（环境工程专业论文）sbr中微量重金属对微生物代谢产物与生物多样性的影响.pdf

摘要 随着我国对工业行业含重金属废水的排放要求的不断提高，工业废水的集中 收集与综合处理成为趋势，利用生化处理技术处理含重金属废水越来越受到人们 的重视。重金属离子污染毒性强，可以直接影响微生物活性，导致活性微生物大 量死亡，对活性污泥处理法具有不可逆的破坏性。研究选择c u 2 + 和n i 2 + 作为对象， 探究序批式反应器( s e q u e n c i n gb a t c hr e a c t o r ，s b r ) 中加入不同浓度的微量c u 2 + 和n i 2 + 后，微生物代谢产物、活性污泥性状和生物多样性的变化。 胞外聚合物( e x t r a c e l l u l a rp o l y m e r i cs u b s t a n c e s ，e p s ) 浓度在反应初期对c u 2 + 的冲击反应剧烈，中后期产生适应性，e p s 浓度小幅度稳定下降。中后期的e p s 稳定区间与加入的c u 2 + 浓度成反比。含n i 2 + 原水对e p s 的影响不及含c u 2 + 原水 强烈。c u 2 + 、n i 2 + 加入反应体系后，不会诱发溶解性微生物产物( s o l u b l em i c r o b i a l p r o d u c t ，s m p ) 含量的增加，反而会造成短期内的下降。s m p 对c u 2 + 的耐受作用 在反应前期较为明显，但不能长时间维持，常在中后期产生波动。含n i 2 + 原水对 s m p 影响具有持续性。含n i 2 + 原水对s m p 的影响总体处于小范围区间，而含 c u 2 + 原水会对s m p 含量造成巨大波动。 c u 2 + 投加后会立即增强活性污泥的沉降性，n i 2 + 增强活性污泥沉降性的作用 并不明显。l m g l 2 m g l 是c u 2 + 絮凝效果由弱增强的变化区间。l m g l 至5 m g l 浓度区间加入n i 2 + 后s v i 值会有所降低，浓度升高，降幅逐渐减小。3 5 m g l 、 5 m g l 含c u 2 + 原水末期会严重破坏活性污泥c o d 去除功能。l m g l 至5 m g l 浓 度区间内含n i 2 + 的原水对出水c o d 影响很小，去除率可以保持在8 5 以上。微 生物代谢产物对c u 2 + 的吸附螯合作用不会随进水浓度单调变化。进水c u 2 + 浓度 在3 5 m g l 时活性污泥的吸附效率最高。l m g l 至5 m l 浓度区间内活性污泥对 n i 2 + 有部分吸附螯合作用，但吸附螯合率远小于c u 2 + 。 不同的原水c u 2 + 浓度条件将导致特定菌群的消亡。c u 2 + 的加入会促进某些耐 受力强的微生物的生长增殖，甚至成为优势菌群。含c u 2 + 原水的加入会使微生物 种群丰富性降低。细菌含量随n i 2 + 原水浓度变化较为复杂，难以用简单的比例关 系概括。含n i 2 + 原水对总细菌相似性的影响大于c u 2 + 。投加含n i 2 + 原水会对微生 物种群丰富性产生抑制，s d i 值随着含n i 2 + 原水浓度的升高而增大。 关；哇词：序批式反应器胞外聚合物溶解性微生物产物生物多样性 重金属离子螯合吸附 a b s t r a c t a st h ee m i s s i o n sr e q u i r e m e n t so fi n d u s t r i a lw a s t e w a t e rc o n t a i n i n gh e a v ym e t a l s c o n t i n u et oi n c r e a s ei nc h i n a ，c o l l e c t i o no fi n d u s t r i a lw a s t e w a t e ra n di n t e g r a t e d t r e a t m e n th a sb e c o m eat r e n d m o r ea n dm o r ea t t e n t i o nh a sb e e np a i dt ob i o l o g i c a l t r e a t m e n tt e c h n o l o g i e so fw a s t e w a t e rc o n t a i n i n g h e a v ym e t a l s h e a v ym e t a l s p o l l u t i o nh a sas t r o n gr e p r e s e n t a t i o no fh e a v yt o x i c i t ya n dc a nd i r e c t l ya f f e c tn o r m a l m i c r o b i a la c t i v i t y ，r e s u l ti nt h ed e a t ho fal a r g en u m b e ro fa c t i v em i c r o b i a l t h ee f f e c t o na c t i v a t e ds l u d g ei sd e s t r u c t i v ea n di r r e v e r s i b l e i nt h i sr e s e a r c hw ec h o o s ea r e p r e s e n t a t i v es t u d yo fc u 2 + a n dn i 什a so b j e c t s ，f o c u so nt h es e q u e n c i n gb a t c h r e a c t o r ( s b r ) w i t hd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n s o ft r a c ec u 2 + a n dn i 什，o b s e r v eh o w m i c r o b i a lm e t a b o l i t e s ，a c t i v a t e ds l u d g ec h a r a c t e r i s t i c sa n db i o d i v e r s i t yc h a n g e s e x t r a c e l l u l a rp o l y m e r i cs u b s t a n c e s ( e p s ) c o n c e n t r a t i o ni nt h er e a c t i o nw i t hc u 肿 s e v e r e l yi m p u l s ei nt h eb e g i n n i n g ，t h e nr e s u l ti n t h el a t e a d a p t a t i o n e p ss t e a d i l y d e c l i n ei nt h ec o n c e n t r a t i o no fs m a l lm a g n i t u d e s t a b l er a n g eo ft h ee p si nt h el a t t e r p e r i o dh a si n v e r s e l yp r o p o r t i o n a lt ot h ec o n c e n t r a t i o no fa d d e dc u 2 + n i 2 + c o n t a i n e d r a ww a t e ri sf a rl e s ss t r o n g l yt h a nt h ei m p a c tc a u s e db yc u 计o ne p s d o s i n go fc u 肘， n i 2 + t ot h er e a c t i o ns y s t e mw i l lc a u s ead e c l i n ei ns h o r tt e r m ，d on o ti n d u c er e d u c t i o n o fs o l u b l em i c r o b i a lp r o d u c t ( s m p ) t o l e r a n c eo fs m pf o rc u 2 + i nt h ee a r l yr e a c t i o ni s m o r eo b v i o u s ，b u tn o tl o n gm a i n t a i n e d ，o f t e nf l u c t u a t ei nt h el a t e rr e a c t i o n t h e i m p a c to ns m p c a u s e db yn i 2 + c o n t a i n e dr a ww a t e ri ss u s t a i n a b l e t h ee f f e c to ns m p c a u s e db vn i 2 + c o n t a i n e dr a ww a t e ri sw i t h i nas m a l lr a n g e ，b u tc u 2 + c o n t a i n e dr a w w a t e rc a u s el a r g ef l u c t u a t i o n s c u ”e n h a n c e sa c t i v a t e ds l u d g es e t t l i n gi m m e d i a t e l ya f t e rd o s i n g ，b u tt h ee f f e c t n i 2 + e n h a n c i n ga c t i v a t e ds l u d g es e t t l i n g i sn o to b v i o u s f l o c c u l a t i o ne f f e c ti s e n h a n c e db yaw e a kv a r i a t i o nr a n g ew h e nt h e c o n c e n t r a t i o no f c u 2 + i sb e t w e e nlm g l t o2 m g l t h en i 2 + c o n c e n t r a t i o nb e t w e e nlm g lt o5 m g lm a yr e d u c es v i ，a n dt h e d e c l i n er a n g ed e c r e a s ew i t he n h a n c e dc o n c e n t r a t i o n 3 5 m g l 5 m g lc u 计c o n t a i n e d r a ww a t e rs e r i o u s l yd a m a g et h ef u n c t i o no ft h ec o dr e m o v a la tt h ee n d n i 计 c o n t a i n e dr a ww a t e rw h o s ec o n c e n 仃a t i o ni sb e t w e e nim g lt o5 m g lh a v el i t t l e e f f e c to nt h ee f f l u e n tc o da n dr e m o v a lr a t ec a nb eb a s i c a l l ym a i n t a i n e da t8 5 m i c r o b i a lm e t a b o l i t e sa d s o r p t i o no fc u ”i nr a ww a t e ri sn o tm o n o t o n i c w h e nt h e i n f l u e n tc o n c e n t r a t i o no fc u 2 + i s3 5 m g l ，i ti st h eh i g h e s ta d s o r p t i o n e f f i c i e n c yo f a c t i v a t e ds l u d g e w h e nt h ec o n c e n t r a t i o no fn i 2 + i sb e t w e e nlm g lt o 5 m g l ，n i 2 + c a nb ep a r t l yc h e l a t e db ya c t i v a t e ds l u d g e ，f a rl e s st h a nt h er a t e o fa d s o r p t i o no f c h e l a t e dc u “ r a ww a t e rw i t hd i f f e r e n tc u 2 + c o n c e n t r a t i o nc o n d i t i o n sm a y r e s u l ti nt h ed e m i s e o fp a r t i c u l a rb a c t e r i ai na c t i v a t e ds l u d g e a d d i t i o no fc u 2 + a d d t o x i ce f f e c t s ，a n da l s o p r o m o t et h eg r o w t ha n dp r o l i f e r a t i o no fs o m es p e c i a lm i c r o o r g a n i s m s ，e v e nm a k e t h e mb e c o m et h ed o m i n a n tf l o r a r a ww a t e rw i t ha d d e dc u 2 + w i l lr e d u c et h e r i c h n e s s o fm i c r o b i a lp o p u l a t i o n s ，b u tt h ev a r i a t i o ni sm o r e c o m p l i c a t e d t h ed i v e r s i f i c a t i o no f b a c t e r i aw i t hn i 2 + c o n t a i n e dr a ww a t e ri sm o r ec o m p l i c a t e d ，d i f f i c u l tt os u m m a r j z e w i t has i m p l ep r o p o r t i o n a lr e l a t i o n s h i p t h ee f f e c to nb a c t e r i as i m i l a r i t yi n t h en i 2 + c o n t a i n e dr a ww a t e ri sm u c hm o r eg r e a t e rt h a nc u 2 + d o s i n go fn i 2 + c o n t a i n e dr a w w a t e rc a np r o d u c ei n h i b i t i o no fm i c r o b i a l p o p u l a t i o n si nr i c h n e s s ，s d ii n c r e a s ew i t i l t h ei n c r e a s i n gn i 2 + c o n c e n t r a t i o n k e y w o r d s ：s e q u e n c i n gb a t c hr e a c t o r ，e x t r a c e l l u l a rp o l y m e r i cs u b s t a n c e s s o l u b l em i c r o b i a l p r o d u c t ，b i o d i v e r s i t y ，h e a v ym e t a li o n s ， c h e l a t ea d s o r p t i o n 第一章绪论 1 1 课题研究的背景及意义 第一章绪论 随着全球污染状况的不断加剧，人们对于环境保护的关注程度空前强烈。如 何将人类各项生产生活活动所产生的废水妥善而高效的处置，已经成为当今环保 领域的热点问题。现今污水处理技术领域中，应用最为广泛的技术是活性污泥法。 活性污泥法开创至今，几十年的发展历程中，研究者们对其生物反应和净化机理 进行了诸多研究探索，活性污泥法在生物学、反应动力学的理论方面，净化处理 工艺方面都取得了长足进步，多种反应器与工艺流程相继出现，技术手段与处理 设备日臻成熟，能够适应多种废水的处理需要。因此，当前活性污泥法已成为生 活污水、城市污水的主体处理技术1 1 | 。 为保证活性污泥处理工艺的良好运行，反应系统内的运行参数和技术指标必 须满足一定的要求。能够影响微生物生理活动的因素较多，主要有：营养基质种 类、反应温度、污泥停留时间、反应器各部分溶解氧含量、p h 值和有毒物质等。 其中，有毒物质是指对微生物生理活动产生破坏或具有抑制作用的无机及有机物 质，主要包括酚类、氰化物和重金属离子等。我国现阶段工业发展迅猛，冶金、 炼焦、电镀、化工、造纸等行业生产过程中均会产生大量含重金属废水，对水环 境及土壤环境造成潜在威胁。此外，重金属离子污染具有很强的代表性，重金属 毒性强，可以直接影响微生物活性，导致活性微生物大量死亡，对活性污泥处理 法具有不可逆的破坏性。 由于重金属危害性极大，我国对于各个工业行业含重金属废水的排放标准日 趋严格，工业废水的集中收集与综合处理将成为一种趋势，原本多用于生活污水 处理的活性污泥法工艺将作为处理系统的一个重要环节，越来越多的应用于工业 废水处理。有毒重金属离子会对生化处理产生何种程度影响的研究就变得十分必 要。 微生物代谢产物主要分为胞外聚合物和溶解性微生物产物两类。胞外聚合物 的成分有微生物细胞分泌的粘液、荚膜、微生物的排泄物、代谢和水解产物、以 及吸附的废水中的有机物等。溶解性微生物产物是微生物在生长代谢过程中产生 的中间代谢产物，此外还有部分消亡过程中产生的细胞产物和细胞碎片。微生物 代谢产物会对处理反应产生多方面影响。胞外聚合物覆盖于细菌细胞壁外，由于 其位置原因，其成分及数量会影响污泥的吸附性、生物絮凝性、沉降性能及脱水 第一章绪论 性能等特性，对活性污泥具有重要影响 2 4 1 。而溶解性微生物产物会影响污泥活 性，大量的溶解性微生物产物将抑制微生物生长，严重时甚至产生毒性。胞外聚 合物和溶解性微生物的共同作用下，会造成反应器中有机污染物浓度增加，引起 污泥混合液特性恶化，加速膜反应器的膜污染。此外，胞外聚合物和溶解性微生 物产物对重金属离子有吸附及螯合作用，少量重金属离子可以被吸附固定。但国 内外研究大多只有相关定性分析，定量研究较少。由于微生物系统中复杂的物质 交流，使得微生物代谢产物在系统中自由流动，并受到所有微生物群落的共同影 响【_ 7 1 。反应器中出现微量重金属离子时，微生物代谢产物的含量也势必会产生变 化。因此，研究不同种类重金属离子对微生物代谢产物含量的影响，探究其随时 间变化的规律，进一步探索活性污泥对重金属离子的吸附螯合性具有重要的理论 与现实意义。 当活性污泥中重金属含量超限后，有些特定微生物菌群会大量消亡，而其他 一些耐受性较强的菌种可能继续存活，这种现象体现出重金属对微生物的选择 性。结合聚合酶链式反应一变性梯度凝胶电泳( p c r 。d g g e ) 技术，对重金属影响 下污泥微生物群落结构的变化演替展开研究，探究特定重金属离子可能对处理工 艺某个环节造成的功能性抑制，为生化法处理含有微量重金属废水提供一定的理 论依据。 1 2 微生物代谢产物的研究进展 1 2 1 胞外聚合物 1 2 1 1 胞外聚合物的定义 胞外聚合物( e x t r a c e l l u l a rp o l y m e r i cs u b s t a n c e s ，e p s ) 是一种微生物在污水处 理过程中会正常产生的代谢产物，是一种由多种成分组成的高分子聚合物，不会 溶解于水中，一般紧密附着在细胞壁上，可以形成保护层，预防细胞免遭恶劣环 境影响，并且可以在细胞的饥饿期间为细胞提供部分碳源和能源1 8 j 。通常认为 e p s 的来源有两种：其一是活性污泥在代谢环境基质时产生的，这类e p s 的数 量和组成受环境中所存在的物质种类的影响；其二由细胞本身的新陈代谢和溶胞 自溶产生【9 1 。e p s 具有粘性，可形成具有三维结构的、高度水化的絮凝体基质， 通常带有电性，并且可以把微生物包裹其中，形成活性污泥生物絮凝体【1 0 j 。 第一章绪论 1 2 1 2 胞外聚合物的组成与结构 胞外聚合物的组成受外界多种因素的影响，影响因素包括如细胞新陈代谢的 分泌物、细胞表面的脱落物、细胞裂解自溶释放的物质，以及从外界环境中吸附 的物质等【1 1 | 。e p s 的成分主要有多糖、蛋白质、腐殖酸、核酸，其中蛋白质和多 糖是主要成分，占主导地位，二者含量约占总量的7 0 n o - - - 9 0 2 1 。 从结构上区分，e p s 可分为两种类型 1 2 , 1 3 ：一种是紧密粘附着在细胞壁上的 胞囊聚合物( t i g h t l y b o u n de p s ，t b ) ；另一种是以胶体或溶解态松散存在于周 围环境中的黏性聚合物( l o o s e l yb o u n de p s ，l b ) 。t b 位于细胞体表面，与细 胞壁结合牢固，主要起物质与能量交换的作用，对活性污泥絮体性质影响较小； l b 松散存在于t b 外层，密度较小，可以向周围中环境扩散，具有流变性。e p s 是生物絮凝体的重要成分之一，生物絮体中e p s 质量占8 0 左右【1 4 1 ，e p s 占活 性污泥中总有机物的比例可以达到5 0 。9 0 【l o 】。 1 2 1 3 胞外聚合物的性质 e p s 从周边环境中吸取微生物代谢所需的营养，并形成保护屏障，抵抗苛刻 的外界环境，为微生物提供最基本的生长条件。 e p s 能够影响污泥的絮凝性能、沉降性能、脱水性能以及对重金属的吸附性 能【4 1 5 l6 | 。e p s 普遍带负电荷，具有凝胶状基质，能较长时间粘连微生物，帮助 微生物形成稳定的菌落。e p s 的，相对分子质量分布很广，一般在几千到几百万 之间。e p s 的分子结构中还带有官能团，例如氨基、硫酸根、磷酸根、羧基等。 由于带负电官能团较多而正电官能团较少，造成活性污泥表面整体电性大多为负 值，其数值一般居于0 2 0 6 m e qg - i m l s s 之间。e p s 还具有吸附重金属、非金 属和大分子物质的功能，可以与许多金属离子螯合生成单价、双价、多价阳离子 结合，生成复合物。 e p s 可能会抑制污泥沉降，使活性污泥脱水性变差。研究者普遍认为，e p s 通过对污泥表面电荷的影响改变来抑制污泥沉降。蔡春光等【1 7 j 研究表明，e p s 中蛋白质与多糖的比值与污泥的疏水性成正比，与污泥的表面所带负电荷成反 比。也有研究者发现e p s 中l b 对s v i 的影响很大，s v i 随l b 含量的增加而增 大p j 。e p s 会使污泥脱水性能变差，这是由于e p s 中羟基等负电性官能团造成的 1 8 1 。e p s 还可以结合大量的水，能够改变活性污泥的浓缩和过滤性能。此外，有 研究发现e p s 会与二价阳离子共同作用，降低污泥的可消化程度，改变消化后 的脱水性【l9 1 。但也有研究者发现，e p s 含量和污泥脱水性之间没有简单的线性关 系【2 0 1 ，但并未给出明确的理论模型。 e p s 具有可生物降解性，并能够在一定程度上吸附重金属离子。z h 锄g 等【2 l 】 第一章绪论 发现e p s 在某些条件下能够作底物被降解，证明e p s 是可以被微生物降解的。e p s 中的多糖与蛋白质等物质含有多种官能团，如羧基、羟基、磷酰基和硫酸根等， 这些基团有强烈的离子亲和性，可与多种重金属络合。最初发现胞外聚合物对金 属离子的吸附作用是在实际水处理工程中，经过处理后含有重金属的废水中重金 属的含量明显降低【2 2 1 。k u r e k 等【2 3 】发现在细菌生长过程中释放的蛋白质能与溶液 中溶解的c d 2 + 、h g + 、c u 2 + 、z n 2 + 结合，形成不溶性沉淀而被去除，但只有当溶 液中重金属含量较低时效果才较为显著。g u i b a u d 等【2 4 】研究发现几种重金属分别 可以与e p s 络合，其中c u 2 + 与e p s 的结合能力最强。说明污泥絮体与e p s 中存在与 重金属吸附络合的结合位点，活性污泥对重金属的吸附功能主要由e p s 的提供。 1 2 2 溶解性微生物产物 1 2 2 1 溶解性微生物产物定义 溶解性微生物产物( s o l u b l em i c r o b i a lp r o d u c t ，s m p ) 是指活性污泥微生物 在降解污染物时，通过合成代谢损失、细胞裂解、细胞膜扩散、等方式向周围环 境中释放的可溶于水的物质【2 5 】。d u n c a n 等【2 6 】认为s m p 是微生物在降解污染物时 利用基质进行内源呼吸，或者环境发生变化时，为适应环境压力而产生的溶解性 有机物，这种物质能够在不破坏菌体细胞的情况下与微生物分离，微生物的细胞 在失去该物质后仍能存活。当今多数研究者认为s m p 是不易被生物降解的，有 些甚至是难被生物降解的。 n a m k u n g 等【l2 】从生物学角度将s m p 分为两类：第一类是与基质利用相关型 产物( u t i l i z a t i o na s s o c i a t e dp r o d u c t s ，u a p ) ，u a p 与基质代谢及微生物生长有关， 其产生的速率与基质利用速率成正比；第二类是与微生物相关的产物( b i o m a s s a s s o c i a t e dp r o d u c t s ，b a p ) ，b a p 与微生物的内源代谢有关，产生的速率与微生 物的浓度成正比。b a p 是微生物在内源呼吸过程中，伴随细胞解体所释放出的 物质，与微生物的生长增殖无关，仅与细胞的内源呼吸作用相关，如细胞裂解、 细胞衰亡等。b a p 的生成速率与微生物量成正比。因此有研究者得出结论，不 同的底物及不同反应条件下，代谢产生的u a p 与b a p 的比例是不一样的【2 7 】。 1 2 2 2 溶解性微生物产物的组成及来源 s m p 的组成十分复杂，其成分包括腐殖质、多糖、蛋白质、核酸、有机酸、 抗牛素及硫醇等多种物质。其中多糖、蛋白质和腐殖质三种成分是是普遍存在的， 可以认为是主要成分【2 8 2 9 1 。一般情况下，一、二级生物处理系统与深度处理系统 中，蛋白质的含量都高于多糖。对于腐殖质的含量学界存在争议，分析认为这可 能是由于进水水质的差异造成的。 第一章绪论 细胞正常生长增殖和新陈代谢都会产生s m p 。研究者普遍认为，当微生物遭 遇环境变化时，如温度降低、营养物质缺乏、渗透压变化、有毒物质影响等，微 生物都会生成s m p 抵御环境影响。活性污泥法处理过程中，产生s m p 的途径主要 有以下几种【3 0 j ： ( 1 ) 生长过程产生：微生物在正常增殖和代谢时会产生s m p ； ( 2 ) 维持细胞浓度平衡：微生物为达到细胞膜内外浓度平衡会释放s m p ； ( 3 ) 抵抗饥饿环境：微生物在饥饿状态时碳源缺乏，为维持细胞生存必须代 谢细胞内物质以获得能量，这一过程会产生大量的s m p ； ( 4 ) 基质匮乏：如果微生物所需的营养不能满足自身要求时，微生物会产生 s m p 来获得营养物质，保持正常生长代谢； ( 5 ) 冲击负荷影响：向出在饥饿状态下的细菌突然投加大量碳源和能源物质 会诱发细菌的死亡，这一过程会产生s m p ； ( 6 ) 高浓度底物的刺激：高浓度微生物能源物质会刺激s m p 的释放； ( 7 ) 缓解环境压力：微生物在面临如温度变化、渗透压的冲击和毒性物质的 加入等环境压力时，会产生大量s m p 。 由以上原因可看出，微生物的生长、营养物质匮乏和内源代谢是影响s m p 生成的主要因素。 1 2 2 3 溶解性微生物产物的性质 研究者普遍认为s m p 的可降解性较差，某些经过驯化后的活性污泥微生物 可以降解部分s m p 。g a u d y 等p l j 在试验中发现，被认为在序批次和连续反应中 不能被降解的s m p ，9 0 可以在二级处理中被降解。b a k e r 3 2 】等研究发现高分子 量的s m p 在厌氧条件下降解较好，而低分子量的s m p 在好氧条件下更容易被降 解，降解更完全。 s m p 具有毒性，这种毒性甚至可能抑制污泥活性。z h a n g 掣3 4 】的研究认为， s m p 很可能是抑制微生物活性的一个因素。一些研究者认为，生物处理出水中 的s m p 可能比污水中原有的有机污染物质毒性更强【3 引。由于毒性物质的加入会 使得s m p 被大量生成，而s m p 自身又被认为具有毒性，因此有关s m p 的毒性 对自身生成数量的问题仍存争议。张海丰等【3 5 j 研究了不同相对分子质量的s m p 对于污泥活性的影响，发现不同分子量的s m p 对活性污泥的影响有所差异。相 对分子质量大于10 0 0 0 的s m p 和污泥活性成反比，s m p 浓度的增加会造成污泥 活性不断降低。相对分子质量小于1 0 0 0 的s m p 几乎不会对污泥活性造成影响。 但另外有学者 3 4 , 3 6 认为，膜生物反应器中s m p 的积累会抑制微生物活性。 s m p 还能够螯合一定量的重金属离子。s m p 中包含大量螯合官能团，如羧 第一章绪论 酸盐、羟基、氢硫基和氨基等，这些螯合官能团能够与水中的金属元素螯合，使 重金属元素引发的毒性得到抑制。微生物螯合剂对金属的螯合可以减缓毒性，但 同时也影响了细菌对自身所需要的重金属的获取性能。k u o 等【3 7 1 研究发现，s r t 为4 0 d 的厌氧反应器中，当s m p 量达到3 0 0 m g l 时，约有4 4 m g l 的镍被螯合 吸附。黄光副3 8 j 等发现，随着铬离子浓度的升高反应器维持正常运行的时间逐渐 缩短，超过2 m g ，l 时反应器运行难以达到稳态。厌氧微生物对微量金属营养元 素( 如f e 、c o 、n i 等) 有特殊需求，但s m p 的螯合作用，会严重影响这些营养 元素的生物有效度【3 9 】。 1 2 3e p s 和s m p 之间的关系 对于e p s 与s m p 之间的依存与转化关系，学术界一直存在分歧。直至1 1 l a s p i d o u 等1 47 j 提出了一元化理论，弥合了各种不同认识间的分歧。一元化理论阐述了活性 微生物、e p s 、u a p 、b a p 及惰性微生物之间的相互关系，并对各成分之间的转 化方式及转化规律提出假设： ( 1 ) s o l u b l ee p s 与s m p 是同一种物质； ( 2 ) b o u n de p s 可以水解生成s m p 中的b a p ； ( 3 ) u a p 在基质利用过程中被生成，生成速率与基质利用速率相关； ( 4 ) b o u n de p s 在基质利用过程中被生成，生成速率与基质利用速率相关； ( 5 ) 活性微生物由b o u n de p s 和活性细胞组成，部分e p s 可归为惰性微生物； ( 6 ) 死亡的细胞残渣由微生物内源衰减过程产生，是惰性微生物的一部分； ( 7 ) u a p 和b a p 具有一定的可生物降解性，可以被当作电子供体循环利用。 针对一元化理论存在的不足，有研究者对其进行了补充。a u q i n o 等 4 8 认为除 了b o u n de p s 可以生成b a p 之外，微生物的细胞衰减消亡也会释放相对分子质量 较高的s m p 。 1 3p c r - d g g e 技术在环境微生物多样性领域的应用 1 3 1p c r d g g e 技术的引入 活性微生物水处理技术中的多种宏观指标，如污水处理净化效率、活性污泥 沉降性、污泥增值速度等，均与微生物群落的微观特性与种群结构息息相关。只 有了解微生物群落相似性、多样性和种群归属性等信息，才能从本质上提高对处 理系统的控制能力。而国内外对于污水处理过程中微生物群落的作用和生态学特 性的研究并不是十分重视。因此，对反应器内活性污泥中微生物种群结构和多样 第一章绪论 性进行研究，可以从微观角度上找出影响微生物结构与功能的主要因素及其变化 规律，为改善活性微生物水处理法效率提供依据和指导。 借助分子生态学的理论和技术，研究微生物物种的种群组成、结构及其演替 规律，一方面可以避免传统微生物学方法在研究微生物群落结构方面的局限性， 另一方面可以从微观角度对微生物多样性、种群演替变化及其与环境之间的关系 入手，系统全面地认识多样性差别，指导实际处理工艺f 4 2 1 。 p c r d o g e 技术在水处理领域的应用可以追溯至1 9 9 3 年。m u y z e r 与同事将 d o g e 技术用于寻找基因组d n a 中的特异分子标记，使用包含线性梯度变化的 聚丙烯酰胺凝胶将其分离。试验的成功标志着p c r d o g e 技术正式应用于水处 理领域1 43 | 。p c r d o g e 技术可以提高菌株区分度，避免对多个无明显遗传差别 的菌株进行重复繁琐的表观特征研究，可以有效地应用于分析确定自然环境中微 生物群体的遗传多样性和微生物菌株的筛选。 1 3 2p c r - d g g e 技术的基本原理与方法 1 3 2 1p c r 扩增技术 聚合酶链式反应( p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ，p c r ) 扩增技术是一种通过体外 扩增核酸序列得到多个核酸复制拷贝的技术【4 3 】，是分子生物学中最成熟、最普及 的技术之一，被广泛应用于生物学研究的各个领域，是目前微生物生态学研究中 最常用的技术。p c r 扩增技术的原理主要基于以下3 条法则：双链d n a 的复制特 点：碱基互补配对原则；d n a 聚合酶的反应特性及耐高温聚合酶的应用。 p c r 扩增技术根据时间和温度等不同反应条件，可以有不同的操作条件。一 般都包括变性一退火一延伸三个步骤： ( 1 ) 模板d n a 的变性：将模板d n a 力i ：i 热至9 5 左右一定时间后，模板d n a 双链或经p c r 扩增形成的双链d n a 解旋，两条d n a 链分离，生成单链d n a ； ( 2 ) 模板d n a 与引物的退火：将反应环境温度降至5 5 左右，引物与模板 d n a 单链以互补序列特异性结合； ( 3 ) 引物的延伸：在t a q d n a 聚合酶的作用下，d n a 模板一引物结合物以 d n t p 为反应原料，按照靶序列模板，遵循碱基配原则，合成一条新的半保留复 制链，与模板d n a 链互补。 按照变性一退火一延伸3 个过程循环操作，可以将目的d n a 片段在短时间内 扩增多个数量级，可以为后续分析实验提供充足的样品存量，因此也提高了对 d n a 目标片段研究的可重复性。 第一章绪论 1 3 2 2d g g e 技术 变性梯度凝胶电泳( d e n a t u r i n gg r a d i e n tg e le l e c t r o p h o r e s i s ，d g g e ) 是多态性 分析技术的一种，属于d n a 指纹技术。d g g e 技术的原理是利用p c r 技术扩增微 生物自然群体中的特定片段1 6 sr d n a 基因，生成长度相同但碱基序列不同的 d n a 片段混合物，然后利用d g g e 的技术特点，将不同碱基序列的d n a 片段分离， 形成指纹图谱，为后续研究提供支持。 d g g e 凝胶采用的是聚丙烯酰胺胶，其具有化学变性剂梯度。变形剂的浓度 按照从上到下、从低到高排列成线性梯度。长度相同而碱基序列不同的d n a 片 段进行变性梯度凝胶电泳时，由于双链的解旋为单链需要不同的变性剂浓度，碱 基序列不同的d n a 片段只有在各自相应的变性剂浓度作用下才能发生变性，空 间构型产生变化。 反应过程如下：电泳开始阶段双链d n a 共同向正极移动，随着途径变性剂 浓度的不断增大，d n a 序列中低g + c 含量的碱基序列被打开，而高g + c 含量的部 分序列仍保持双链结构。d n a 双链解链之后，d n a 分子会形成不同的结构，端 部变为叉状或中间变为圆环状。由于空间结构变化造成阻力增加，使其在聚丙烯 酰胺凝胶中的电泳速度急剧下降，与未解链的部分分离，最终结果表现为停留在 不同变性剂浓度梯度的位置上。经染色后可以在凝胶板上观察到彼此分离的条带 图，从而达到分离具有相同长度但碱基序列不同的d n a 分子的目的。d g g e 技术 可以用于检测单一碱基的变化和多样性，也可以分析经p c r 扩增后的d n a 片段的 多态性。 活性污泥微生物样品经过预处理之后，直接提取样品中的总d n a 。1 6 sr d n a 可变区具有明显的区分性，因此对其进行p c r 扩增，使目标片段的数量达到可 以保存和多次分析的水平。扩增后的p c r 产物含有多种细菌1 6 sr d n a 可变区 片段的混合物，通过变形梯度凝胶电泳，总细菌d n a 各种不同片段得以分离， 并以条带形式直观表现。如若想进一步确定分离开的各类菌种的种类，可以对 d g g e 指纹图谱上的某些条带切胶回收，回收的片段需要再经过p c r 扩增，确 保数量达到基因序列测定要求。d n a 片段序列完成后，可将测序结果输入n c b i 序列基因库进行比对，可以初步确定优势菌种的种属。 所有步骤当中样品的提取和纯化是最关键的。提取的污泥样品中含有非常多 样的成分，尤其是提取土壤中d n a 时，土壤中的某些多酚类物质很难被除去， 直接影响后续p c r 扩增和d g g e 分析效果。p c r 扩增目的d n a 片段过程中， d n a 聚合酶的纯度和保真性会对d g g e 条带数目产生关键的影响。因此，要使 d g g e 技术分析结果清晰准确，对d n a 片段达到良好的分离效果，必须注意以 上所述关键环节。 第一章绪论 1 3 3p c r - d g g e 技术在环境微生物多样性领域的进展 p c r - d g g e 技术作为指纹分析技术的一种，成功克服了传统培养技术的局 限性。这种方法不但避免了繁琐的菌种分离过程，还可以鉴定出传统方法难以分 离的菌种，并能够对含有特定d n a 片段的条带进行回收测序，分析其所属的种 类。水污染控制领域，许多国外研究者利用d g g e 技术进行传统活性污泥、膜 反应器等微生物处理系统中的菌群多样性检测、相似性分析以及种群演替等方面 的研究。现如今国内的研究者们也开始大量运用p c r d g g e 技术进行微生物方 面研究，利用p c r - d g g e 技术分离鉴别菌种、研究生物演替规律已成为国内水 处理微生物领域研究的热点。 1 3 3 1 国外方面的研究进展 最初p c r - d g g e 技术是由外国研究者发明，因此国外已有多年使用经验， 研究成果众多。 l a p a r a 等【删研究升高温度对废水好氧生物处理过程中细菌群落结构和功能 的影响时运用到了d g g e 技术，结果表明不同温度条件下培养，细菌群落也会 存在差异。有研究者将d g g e 技术应用于研究处理制药废水的生物好氧反应器 中细菌群落的稳定性【4 5 1 ，发现运行条件稳定的废水处理生物反应器中，微生物群 落结构无明显变化，总体稳定。 o n u k i 等【4 6 】研究在以乙酸为独有碳源的s b r 系统中的生物除磷效果，运用 p c r d g g e 技术分析微生物群落。研究发现在除磷富集阶段，d g g e 指纹图谱 的条带数量下降，微生物种群结构多样性减弱。 r o w a n 等【47 】运用p c r - d g g e 技术考察生物滴滤反应器和生物滤池处理同种 废水时，氨氧化细菌菌群的组成。研究证明不同形式反应器中的氨氧化细菌菌群 组成不同，同一反应器不同位置的氨氧化细菌茵群组成也不相同，但主要种群是 不会改变，这些种群在整个处理过程中发挥着关键的作用。 z h a n g 掣4 8 】对o l a n d 系统中，亚硝化步骤中a o b 菌的数量和群落结构变 化进行研究。研究发现，a o b 菌的群落组成会随着溶解氧的降低发生剧烈变化。 在由氧限制的硝化步骤中，d o 值的降低将造成a o b 菌的明显变化。 r e n o u f 等【4 9 】利用p c r d g g e 技术监测乳酸菌酿造过程中的细菌群落动态变 化。研究发现根据特异性引物p c r 扩增的r p o b 基因片段不会产生基因异质性问 题，可以用来分析微生物群落的动态演替过程。 f e r r i s 等【5 0 】研究不同温度条件下菌藻系中的生物多样性，发现温度改变后， 样品中生物多样性受到很大影响。 m i u r a 掣5 1 】运用p c r - d g g e 技术对比分析市政污水的活性污泥法、传统膜 第一章绪论 生物反应器和结合预絮凝沉淀工艺的复合膜生物反应器中微生物群落结构的异 同。研究发现活性污泥法与传统膜生物反应器中的生物群落结构更为相似，不同 成分的进水对生物群落结构有很大的改变。即使反应器的处理效果一直稳定，不