植物生物技术.doc

植物生物技术的概念：植物生物技术: 指对植物品质和性状进行改造的生物技术 植物生物技术核心技术及其在农业生产中的应用创造新材料 培育新品种 开发功能食品快速繁殖稀有材料 材料的指纹分析 新基因挖掘、定位、辅助育种等第一章 植物组织培养的应用： （1）快速繁殖和规模化生产 （2）培养无病毒植株 （3）培育转基因植物 （4）突变体筛选 （5）制成人工种子 灭菌的方法和原理 （1）灭菌方法 物理灭菌：高温高压灭菌 干热灭菌 射线照射灭菌 过滤灭菌 化学灭菌：熏蒸灭菌 消毒液灭菌 （2）灭菌原理 （a）高温高压灭菌 原理：将待灭菌的物品放在一个密封的高压高温灭菌锅内，在121高温和每平方厘米1个大气压下，一般持续1520 min，就可杀死一切微生物的营养体及其孢子，适于器皿、工具、衣物和培养基灭菌。 （2）过滤灭菌法 原理：将带菌的液体或气体通过孔径小于0.45m微孔滤器装置， 使液、气体通过滤膜流入无孔瓶中。 培养基的种类和特点 目前发展出的培养基有几十种，但常用的有MS、B5、white、N6、SH、KM8P等。 （1）MS培养基 1962年Murashige和Skoog为培养烟草组织时设计的，是目前应用最广泛的一种培养基。 无机盐浓度高，养分平衡，尤其是铵盐和硝酸盐的含量很大 它不适合生长缓慢、对无机盐浓度要求比较低的植物，尤其不适合铵盐过高易发生毒害的植物。 与MS培养基基本成分较为接近的还有LS、RM培养基，LS培养基去掉了甘氨酸、盐酸吡哆醇和烟酸；RM培养基把硝酸铵的含量提高到4950mg/L，磷酸二氢钾提高到510 mg/L。 （2）White培养基 1943年由White设计的，1963年做了改良。 无机盐浓度较低 适于生根培养 （3）N6培养基 1974年，朱至清等学者为水稻等禾谷类作物花药培养而设计的 KNO3和（NH4）2SO4含量高，不含钼 适于花粉和花药培养。 （4）B5培养基 1968年由Camborh等设计的 含有较低的铵盐，较高的硝酸盐和盐酸硫胺素。铵盐可能对不少培养物的生长有抑制作用 适合于某些双子叶植物特别是木本植物的生长。 （5）SH培养基 1972年由SchenkHid和Hidebrandt设计的。 它的主要特点与B5相似，不用（NH4）2SO4，而改用NH4H2PO4，是无机盐浓度较高的培养基 在不少单子叶和双子叶植物上使用，效果很好。 KM8P Kao and Michayluk 1975 有机成分较复杂，它包括了所有的单糖和维生素，呼吸代谢中的主要有机酸。 主要用于原生质体培养 培养基的成分及配制方法培养基中包括植物生长必需的15种营养元素和某些生理活性物质，可概括为四大类：1、无机营养物:植物生长发育中非常重要u 镁（Mg）是叶绿素分子的一部分u 钙（Ca）是细胞壁的组分之一u 氮（N）是各种氨基酸、维生素、蛋白质和核酸的重要组成部分u 此外，铁（Fe）、锌（ Zn）和钼（Mo）等是某些酶的组成部分。植物除了碳（C）、氢（H）和氧（O）外，已知还有12种元素对于植物的生长是必需的，它们是氮(N)、磷（P）、钾（K）、硫（S）、钙(Ca)、镁(Mg)、铁(Fe)、锰（Mn）、铜（Cu）、锌(Zn)、硼（B）和铝（Al）。前6种元素需要的数量较大，称之为大量元素或主要元素后6种元素需要的数量较小，称为微量元素或次要元素按照国际植物生理协会的建议，植物所需要的浓度大于0.5mmol/L的元素为大量元素，小于0.5mmol/L的元素为微量元素2、有机营养成分主要包括碳源（糖类）和维生素类 最常用的碳源是蔗糖和葡萄糖 使用浓度为2%5% 作为植物生长发育所需的营养物质 调节培养基中的渗透压 维生素：u 硫胺素（维生素B1）一般认为是一种必需的成分u 吡哆醇（维生素B6），烟酸（维生素B3），泛酸钙（维生素B5）和肌醇也都能显著地改善培养的植物组织生长状况3、植物生长调节物质(激素）主要有五大天然激素（和人工合成的生长调节物质生长素）：植物五大天然激素的合成部位吲哚乙酸 分生组织、种子细胞分裂素 根尖赤霉素 生长的种子脱落酸、乙烯 成熟、衰老和环境条件4、其他附加物 不是植物生长所必需的，但对细胞生长有益（1）凝固剂 琼脂(agar)是固体培养基的必要成分，琼脂是一种由海藻中提取的高分子碳水化合物，本身并不提供任何营养 琼脂能溶解在热水中，成为溶胶，冷却至40即凝固为固体状凝胶。（2）抗生素 抗生物质(antibiotic)，包括青霉素、链霉素、庆大霉素等，用量在520mg/L之间 添加抗生物质可防止菌类污染，减少培养中材料的损失，尤其是快速繁殖中，常因污染而丢弃成百上千瓶的培养物，采用适当的抗生素便可节约人力、物力和时间 （3）活性炭 活性炭为木炭粉碎经加工形成的粉沫结构，它结构疏松，孔隙大，吸水力强，有很强的吸附作用 通常使用浓度为0.5l0gL 活性炭（active carbon）可以降低组织培养物的有害代谢物浓度，对细胞生长有利培养基的制备1、母液的配制 配制母液有两个好处: 可减少每次配制称量药品的麻烦 减少极微量药品在每次称量时造成的误差（1）大量元素母液: 可配成10倍母液,用时每配1000ml培养基取100ml母液（2）微量元素母液 因含量低，一般配成100倍甚至1000倍，每配1000ml培养基取10ml或1ml（3）铁盐母液 必须单独配制，若与其它元素混合易造成沉淀（4）有机化合物母液 主要是维生素和氨基酸类物质，这类物质不能配成混合母液，一定要分别配成单独的母液，浓度为每毫升含0.1,1,10mg,使用时根据需要量取（5）激素 每种激素必须单独配成母液，其浓度为0.1, 0.5或1.0mg/ml, 多数激素难溶于水，2、培养基的配制（1）分别按配方逐个加入各种贮备液，包括生长调节物质和其他的特殊补加物。（2）充分混合之后，用1mol/L Na0H和1mol/L HCl调节培养基的pH。一般来说，植物组织培养适合的pH值为5.8，当pH高于6时，培养基将会变硬，低于5时，琼脂就不能很好地凝固。(3)称出规定数量的蔗糖或葡萄糖，加水直到培养基最终容积 。（4）加入一定数量的凝固剂（琼脂或非态胶），加热融化（5）把培养基分装到所选用的培养容器中，每个 25150mm的试管约装培养基15m1；每个100ml三角瓶约装50ml。（6）用封口膜封口（7）灭菌（高压灭菌）对于不能用高压灭菌的药品来讲，经过滤灭菌后的药液等到高压灭菌的培养基冷却到大约60时，在超净工作台加入到培养基中，摇匀。第二章看护培养：将发育正常的胚的胚乳作为看护组织，进行胚乳发育障碍胚的离体培养。胚培养的意义1、克服远缘杂交不亲和性和杂种不育性，获得种间或属间杂种2.获得单倍体植株 3.克服种子休眠，提早结实 4.缩短育种周期，提高育种效率5、种子生活力的快速测定6.稀有植物的繁殖(使种子无生活力或胚发育不全的植物获得后代)离体胚培养时，胚发育几种可能途径（1）胚胎发育途径：幼胚经过心形期，再发育到鱼雷形期，进而进入子叶期，最后萌发成苗。这是幼胚培养成功的途径。（2）早熟萌发途径：幼胚从心形期发育到鱼雷形期后，不经过子叶期直接发育成苗，即跳过某一个发育阶段，这样的幼苗往往很弱小，组织不健全，且难于培养成正常的植株。（3）产生愈伤组织：幼胚培养过程中细胞脱分化产生愈伤组织。通过幼胚培养产生的愈伤组织，经植株再生同样可得到远缘杂种。据报道，由胚培养产生的愈伤组织较其它外植体容易得到再生植株。（4）停止生长或幼胚死亡。非常小的幼胚进行培养时，接种后常遇到细胞生长停滞，如不采取一些拯救措施，幼胚细胞即死亡。第三章愈伤组织：是指将植物上的某个部分切下，形成外植体，接种到适宜的培养基上培养，其外植体组织的增生细胞产生的一团不定形的疏松排列的薄壁组织脱分化：使已分化的体细胞，在人工诱导的条件下回复到未分化的原始状态并具有细胞全能性表达潜力的过程再分化：处于脱分化状态的愈伤组织，再度分化成其他类型的细胞、组织、器官，甚至最终再生成完整植株的过程细胞全能性：所谓细胞的全能性，就是植物的每个细胞都具有该植物的全部遗传信息和发育成完整植株的能力。从理论上讲，生物体的每一个活细胞都应该具有全能性。差异：（1） 受精卵的全能性最高 （2） 受精卵分化后的细胞中，体细胞的全能性比生殖细胞的低。体细胞胚胎发生：体细胞胚胎发生：在离体培养条件下，植物体细胞形成胚性细胞，然后经过一系列形态学及生物化学的变化形成类似合子胚结构的过程。愈伤组织诱导的形成过程（三个时期）植物愈伤组织诱导(callus inducing)：使那些已分化的体细胞包括离体的器官、组织和细胞在人工培养基上，经多次细胞分裂而失去原来的分化状态，形成无结构的愈伤组织或细胞团的过程大致经历起动期，分裂期和形成期3个阶段（1）起动期(诱导期)，外植体已分化的活细胞在外源激素的作用下，通过脱分化起动而进入分裂状态,开始形成愈伤组织。(2) 分裂期: 外植体切口边缘开始膨大，外层细胞通过一分为二的方式进行分裂，从而形成一团具有分生组织状态细胞的过程。(3) 形成期: 外植体的细胞经过诱导，分裂形成了具有无序结构的愈伤组织时期植株再生的两个途径及其比较（这里不太确定，你们可以看看课件）植株再生的两种途径：器官发生(organogenesis)和体细胞胚胎发生(somatic embryogenesis) 体细胞胚胎发生：在离体培养条件下，植物体细胞形成胚性细胞，然后经过一系列形态学及生物化学的变化形成类似合子胚结构的过程。体细胞胚是一个二极结构，不物理地附着于原组织，每一个体细胞胚称为胚状体，它可以同合子胚一样发育成植株。器官发生：是指培养条件下的组织或细胞团（愈伤组织）分化形成不定根（adventitious roots）、不定芽（adventitious shoots）等器官的过程 。 两种形态发生的结构特点胚状体途径形成的植株细胞内出现方向相反的两极分化，具有根端和芽端两个分生中心不定胚维管组织与外植体维管组织不相连具有典型的胚胎形态发生过程形成的幼苗具有子叶胚状体发育的苗，根和芽齐全器官途径形成的植株单向极性，单个分生中心直接分化为器官不定芽和不定根与愈伤组织的维管相连,无胚胎形态不定芽的苗无子叶先长芽后长根，或先长根后长芽影响器官发生的因素（1）化学因素 早期烟草组织的研究，器官发生的表达可被外源化学物质控制 高浓度的生长素和低浓度的分裂素可以促使细胞连续繁殖无组织的生长 高浓度的分裂素能引起茎-芽（shoot-bud）形成 auxion/cytokinin之比值的变化成为特定的器官、根或芽分化的一个参数 生长素促进根分化，分裂素促进芽分化 生长素与根形成有关，同时对于愈伤组织的保持也是必须的 在促进芽的分化中，BAP （苄氨基嘌呤）是最有效的（2）物理因素 光： 很多光照条件下，一些植物均能进行器官发生，说明光周期并不是非常重要的因子 有的植物在光、暗交替条件下才能形成芽，而在连续光照下则不能 尽管如此，多数植物需要一个稳定的光周期，多数培养条件是14-16h光照，8-10h黑暗 温度：不同植物不一样，需要摸索，如烟草和棉花就不一样影响胚状体发生和发育的因素1影响胚状体发生和发育的外部条件.植物激素a.生长素类物质胡萝卜胚状体的发生可分为两个阶段外植体细胞的脱分化、愈伤组织的诱导、胚性细胞或细胞团的形成，培养基必须含有生长素类物质，主要是2，4-D胚状体的形成和发育，必须在降低2，4-D浓度或完全去除2，4-D的培养基上才能进行其它生长素如IAA、NAA、NOA、2，4，5-T等的作用与2，4-D大致相同，但诱导的效果和对胚状体形成的抑制作用不完全一致绝大多数植物均属于这一模式，但不同的植物在含生长素时胚状体发育时期不一样，有的只能产生胚性愈伤，有的可达圆球胚，有的可达鱼雷胚，个别植物可发育到成熟胚这些不同发育程度的胚状体都必须在转移到无生长素或生长素含量很低的培养基上以后才能继续发育和成株b.细胞分裂素类物质 不仅没有诱导的作用(单独使用不能诱导愈伤),而且对已完成诱导的愈伤组织中胚状体的发生还有抑制作用。但在除去，胚状体发生能力还可能部分地恢复。c.其它激素 一般ABA、GA抑制胚状体发育，但有人认为，ABA对柑桔的胚状体发生有明显的促进作用含氮化合物 NH4+与NO3-的作用不同 NH4+/NO3-的比例 氨基酸、酰胺等有机氮其它外部因素离子浓度、逆境胁迫、悬浮培养等2影响胚状体发生和发育的内部因素 植株基因型的影响培养个体的遗传基础决定了离体培养的反应能力不同种的植物甚至同种植物的不同品种(或不同地理来源)个体之间，其个体基因型存在着差异，这就决定了不同的体细胞胚胎发生能力生理上的隔离 细胞与其周围组织之间生理上的隔离是其进行胚状体发生的先决条件。外植体的年龄(生理状态)与来源少数植物如胡萝卜，几乎所有的器官都可诱导 产生胚状体大多数植物，在目前只有一定发育时期的某些器官可产生胚状体一般以幼嫰组织作外植体较易诱导胚状体培养时间和细胞倍性变化的影响一般由初分离或诱导的或仅经过短时期培养的愈伤组织，最易产生胚状体随着培养时间的延长，形成胚状体的能力下降以至完全消失培养细胞倍性的变化可能对胚状体的形成有一定影响内源激素水平的变化外源生长素对体细胞胚产生和发育的调控是通过调节内源激素的合成、代谢、极性运输和平衡而起作用的第四章体细胞无性系变异：体细胞培养的任何阶段所产生的变异（细胞，原生质体，愈伤组织，再生植株等）统称为体细胞无性系变异体细胞无性系变异的特点1、变异广泛包括数量性状、质量性状、染色体数目和结构变异，DNA扩增和减少，生化特性变化等，以数量性状变异为主 2、变异频率高棉花体细胞培养获得的每一个再生植株几乎都存在一定程度的变异。3、后代稳定快一般无性系二代就可获得稳定株系，这是优良性状选择的关键时期，从而大大地缩短育种年限4、潜在的隐性性状和显性性状的活化在无性系变异后代不但出现显性性状的改变，常出现一些供体植株所没有的隐性性状的变异如雄性不育、矮杆等5、起点高，效率高选用现行最好的品种（系），作为起始材料，一旦选育出就能超过现有的品种，不需要多年的适应性试验体细胞无性系变异的应用（这是在育种中的应用）一、直接利用体细胞变异材料二、利用诱变技术或进行定向选择获得体细胞变异材料三、体细胞突变体的应用当前在农业上，体细胞突变体筛选技术研究主要集中在抗病、 抗盐、抗除草剂、抗低温、高温等逆境胁迫的突变体筛选。另外，在提高作物营养物质（如蛋白质、赖氨酸等）改变作物品质方面也取得了一定进展。体细胞无性系变异育种应用中存在一些不足: 1、产生的变异多，变异类型复杂，并非所有的变异都可以稳定遗传，离体选择只对那些在离体培养和移栽到大田环境都表现的表型变异有效，即能在后代稳定表达和遗传； 2、变异方向难以控制，难以预测，负向变异多，或有一个性状表现优良，但其它方面则呈现负向，变异并非都是新的变异； 3、筛选出的突变性状随着代数的增加，存在逐渐丧失抗性的趋势；同时一些抗性突变体的筛选与丰产性之间存在一定的矛盾；4、植物细胞群体和微生物相比，除原生质体外，难以像微生物那样获得完全是单细胞的群体；在离体培养时增殖速率远低于微生物，且多次继代后特别是经过相应因子筛选，很快丧失分化能力； 5、无性系变异选择并非对所有的作物都有效，更适应于营养繁殖作物。第五章原生质体：指采用机械或酶解法去掉细胞壁的裸露细胞 由于没有细胞壁，原生质体为作物遗传改良和植物学研究提供了极为有利的试验材料。原生质体分离方法原生质体分离的最基本原则是保证原生质体不受伤害及不损害它的再生能力一、分离方法1、机械法分离质壁分离细胞 缺点：产量极低；应用的材料受限制；操作极费力2、酶法分离 酶法可在短时间内获得大量原生质体 分为直接法和顺序法两种 缺点是：不纯的酶制剂所含杂质对原生质体可能有不同程度的毒害作用原生质体融合的意义（应用找不到） 物种间生殖隔离阻碍了物种之间的基因交流,从而给作物育种带来很大的局限性 原生质体融合技术是实现基因重组的一条新途径，目前利用细胞融合已从很多作物种、属间，甚至科间获得体细胞杂种，创造了一些自然界不存在的植物类型（1） 克服有性杂交不亲和和生殖障碍 一些植物的野生材料具有很好的抗性，但与栽培品种之间存在有性杂交不亲和现象，难以通过常规技术实现有益抗性的转移。原生质体融合不涉及到雌雄性配子，从而可以克服生殖障碍 番茄薯或薯番茄尽管没有实际价值，但其设想还是具有很深远的意义 （2 ）转移有利的农艺性状，创造新的种质材料 作物栽培品种常常缺乏某些抗性性状，在栽培中处于不利地位 野生种中具有很多优良的抗性，通过原生质体融合可以将野生种的抗性转移进栽培种中（3） 转移胞质基因，为研究体细胞遗传提供途径和材料 植物的细胞质控制着很多优良的性状，如线粒体控制胞质雄性不育，叶绿体控制的抗除草剂特性 有性杂交的胞质成分主要为母系遗传，不可能实现杂交亲本的胞质杂交。但原生质体融合则可以达到此目的第六章 单倍体在遗传和育种中的应用价值 一、在植物育种中使后代迅速纯合 二、提高选择效率 三、排除杂种优势对后代选择的干扰 四、遗传研究的良好实验材料体系 五、突变体的筛选 六、消除致死基因 七、选育新型自交系 八、遗传转化的受体材料 培养条件下小孢子的发育途径 1）营养细胞发育途径 2）生殖细胞发育途径 3）营养细胞和生殖细胞并进发育途径 4）花粉均等分裂途径 小孢子培养与花药培养的优势体现在哪些方面 小孢子培养在某些方面比花药培养有一定优势 花药培养有时会由于花药中的有害物质而不能诱导小孢子启动第一次分裂，小孢子培养则不会 花粉已是单倍体细胞，诱发都是单倍体植株或双单倍体，不含有因药壁、花丝、药隔等体细胞组织的干扰而形成的体细胞植株 获得的材料总是纯合的，不管它是二倍体还是三倍体 由于花粉能均匀地接触化学的和物理的诱变因素，花粉是研究吸收、转化和诱变的理想材料 可观察到由单个细胞开始雄核发育的全过程，是一个很好的遗传与发育研究的材料体系 小孢子培养的应用第七章 II型限制性内切酶的特点及剪切方式 能识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序内的固定位置上切割双链 识别和切割的核苷酸都是专一的，是DNA重组技术中最常用的工具酶之一 识别的专一核苷酸顺序最常见的是4个或6个核苷酸，少数也有识别5个核苷酸以及7个、8个、9个、10个和11个核苷酸的 识别顺序是一个回文对称顺序，即有一个中心对称轴，从这个轴朝二个方向“读”都完全相同 限制性内切酶的剪切方式 平头末端(blunt ends)： 在同一位置上切割双链，产生平头末端 粘性末端(sticky ends)：交错切割，结果形成两条单链末端，这种末端的核苷酸顺序是互补的，可形成氢键 主要DNA聚合酶的作用 常用的DNA聚合酶： 大肠杆菌DNA聚合酶、大肠杆菌DNA聚合酶的Klenow大片断酶 Taq DNA聚合酶、T7DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶（PCR反应的专用酶）、RNA反转录酶 末端转移酶、碱性磷酸化酶 1、大肠杆菌DNA聚合酶 DNA聚合酶的酶活性： 1. 5 3的聚合酶活性； 2. 5 3的外切酶活性； 3. 3 5的外切酶活性（较低）。 2. Klenow片断与DNA末端标记 Klenow片断：是由大肠杆菌DNA聚合酶I经枯草杆菌蛋白酶的处理之后，产生出来的分子量为76KDa的大片断分子 具有53的聚合酶活性和35 的外切酶活性 失去了全酶的53外切酶活性 3、T4 DNA聚合酶和取代合成法标记DNA片断 具有53的聚合酶活性和35 的外切酶活性 在没有dNTP，3外切酶活性便是T4 DNA聚合酶的独特功能 作用于双链DNA片断，并按35的方向从3-OH末端开始降解DNA。如果反应物中存在一种dNTP时，它的水解作用进行到暴露出同反应物中唯一的dNTP互补的核苷酸时就会停止 在反应过程中，通过T4 DNA聚合作用，反应物中的dNTP逐渐地取代了被外切活性删除掉的DNA片断上原有的核苷酸，因此叫做取代合成 4、T7具有53的聚合酶活性和很高的单链及双链的3 5核酸外切酶活性 DNA聚合酶 5、 Taq DNA聚合酶（PCR反应的专用酶） Taq DNA聚合酶是从极度嗜热的嗜热水生菌Thermus aquaticus中纯化得到的一种耐热的依赖于DNA的DNA聚合酶 Taq DNA聚合酶能够在94高温环境中存活3小时以上，具有DNA聚合酶活性和5-3外切酶活性 Taq DNA聚合酶的最佳聚合温度在72-80之间，在60时它的聚合活性不到最佳活性的1/2，在复性的条件下Taq DNA聚合酶的活性极低 因此利用Taq DNA聚合酶的这种反应特点可以有效地进行PCR扩增反应 Taq DNA聚合酶是以DNA的双链为模板通过变性、复性和延伸3个不同的过程来达到目的片段指数式的增长 6、反转录酶 一类以RNA为模板来指导DNA合成的DNA聚合酶，所以又称为依赖于RNA的DNA聚合酶 具有反转录酶活性和RNaseH活性 主要作用是以mRNA为模板合成cDNA 对5突出末端的DNA片断作末端标记 7、末端核苷酸转移酶（terminal transferase 催化5脱氧核苷三磷酸进行53方向的聚合作用，逐个地将脱氧核苷酸分子加到线性DNA分子的3-OH末端 不需要模板，可以用含有的3-OH DNA片段为引物，在3-OH端加入核苷酸达几百个 它作用的底物可以是具有3-OH末端的单链DNA,也可以是具有3-OH突出末端的双链DNA 8、碱性磷酸酶 用于脱去DNA（RNA）5末端的磷酸根，使5-P成为5-OH，该过程称核酸分子的脱磷酸作用 当需要5端同位素标记或为了避免DNA片段自身连接（或环化）时可进行脱磷酸反应各种载体的种类、结构、容量及特点1、质粒（plasmid）载体 质粒是一种独立于染色体外的小分子环状DNA，可自身复制和表达，有的质粒还带有可做为选择性标记的抗药性基因，经过适当改选后便可成为良好的载体 克隆的质粒载体：允许外源的DNA插入，储存 基因表达的质粒载体：允许外源DNA的插入、储存和表达（1）质粒的生物学特性质粒DNA的构型：SC型 共价闭合环形DNA（cccDNA） OC型 开环DNA（ocDNA） L 型 线性DNA（cDNA）不同质粒的分子量大小差异相当显著：106108D 作为载体的质粒都含有三种共同的组分： 复制基因、选择性记号、多克隆位点质粒DNA编码着一些重要的非染色体控制的遗传性状、抗性特征、代谢特征、修饰寄主生活方式的因子等质粒DNA的接合性 非接合型:不能整合到宿主的染色体上；不能通过“接合” 而转移质粒DNA的复制类型： 低拷贝的质粒（13）：严紧型复制控制的质粒（接合型） 高拷贝的质粒（1060）：松弛型复制控制的质粒（非接合型） 质粒的不亲合性 在同一个大肠杆菌细胞，一般不能同时含有两种不同的质粒。也称为质粒的不相容性 是指在没有选择压力的情况下，两种亲源关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象 质粒的不亲合性分子基础，主要是由于它们在复制功能之间的相互干扰造成的2、 噬菌体载体l噬菌体的生物学特性 l噬菌体是感染大肠杆菌的溶源性噬菌体，在感染宿主后可进入溶源状态，也可进入裂解循环。 基因组为长度约为 50kb 的双链 DNA 分子。 基因组 DNA 呈线性，其两端的 5末端带有 12 个碱基的互补单链（粘性末端，cos位点）。 进入宿主细胞后，其两端互补单链通过碱基配对形成环状 DNA 分子，并随宿主细胞复制。 经过 4045min 的生长循环，释放出约 100 个感染性噬菌体颗粒，或者进入溶源状态（lysogenic state），将基因组 DNA 通过位点专一性重组整合到宿主的染色体 DNA 中，并随宿主的繁殖传给子代细胞。 噬菌体染色体上基因组成包括几个不同的部分： 噬菌体头部合成基因。包括与之对应的编码A，W，B，C，D，E，F等7种不同的蛋白质基因，主要分布在噬菌体的左侧。 噬菌体的尾部合成基因。包括与之相对应的编码Z，U，V，G，H，MLK，I，J等10种不同的蛋白质基因。 与噬菌体的整合、重组等功能有关的基因，例如位于噬菌体中部的att, int, gam, red, six基因等。 与噬菌体的表达调控有关的基因。例如CIII，N，CI，cro和CII等位于噬菌体的右半部分。 其它与噬菌体的合成有关的基因。包括与DNA合成有关的O，P，S，R基因等。3、粘粒(cosmid) 由质粒和噬菌体的cos区构建而成，大小为46kb，容量为3145kb 具有l噬菌体的特性：被包装后能高效转化E.coli 具有质粒载体的特性：自主复制，带有抗性表记，易于选择阳性克隆 高容量的克隆能力：可载高达45kb外源DNA 因不含l的基因，故不会裂解 便于定向克隆4、酵母人工染色体载体 （yeast artificial chromosome, YAC） 人基因组十分庞大，约含4109bp，建立和筛选人的基因组文库，要求有容量更大的载体 YAC含有酵母染色体端粒（telesome）、着丝点(centromere)及复制起点等功能序列 YAC是迄今容量最大的克隆载体，插入片段平均长度在2001000Kb，最大可达2Mb 导入酵母细胞可以随细胞分裂周期复制繁殖供作克隆，成为人基因组研究计划的重要工具 YAC的主要缺点 1存在高比例的嵌合体，即一个YAC克隆含有两个本来不相连的独立片段 2部分克隆子不稳定，在转代培养中可能会发生缺失或重排 3难与酵母染色体区分开，因为YAC与酵母染色体具有相似的结构 4操作时容易发生染色体机械切割5、细菌人工染色体 （bacterial artificial chromosome, BAC） 用于基因组文库的构建 物理图谱构建 基因的图位克隆主要包括oriS， repE（控制F质粒复制）和parA、 parB（控制拷贝数）等成分 具备四个功能区： 与BAC复制和分裂有关的基因，parA，parB，parC是parFIA分裂所必需的三个基因，同时parB，parC与质粒的不相容性有关 复制起点及相关的元件，oriS是RepFIA单向复制子；repE基因编码oriS由复制所必需的RepFIA蛋白质 抗生素标记基因，载体上携带的抗生素标记基因为氯霉素抗性基因，是载体的筛选标记 cosN, loxP分别来源于、P1噬菌体，cosN可被噬菌体的末端酶所切；loxP可由P1噬菌体的Cre蛋白在loxP寡核苷酸存在时切开。这两个位点可作为特定的切点以锚定插入的一端，便于限制性内切酶分析。 BAC的优点1易于用电击法转化E.coli（转化效率比 转化酵母高10-100倍）2超螺旋环状载体，易于操作3F质粒本身所带的基因控制了质粒的复制4很少发生体内重排 克隆载体具备的条件（课本216页）（1） 克隆载体的DNA分子上通常含有1个或者多个克隆位点（多数情况下只具有一个多克隆位点）供外源的DNA片段插入到克隆载体上。（2） 携带有外源的DNA片段（基因）进入到宿主细胞中能够进行自我复制，或者外源的DNA片段能够整合染色体随着染色体的DNA复制而同步进行自我的复制。（3） 载体必须具有可供选择的标记，如抗生素标记。（4） 载体必须是安全的，不含有对受体细胞有害的基因，对于细胞的生长不会产生显著的影响。基因克隆的方法的应用（我找不到，你们可以找找看）第八章一元载体、双元载体：与Ti质粒相同，其原理主要是Ri质粒的Vir基因反式作用驱动T-DNA转移。卸甲载体：无毒的Ti质粒载体遗传转化中常用的选择标记基因、报告基因及其作用机制一、选择标记基因 在转化过程中，仅仅只有极少数植物受体细胞能获得外源基因，而其中目的基因被整合到受体植物基因组并实现表达的细胞就更少 因此，需要尽早对转化细胞进行选择，常用的且最简便的方法是使用特异性选择标记基因 选择标记基因主要是一类编码可使抗生素或除草剂失活的蛋白酶基因 新霉素磷酸转移酶（NPT-II）基因（neo）作用机制：选择试剂通过与核糖体小亚基的结合，从而抑制蛋白质的合成。Npt-II基因编码产物使选择试剂磷酸化而失效。二氢叶酸还原酶（DHFR）基因（dhfr） 潮霉素磷酸转移酶（HPT）基因（hpt）作用机制：潮霉素抑制细胞的蛋白质合成，从而抑制非转化细胞的生长。转化细胞中表达的hpt基因产物通过磷酸化作用使潮霉素失去毒性。 膦丝菌素乙酰转移酶基因（bar）作用机制：选择试剂抑制谷氨酰胺合成酶的活性，从而导致非转化细胞发生氨的致死性累积。 Bar基因编码的膦丝菌素乙酰转移酶，通过乙酰化作用使膦丝菌素失活。二、报告基因报告基因系指其编码产物能够被快速测定、常用来判断外源基因是否成功地导入受体细胞（器官或组织）并检测其表达活性的一类特殊用途的基因理想的报告基因的最基本要求：1）受体细胞中不存在相应的内源等位基因的活性2）它的产物是唯一的，且不会损害受体细胞3）具有快速、廉价、灵敏、定量和可重复性的检测 特性常用报告基因 b-葡萄糖醛酸糖苷酶（GUS）编码酶的作用底物是无色的X-葡萄糖苷酸（X-glucuronide), 将它变成深蓝色的5-溴-4-氯靛蓝在一定条件下与底物X-Gluc发生作用，产生兰色沉淀反应，既可用分光光度计测定又可以直接观察植物组织形成的兰色斑点当加入4-甲基伞形酮基葡萄糖苷酸（MUG）底物时，产生4-甲基伞形酮，发荧光。因而可以用荧光光谱法测定检测容易、迅速且能定量，只需少量植物组织 萤光素酶基因（Luc）来源最常用的是来自萤火虫的萤光素酶基因Vargulla的萤光素酶基因以及细菌萤光素酶基因luxA和luxB也已被用做报告基因检测方法用去污剂处理细胞使之裂解，然后加入ATP、Mg2+和萤火虫的萤光素在有氧的条件下，萤光素酶就会催化萤光素进行氧化反应，产生AMP、CO2和黄绿色萤光 氯霉素乙酰转移酶（CAT）基因 绿色荧光蛋白（GFP）基因绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein)来源于发光生物水母（Aequorea Vitoria）体内的一种发光蛋白在水母体内，水母蛋（aequorin）与Ca2+结合时会自发蓝光，GFP 受此蓝光激发而发出绿色荧光在实验室条件下，用标准的长波长紫外光或者蓝光照射时，GFP受激发也能发出绿色荧光 根癌农杆菌Ti质粒的结构与功能Ti质粒(tumor induced plasmid)是根癌农杆菌染色体外的遗传物质，为双股共价闭合的环状DNA分子，其分子量为95156 x 106 D，约有200300kb依据Ti质粒诱导的植物冠瘿瘤种类的不同，Ti质粒可以分为四种类型：章鱼碱型、胭脂碱型、农杆碱型和农杆菌素碱型（agrocinopine）或琥珀碱型（succinamopine） T-DNA区 ( transfer-DNA region ) T-DNA是农杆菌侵染植物细胞时，从Ti质粒上切割下来转移到植物细胞的一段DNA；该片段上的基因与肿瘤的形成有关。 T-DNA携带的致瘤基因实际上就是一些与激素合成有关的基因Vir区(Virulence region)： 该区段上编码的基因能激活T-DNA转移，使农杆菌表现出毒性，故也称作致毒区。T-DNA区与Vir区在质粒上彼此相邻，合起来约占Ti质粒DNA的三分之一Con区（region encoding conjugations）：该区段存在与细菌间接合转移有关基因（tra），调控Ti质粒在农杆菌间转移。冠瘿碱能激活tra基因，诱导Ti质粒的转移，因此称为接合转移编码区Ori区（origin of replication）：该区段基因调控Ti质粒的自我复制遗传转化的方法及其比较（找不到）转基因植株的检测方法一、外源基因整合状态检测1、PCR 检测方法 检测报告基因或目的基因 快捷、简易、灵敏等优点2. Southern杂交 主要原理 Southern杂交DNA和DNA分子之间的杂交二、外源基因表达的检测1、Northern 杂交 Northern杂交DNA和RNA分子之间的杂交 检测目的基因是否转录出mRNA的方法2、 Western blot3、酶联免疫技术(ELISA ,Enzyme liked Immunosorbent Assay)原理 特殊的抗体被结合固定在固体表面,如微孔板上 加上样品,未被结合的成分被洗掉 通过加上酶的抗体来检测抗原,未被结合的再次被洗掉 酶与底物反应的颜色与样品中抗原的含量成正比4、生化反应检测法 主要通过酶反应来检测 标记基因的检测（卡拉抗性、除草剂抗性） 卡拉霉素抗性检测 在转基因植株的顶端刚展开的幼嫩的叶片上涂抹1%（w/v）的卡那霉素水溶液，7天后，观察叶片涂抹部位的颜色反应来判断结果（黄色为敏感、绿色为抗性）5、生物鉴定法 转基因的目的是增加植株抗性的,为了测定基因是否转入或者转入的是否表达,可以给转基因植株施加生物胁迫因子, 如果产生抗性,表明转基因理想效果。 转Bt 基因的棉花中, 采用抗虫筛选能够最直观地检测到抗虫基因的表达效果转基因的应用（不知道该怎么写）基因枪遗传转化的优缺点基因枪转化方法的优点： 无宿主限制：基因枪技术没有物种限制，对双子叶和单子叶植物都可适用，对动物、微生物也同样适用。 靶受体类型广泛： 几乎所有具有潜在分生能力的组织或细胞都可以用着基因枪转化的受体。 操作简便快速，转化周期短基因枪转化方法的缺点： 转化频率低 嵌合体较多 结果的重复性差 转化的外源基因以多拷贝居多易导致基因沉默 遗传稳定性差 实验成本较高 外源DNA的整合机理等理论问题不清楚第九章近等基因系：个或多个形态上相似，遗传背景相同或相近，只在个别染色体区段上存在差异的遗传材料，称近等基因系(Near isogenic lines，NIL) 遗传标记的发展阶段及各标记的特点 1、形态标记 优点：形态标记简单直观，经济方便，容易观察记载 缺点：数量少，难以建立饱和的遗传图 受环境影响大 有些标记与发育不良性状连锁 2、细胞学标记 能明确显示遗传多态性的细胞学特征 染色体数目的变化和染色体结构的变异 3、生化标记 主要包括贮藏蛋白、同工酶等标记 优点： 基因表达的产物，可以直接反映基因产物的差异，受环境影响较小 缺点： 标记数量有限，不能满足遗传和育种的需要 每一种同工酶标记都需特殊的显色方法和技术 某些酶的活性具有发育和组织特异性 4、分子标记 概念：指在分子水平上可标识的遗传多态性 转换、颠换 插入/缺失 重排 理想的分子标记应具有的特点 高水平的多态性 共显性遗传（可区分某一位点的纯合或杂合状态） 在基因组中出现的频率高 在基因组中均匀分布 具有中性选择特征 容易获得而且可快速分析 重复性好 分离标记所需的费用低 DNA标记多态性的分子基础 分子标记多态性的原理 （一）酶切位点或引物结合位点的变化 （二）酶切位点或引物结合位点之间的插入突变 （三）酶切位点或引物结合位点之间的缺失突变 （四）酶切位点或引物结合位点之间的重复序列的重复次数的变化 （五）单个核苷酸的突变遗传图谱的构建所用的各种群体一、遗传连锁图构建的基础 构建遗传图谱的依据是同源染色体减数分裂过程中会发生交换，交换的结果便使染色体上的基因发生重组 两个基因之间发生重组的频率取决于它们之间的相对距离 基因间的遗传距离用重组率表示，1 cM1的重组率 作图群体分类 暂时性分离群体：回交群体、F2群体以及其衍生群体如F2:3等 永久性分离群体：重组自交系群体(Recombinant inbred lines，RIL)，加倍单倍体群体(Doubled haploid，DH)等 RIL群体是由F2经多代自交一粒传(Single seed descendant，简称SSD)使后代基因组相对纯合的群体 永久性群体有两方面特点： 群体中各品系的遗传组成相对固定，可通过种子繁殖代代相传，可不断地增加新的遗传标记 可以对性状的鉴定进行重复试验以得到更为可信的结果 建立RIL群体相当费时，而且有的物种很难产生RIL群体 分子标记的类型（中英文全称及简称） 基于DNA-DNA杂交 RFLP 基于PCR ISSR, SSR, RAPD,SRAP 基于PCR和RE酶切 AFLP 基于DNA测序 SNP，EST， Retro-transposon一、 基于分子杂交技术的分子标记Molecular Hybridization (核酸分子杂交)：不同来源的单链DNA与单链DNA间，在长于20bp的同源区域内，以氢键连接方式互补配对，形成稳定的双链结构的过程基于DNA-DNA杂交（southern blotting) 的标记 RFLP:Restriction Fragment Length Polymorphism (限制性片段长度多态性标记） VNTR:Variable Number Tandem Repeats (minisatellites)（可变数目串联重复序列标记） 二、基于PCR技术的分子标记 短核苷酸序列引物 耐高温的DNA聚合酶（Taq酶）扩增目标DNA序列 快捷、简易、灵敏等优点 RAPD: Randomly Amplified Polymorphic DNA （随机扩增多态性） SSR: Simple Sequence Repeats (Microsatellites) （简单重复序列） ISSR: Inter-simple sequence repeat （简单序列重复间区） SCAR: Sequence Characterized Amplified Region（序列特征化扩增） STS: Sequence Tagged Sites （序列标签位点）三、基于PCR与限制性酶切技术结合的标记AFLP: Amplified Fragment Length Polymorphisms（扩增片段长度多态性）CAPS: Cleaved Amplified Polymorphic Sequences（扩增片段限制性酶切长度多态性）PCR反应的主要步骤和组分（课本317） PCR反应组分：DNA模板 一对引物 dNTP Taq酶 Mg 2+ 反应缓冲液 ddH2OAFLP技术的步骤限制性内切酶酶切 一般应用两种限制性内切酶在适宜的缓冲系统中对基因组DNA 进行酶切，一种为低频剪切酶(识别位点为六碱基的rare cutter) ，另一种为高频剪切酶(识别位点为四碱基的frequent cutter) 利用双酶切可产生更好的扩增反应，在凝胶上产生适宜大小的适于分离的片段，不同的内切酶组合及选择性碱基的数目和种类可灵活调整片段的数目，从而产生不同的AFLP指纹 酶切片段要经过连续2次PCR 扩增，通过这样两步扩增反应使产生的扩增结果更清楚、重复性更好 第1次PCR 扩增被称为预扩增反应(Pre-amplificati