食品中空肠弯曲菌检测---江苏出入境

空肠弯曲菌检测,一、空肠弯曲菌的分类和特性：,属于弯曲菌属。 主要包括空肠弯曲菌（Campylobacter jejuni）、结肠(或大肠）弯曲菌（Campylobacter coli）、海鸥弯曲菌（Campylobacter lari）、乌普色拉弯曲菌（Campylobacter upsalensis）、胎儿弯曲菌（Campylobacter fetus）等11种。 其中空肠弯曲菌（C. jejuni）对食品安全的威胁最为严重。,空肠弯曲菌（Campylobacter jejuni）是从20世纪80年代起受到国内外广泛重视的人畜共患病菌。 致病性： 人类：急性细菌性肠炎、格林-巴利综合征 （GBS）、食物中毒。 动物：雏鸡腹泻与肝炎；火鸡的肝炎与蓝冠病。犊牛的腹泻；绵羊的腹泻或流产。,空肠弯曲菌的生物学特性,革兰氏染色阴性。呈弧形，S形或螺旋形； 菌体两端尖，有极鞭毛，能做 快速直线或螺旋体状运动； 1.55m0.20.5m， 无荚膜。 微需氧环境：5% O2、10%CO2和85%N2。 最适生长温度：42-43，37 可生长，30 以下不生长。,空肠弯曲杆菌的流行病学和临床表现,宿主： 家禽、野生鸟类为最主要的传染源。 (Rosef 等在1981年调查了129个野生鸟类，结果 表明24.8%携带空肠弯曲菌) 鸟类迁移会造成病原菌对湖水与河水的污染。,细菌分布范围 * 该菌分布广泛，已从多种动物中分离出；也发现于食物与饮水中，尤其是畜禽肉及脏器与鲜奶。 * 食用动物中鸡的带菌率为首位，其次为猪。主要分布在活鸡的消化系统中如腺胃、十二指肠、空肠、回肠、盲肠、直肠、泄殖腔等。 * 该菌在人或动物的粪便中存活约4周；在被污染的水源中可存活约5周。,感染途径： * 传播途径主要是由于摄取了该菌污染的食物与 饮水后，细菌在人肠道内大量生长繁 殖，引起 急性肠炎。 * 被污染的禽肉与未经过巴氏消毒的牛奶是导致 发病的主要原因.,患者临床表现： 患者表现为发热、腹泻、呕吐或肌肉痛。潜伏期平均3-5天，病程约7-10天，粪便的特征是有时带血，镜检中有多形核白血球，重症病例也有痢疾样血、粘液粪便。,根据美国疾病控制与预防中心（USA-CDC）多年的美国食源性病原微生物引起发病人数的统计资料，空肠弯曲菌导致的病例数排名第二。禽肉、生牛奶中的空肠弯曲菌被美国列为重点监测食源性致病菌之一。32nd CCFH（1999年）提出5组优先评估的“病原-食品”组合,其中包括“禽肉-空肠弯曲菌”。 空肠弯曲菌在许多发达国家也是被报告最普遍的胃肠炎致病菌之一，如：美国、英国、丹麦、芬兰、爱尔兰、荷兰、挪威、瑞典、瑞士等。,二、空肠弯曲菌的检验技术,空肠弯曲菌,空肠弯曲菌： 在微需氧条件下42生长而25不能生长，在选择性固体培养基上形成特征性菌落，按照本标准检验时具有相符合的运动特性、生长特性与生化特性的革兰氏阴性菌。,设备和材料,微需氧培养装置: 能够提供微需氧条件（5% O2、10% CO2和85% N2) 如使用产气剂的 厌氧罐/袋或其它 可代用的装置等。,三气培养箱（如Binder等 ),弯曲菌检验程序,增菌液接种,方法一：稀释处理 将24 h和48h的增菌液原液分别划线接种mCCDA平板. （备注：也可选用CFA显色平板或SimPlate分离鉴定及定量培养基） 优点：经济、方便 缺点：可能会有杂菌干扰,mCCDA平板上所挑取的可疑菌落通常带有金属光泽、扁平、湿润、沿划线生长。,CFA显色平板上所挑取的可疑菌落为红色、突起、湿润，菌落较小直径约23mm，边缘有一圈红色的透明环，中间有一个圆形的不透明、颜色较深的红色小点的菌落。,将所挑取的35个可疑菌接种到不含抗生素的哥伦比亚血琼脂平板，微需氧条件下420.5培养24 h-48h后，进行后续的空肠弯曲菌鉴定。,空肠弯曲菌的鉴定,快速鉴定 1. 形态与动力性检测 * 对挑取菌落进行革兰氏染色镜检，空肠弯曲菌为革兰氏阴性，弯曲如小逗点状，两菌体的末端相接时，呈S形、海鸥展翅状或螺旋状。 * 对挑取可疑菌落制作湿片，镜检可见本菌呈螺旋样运动。,快速鉴定,2 .氧化酶试验 使用铂/铱接种环或玻璃棒，挑取单个菌落的一部分，然后接种到用氧化酶试剂润湿的滤纸上，如果在10秒内出现紫红色、紫罗兰或深蓝色为阳性，弯曲菌则为阳性。,快速鉴定,3. 过氧化氢酶检测 挑取一环菌落培养物，加到在干净显微镜玻片上的一滴3过氧化氢溶液中，如果在30秒内出现气泡则判定结果为阳性。,快速鉴定,4. 马尿酸盐水解试验 挑取欲检测的菌落培养物，加到盛有0.4mL 1的马尿酸钠的试管中制成菌悬液，注意不要带入培养基琼脂。混合均匀后在37水浴中温育2 h或36培养箱中温育4 h。轻轻地在马尿酸盐溶液的顶部加入0.2mL茚三酮溶液，不要振荡，在37水浴或36培养箱中温育10 min后判读结果。若出现黑紫色则为阳性；若出现淡紫色或没有颜色变化则为阴性。,快速鉴定,5. 吲哚乙酸脂水解试验 挑取欲检测的菌落培养物，加到羟基吲哚醋酸盐纸片上面，再滴加一滴灭菌蒸馏水。如果吲哚乙酸脂水解，则在510min内出现深蓝色；若没有颜色变化则表示水解反应没有发生。,后续鉴定 1. 微需氧条件下25生长试验 2. 有氧条件下420.5生长试验 3. 先锋霉素（头孢霉素）的敏感性检测 （可选） ISO ：奈啶酮酸的敏感性检测 （越来越多的C.jejuni与C.coli的非特异 性菌株出现）,后续鉴定,微需氧条件下25生长试验 挑取欲检测的菌落培养物，接种到哥伦比亚血琼脂平板上，25微需氧条件下培养484h，若为空肠弯曲菌则不出现生长。,后续鉴定,有氧条件下420.5生长试验 挑取欲检测的菌落培养物，接种到哥伦比亚血琼脂平板上，420.5有氧条件下培养484 h，若为空肠弯曲菌则不出现生长。,后续鉴定,先锋霉素（头孢霉素）的敏感性检测（可选） 挑取菌落培养物，在布氏肉汤中制备成浓度为0.5 McFarland的菌悬液，再用布氏肉汤制备1：10的稀释液，在5Mueller Hinton血琼脂平板上进行涂布，静置5min后去除多余液体，将平板在36培养箱中放置10 min。将先锋霉素（头孢霉素）药敏纸片放在琼脂表面。培养皿盖子在上面，36微需氧条件下将平板培养222h。如果细菌紧贴着纸片生长则为有抗性；如果纸片周围出现不同程度的细菌抑制生长则为敏感,主要弯曲菌的生化特性与鉴定表： 空肠弯曲菌 结肠弯曲菌 海鸥弯曲菌 乌普萨拉弯曲菌.形态、动力性： 革兰氏阴性，弯曲如小逗点状，两菌体的末端相接时呈S形或 螺 旋状或海鸥展翅状，并呈现螺旋样运动氧化酶试验： 阳 性过氧化氢酶试验： 或微弱马尿酸盐水解试验： 吲哚乙酸脂水解试验： 先锋霉素敏感性： R R R S微需氧条件25生长试验： 不生长有氧条件42生长试验： 不生长 （注： 阳性； 阴性； S 敏感； R 有抗性）,已试用过的弯曲菌生化鉴定与筛选检测的商品化试剂,C.1 弯曲菌的生化鉴定系统 C.1.1 API为手工生化鉴定系统，用于弯曲菌的菌种鉴定，鉴定结果准确，所需时间1天 。（需要一定的技术与经验积累） C.1.2 VITEK 2 为自动生化鉴定系统，可以鉴定出空肠弯曲菌空肠亚种、结肠弯曲菌、胎儿弯曲菌胎儿亚种，且结果准确，操作简便，所需时间6小时左右。,微生物API鉴定系统,C.2 弯曲菌的筛选检测方法 C.2.1 miniVidas用于弯曲菌的初筛，原理为酶联荧光免疫分析(ELFA)方法。对于结果阴性的可以直接判定为阴性，对于结果阳性的需进一步确认，可比传统方法快2天。（具体参照厂家说明）