第二种 启动子区只包含起始子和 DPE 启动子的识别除 TBP 外同样也还需要 TAFII250 和 TAFII150 来帮助 TBP 识别并结合起始子和 DPE 第三种 只有上游启动元件 GC 区 与以上两种不同的是除了前两种 TAFII 多 了一个 TAFII110 TAFII110 识别 GC 区 而 TAFII110 通过 TAFII250 和 TAFII150 与 TBP 结合 20 如何知道如何知道 TFIIIA 对对 5S rRNA 基因而非基因而非 tRNA 基因的转录是必需的 基因的转录是必需的 答 TFIIIA 含有 9 个锌指排成一行 可以插入 5S rRNA 启动子任一边的大沟内 形成紧密的蛋白质 DNA 复合物 从结构上说明了 TFIIIA 对 5S rRNA 启动子会 产生影响 另根据电泳分析 利用抗 TFIIIA 的抗体对聚合酶 III 转录的影响进 行分析 加入抗体前可以清楚的观察到细胞提取物中 tRNA 和 5SrRNA 的特征 条带 说明二者皆正常表达 然而当加入抗体后仍然有 tRNA 的条带 说明 tRNA 仍然可以被正常转录 而 5S rRNA 的条带消失了 由此说明 TFIIIA 对 5S rRNA 基因而非 tRNA 基因的转录是必需的 21 分析题 分析题 已知蛋白质已知蛋白质 X 和和 Y 相互作用 如何定位蛋白质相互作用 如何定位蛋白质 X 与与 Y 作用的具体作用的具体 区域 区域 答 当你确定了两个蛋白质分子之间有相互作用后 利用酵母双杂交技术可以 精细研究蛋白质分子中那些结构起结合调节作用 你可以先把一个蛋白进行随 机缺失 制备一系列缺失体 然后来检测这些缺失体与另一个蛋白质结合力的 大小 直到发现在蛋白质两两分子间起决定作用的氨基酸序列 称为结构域或 motif 如果一个蛋白分子中具有已知的结构域或motif 也一样进行缺失 看 是否这些已知的结构域或motif参与结合调节作用 然而 某些氨基酸序列的缺 失可能导致其空间结构的改变 而导致二者无法结合 即虽然缺失的氨基酸不 是二者相互作用的区域 但由于这些氨基酸的缺失导致蛋白空间结构发生改变 使活性区域被包埋或无法形成促进结合的空间构象 从而出现假阳性 为了克 服以上弊端 我们可以用计算机对缺失突变后的序列进行空间构象的模拟预测 并把它与蛋白的天然构想进行比对 进一步验证缺失突变的结果 22 列举真核激活因子列举真核激活因子 3 类不同的类不同的 DNA 结合域和结合域和 3 类不同的转录激活域类不同的转录激活域 答 DNA 结合域 1 螺旋 转折 螺旋结构 这一类蛋白质分子中有至少两个 螺旋 中间由 短侧链氨基酸残基形成 转折 近羧基端的 螺旋中氨基酸残基的替换会影 响该蛋白质在 DNA 双螺旋大沟中的结合 2 锌指结构 其特有的半胱氨酸和组氨酸残基之间氨基酸残基数基本恒定 有锌参与时才具备转录调控活性 重复的锌指样结构都是一个 螺旋与一个反 向平行的 片层的基部以锌原子为中心 通过与一对半胱氨酸和一对组氨酸之 间形成配位键相连接 锌指环上突出的赖氨酸 精氨酸参与 DNA 的结合 3 碱性亮氨酸拉链 一般在蛋白的羧基端 35 个氨基酸残基具有能形成 螺 旋的特点 其中每隔 6 个氨基酸就有一个亮氨酸残基 这就导致第 7 个亮氨酸 残基都在螺旋的同一方向出现 这是其形成二聚体的基础 通过形成二聚体 其使肽链氨基端 20 30 个富含碱性氨基酸的结构域与 DNA 结合 在没有形成二 聚体的情况下这 20 30 个氨基酸与 DNA 的结合能力很低 转录激活结构域 转录激活结构域 1 带负电荷的螺旋结构 这种酸性螺旋结构特异性诱导转录起始的活性并不 是很强 他们可能与 TFIID 复合物中某个通用因子或 RNA 聚合酶 II 本身结合 并有稳定转录起始复合物的作用 2 富含谷氨酰胺的结构 如 SP1 是启动子 GC 盒的结合蛋白 除结合 DNA 的锌指结构以外 SP1 共有 4 个参与转录活化的区域 其中最强的转录活化域 很少有极性氨基酸 却富含谷氨酰胺 达该区氨基酸总数的 25 左右 3 富含脯氨酸的结构域 如 CTF NF1 因子 其羧基端富含脯氨酸 达 20 30 左右 23 染色体结构 组成与基因表达染色体结构 组成与基因表达 答 结构 所谓染色体 DNA 与组蛋白 H2A H2B H3 H4 各两个组成的八聚体核 心以一定规律盘绕后形成核小体 众多核小体组成染色质细丝 进一步压缩形 成螺线管状结构 再进一步压缩成超螺旋 最后一步压缩形成染色体 总压缩 倍数接近 1 万倍 大量非组蛋白亦结合于染色体上 功能各异 组成 染色体包括 DNA 和蛋白质两大部分 蛋白质部分又可分为组蛋白和非 组蛋白 组蛋白是染色体的结构蛋白 它与 DNA 组成核小体 经过多级盘绕 形成紧凑的染色体结构 非组蛋白则包括如下几种 高速泳动蛋白 其作用可 能与 DNA 的超螺旋结构有关 DNA 结合蛋白 它们可能是一些与 DNA 复制 或转录有关的酶或调节物质 A24 非组蛋白 其功能不详 基因表达 进行基因表达时 核小体组蛋白的 N 端经乙酰化等修饰 使得 DNA 暂时脱离组蛋白的束缚 从而在 RNA 聚合酶和转录因子组成的复合物的 作用下进行基因表达 之后组蛋白去乙酰化 DNA 与组蛋白重新形成核小体 染色体上存在一些异染色区 这些区域高度压缩 其中的 DNA 已经失去了基 因表达的活性 无法表达基因产物 24 绝缘子的结构与功能绝缘子的结构与功