（农产品加工及贮藏工程专业论文）山楂原料中前花青素的分析方法及其稳定性研究.pdf

摘要 山楂是一种重要的前花青素( p r o e y a n i d i n ，简称p c ) 的潜在资源。针对目前有 关山楂前花青素的研究现状，本文开发了两种用于评价山楂原料、提取物及其制 品中前花青素含量的分析方法，并采用这两种方法对山楂原料中前花青素的稳定 性进行了评价和研究。 分光光度法采用钼酸铵为显色剂，以表儿茶素为对照，在4 0 0n n l 测定样品 中总前花青素的含量，按分析步骤操作，样品溶液中前花青素的浓度在3 0 - 1 7 0 l _ t g m l 范围与吸光度呈良好的线性相关性，相关系数r = o 9 9 9 9 。在7 0 8 4p g m l 的加标水平下，平均回收率为1 0 5 5 ，重复分析操作( 5 次) 测定结果的相对标 准偏差r s d = 0 3 4 ，方法的最低检出限为2 1o g m l 。 采用国产高效液相色谱仪建立了一种快速分析山楂主要活性成分的等度高效 液相色谱( h p l c ) 法。色谱柱：使用h y p e r s i l b d s c j g 分析柱( 4 6 i t l l n i d 2 5 0 m m ，5 m ) ；温度：室温；流动相：甲醇乙腈水= 2 1 2 7 7 ，含5 0 0 l 儿的甲 酸，流速：0 8m l m i n ：紫外检测器波长：2 8 0n l n ；进样量：1 0l a l 。对山植原料中 的主要活性成分表儿茶素、前花青素b 2 ，前花青素c l 以及绿原酸等成分进行了 分离和检测，各成分间有良好的分离，分析时间在2 0 m i n 以内，采用外标峰面积 法定量，重复分析几种成分的相对标准偏差在0 3 6 1 5 2 之间，最低检出限为 0 1 4 4 o 3 0 9n g ，线性范围在o 0 1 1 0 0k t g ，回归方程的相关系数t 在0 9 9 9 8 - 0 9 9 9 9 之问。这两种方法均具有操作简便、快速准确的优点。钼酸铵分光光度法适用于 对样品中前花青素总含量的分析和评价，h p l c 法适合于对各主要成分含量进行 分析和监控。两种方法相互补充，可作为对山楂原料、提取物以及药物制剂中的 前花青素进行质量控制及检测的分析手段。 采用分光光度法和h p l c 法对山楂( c r a t a e g u s p i n n a t i f i d ab g e v a t m a j o r n e b r ) 鲜果、山楂粉、山楂片中前花青素的含量进行了分析，结果表明干制品中总 前花青素的表观含量为鲜果中的4 5 倍，但几种主要活性成分的含量只相当于鲜 果的2 倍左右，表明干制过程造成了低聚前花青素( o p c ) 的可观损失。 对2 1 种存放条件下果实中前花青素的稳定性进行了研究，结果表明，在贮存 过程中几种主要成分以及前花青素总含量的变化符合一级化学反应的动力学模 型。贮存温度对前花青素的降解反应有重要影响，6 0 条件下，山楂片、山楂粉 在密闭与敞口存放下各种成分的半衰期( t l ，2 ) 只有l 9 天，在室温( 2 0 。c ) 条件 下，这些成分的t i ，2 分别在7 5 1 0 0 3 天之间。前花青素总含量的分析结果可以反 应这一趋势，在2 0 ，3 0 ，4 0 ，5 0 ，6 0 下敞口存放的山楂片中，前花青素总量的 t l ，2 分别为4 3 0 ，2 7 4 ，1 8 8 ，9 7 ，3 7 天，说明室温干燥条件是山楂原料进行长期 保存的可选方式之一。实验进行了山楂片与山楂粉、密闭与敞口存放的对比，综 合分析结果表明，本次实验中这些因素之间没有表现明显的差异。低温( 0 c ) 鲜 果贮存试验的结果表明，经1 5 9 天的存放，果实中的低聚前花青素和总前花青素 的含量变化不大，好果率等指标也均符合正常标准，这表明低温贮存是解决原料 中短期贮存和供应的可选方案之一。 关键词：山楂；前花青素；分光光度法；高效液相色谱法；贮藏；稳定性 m e t h o d sf o r a n a l y s i so f p r o e y a n i d i n si nh a w t h o r na n ds t u d i e so nt h e i rs t a b i l i t y a u t h o r ：w ul i x i a a d v i s o r ：c u it o n g m a j o r ：a 鲥- p r o d u c tp r o c e s s i n ga n ds t o r a g ee n g i n e e r i n g a b s t r a c t h a w t h o m ( c r a t a e g u s ) c o n t a i n sal a r g eo fp r o c y a n i d i n ( p c ) a n di sa s o r to f i m p o r t a n tl a t e n tr e s o u r c e a c c o r d i n gt op r e s e n ts t u d i e so np co fh a w t h o r n ，t h ep a p e r e s t a b l i s h e dt w oa n a l y t i cm e t h o d st od e t e r m i n et h ec o n t e n t so fh a w t h o r nm a t e r i a l s ， e x t r a c ta n dp r o d u c t s b yt h et w om e t h o d s t h es t a b i l i t yo fp ci nh a w t h o r n ，a s e v a l u a t e da n ds t u d i e d p h o t o m e t r i ca s s a yw a sd e v e l o p e dt od e t e r m i n et h ec o n t e n t so fp ci ns a m p l e sa t 4 0 0n n la b s o r p t i o nw a v e l e n g t hw i t ha m m o n i u mm o l y b d a t ea sc a t a l y t i ca g e n ta n d e p i c a t e c h i na sr e f e r e n c es t a n d a r d a c c o r d i n gt oa n a l y s i ss t e p ，t h e r ew e r ee x c e l l e n t l i n e a r i t yc o r r e l a t i o nb e t w e e nt h ec o n c e n t r a t i o na n dp e a ka r e a so f f o u rc o m p o n e n t sw i t h r a n g ef r o m3 0t o7 0p g m la n dc o r r e l a t i o nc o e 蝎c i e n t ( r ) w a s0 9 9 9 9 t h ea v e r a g e r e c o v e r yr a t i ow a s1 0 5 5 a t7 0 8 4u g m la d d i n gl e v e l n er s d ( n = 5 ) w a s0 3 4 t h ed e t e c t i o nl i m i tw a s2 1p g m l as u i to fh i 曲p e r f o r m a n c el i q u i d c h r o m a t o g r a p h i c ( h p l c ) m e t h o dw a s e s t a b l i s h e df o ra n a l y z i n gt h em a i na c t i v ec o m p o n e n t so f h a w t h o r nb yh o m e m a d eh i 曲 p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h i ca p p a r a t u s c o l u m n ：h y p e r s i lb d sc 1 8 ( 4 6h u ni d 2 5 0m m ，5p r o ) ；t e m p e r a t u r e ：2 0 ；m o b i l ep h a s e ：m e t h a n o l a c e t o n i t r i l e w a t e r = 2 1 2 7 7 i n c l u d i n g5 0 0p g m lf o r m i ca c i d ；f l o w ：0 8m l m i n ；d e t e c t i o n ：u va t 2 8 0r i m ；i n j e c t i o nq u a n t i t y ：1 0 l b yt h em e t h o d ，t h em a i na c t i v ec o m p o n e n t si n h a w t h o m ，e p i c a t e c h i n ，p r o c y a n i d i nb 2 ，p r o c y a n i d i nc i ，c h l o r o g e n i ea c i d ，w e r e s e p a r a t e da n dd e t e r m i n e dw e l li n2 0m i n u t e s t h ee x t e r n a ls t a n d a r dc a l i b r a t i o nc u , r c e s w e r eu s e di nq u a n t i f i c a t i o n r s do fs e v e r a lc o m p o n e n t sw e r eo 3 6 1 5 2 n e d e t e c t i o nl i m i tw a so 1 4 4n g - q ) 3 0 9n g t h el i n e a r i t yr a n gw a s0 0 1 - 1 0 0p g m l t h e c o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n t ( r ) w a so 9 9 9 8 一一0 9 9 9 9 b o t hm e t h o d sw e r es i m p l e ，r a p i da n d p r e c i s e a m m o n i u mm o l y b d a t ep h o t o m e t r i ca s s a ys u i t se s t i m a t i o no ft h et o t a lp c c o n t e n t si nh a w t h o r na n dh p l ce n a b l e sq u a n t i f i c a t i o no fs i n g l ep ci nh a w t h o r n t h e b o t hm e t h o d sc o m p l e m e n te a c ho t h e ra n dc o u l db e u s e df o rq u a l i t yc o n t r o la n d d e t e r m i n a t i o no f p ci nh a w t h o r nm a t e r i a l s ，e x t r a c t sa n d p r e p a r a t i o n s t h ep cc o n t e n t si nh a w t h o r nf r u i t s p o w d e r sa n ds l i c e sw e r eo b t a i n e du s i n g p h o t o m e t r i ca s s a ya n dh p l c ，w h i c hi n d i c a t e dt h a tt h et o t a lc o n t e n t so fp ci nd r y p r o d u c t sw e r e4 - - 5t i m e sa sm u c ha st h a ti nh a w t h o r nf r u i t sa n ds e v e r a lm a i na c t i v e c o m p o n e n t sc o n t e n t so n l yw e r e2t i m e s a sar e s u l t ，t h ed r yp r o c e s sr e s u l t si nal a r g eo f l o s so fo l i g o m e r i cp r o c y a n i d i ni nh a w t h o r n t h es t a b i l i t ys t u d yo fp co f t2 1s t o r a g ec o n d i t i o n si n d i c a t e dt h ec o n t e n t s c h a n g e o ft h et o t a lp ca n ds e v e r a lm a i nc o m p o n e n t sc o n f o r mt ot h el a wo ff i r s to r d e rr e a c t i o n o f c h e m i c a lk i n e t i c s s t o r a g et e m p e r a t u r eh a d i m p o r t a n te f f e c to nd e c o m p o s i t i o no f p c a t6 0 h a i fl i f e ( t l ，2 ) o fe v e r yc o m p o n e n t si nd r yh a w t h o r np o w d e r sa n ds l i c e so n l y w e r e1 9d a y so ns e a l e da n do p e ns t o r a g ec o n d i t i o n sa n da tr o o mt e m p e r a t u r e ( 2 0 c ) t mw o s7 5 - 1 0 0 3d a y s f r o mt h et o t a lp cc o n t e n t s c h a n g e t h e r ew a st h es a l l l et r e n d t v 2o f t h et o t a lp ci nd r yh a w t h o r ns l i c e sw e r e4 3 0 ，2 7 4 ，18 8 ，9 7 ，3 7d a y sr e s p e c t i v e l y r o o mt e m p e r a t u r ea n dd r yc o n d i t i o n si sp r o v e dt ob eo n eo fc h o i c em e t h o d so nl o n g s t o r a g eh a w t h o r nm a t e r i a l s b yc o n t r a s t i n ge x p e r i m e n tb e t w e e nh a w t h o r np o w d e r s a n dh a w t h o r ns l i c e sa n db e t w e e ns e a l e ds t o r a g ea n do p e ns t o r a g e ，t h er e s u l ts h o w e d t h e r ew a sn o td i s t i n c td i v e r s i t y h a w t h o r nf r u i t sa to cs h o w e dt h et o t a lp ca n do p c c o n t e n t sh a dn o to b v i o u sc h a n g ea n dt h ee v a l u a t i v es t a n d a r d s ，s u c ha sg o o df r u i t s p e r c e n t a g ea n ds oo n ，a c c o r d e dn o r m a lr a n g ei n 1 5 9d a y s t h e r e f o r e ，t h el o w t e m p e r a t u r es t o r a g ei so n eo fc h o i c ef a s h i o no ns o l v i n gm i d d l ea n ds h o r t - t e r ms t o r a g e a n d s u p p l yo f h a w t h o mm a t e r i a l s k e yw o r d s ：h a w t h o r n ；p r o c y a n i d i n s ；p h o t o m e t r i ca s s a y ；h p l c ；s t o r a g e ；s t a b i l i t y 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得塑j 垦壅些太鲎或其他 教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：关天i 霞 签字日期：刀口f 年占月2 ；日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解塑些壅些盘茎有关保留、使用学位论文的规 定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查 阅和借阅。本人授权塑韭壅些盘茎可以将学位论文的全部或部分内容编入有关 数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：关南l 霭 签字日期：劲口r 年# 月2 ；日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 导师微：传p 签字日期：2 r 婢月巧日 电话： 邮编： 山楂原料中前花青素的分析方法及稳定性研究 1 引 言 山楂，又名红果、山里红等，属山楂属( c r a t a e g u s ) 落叶乔木，种质资源丰 富，在我国有南山楂和北山楂之分，北山楂中的山楂( c r a t a e g u s p i n n a t i f i d a b g e 。) 、 山里红( c r a t a e g u sp i n n a t i f i d ab g e v a t m a j o rn e b r ) 及南山楂中的野山楂 ( c r a t a e g u sc u n e a t as i e b e t z u c c ) 为中国药典规定的山楂原植物【1 1 。我国传统医 学认为，山楂具有“消食积，补脾。“化饮食，消肉积症瘕，痰饮痞满吞酸，滞 血痛胀。化血块，活血”等作用1 2 j 。其中北山楂有消食健胃、行气散瘀之效，南 山楂有收敛止泻之用【3 】，均是重要的消导药物。 近代研究结果表明，山楂中含有丰富的有机酸、多酚类成分、三萜酸、维生 素c 、果胶、糖类、多种微量元素和矿物质，其中钙、铁含量尤为突出，居于各 种水果、蔬菜的前列f 4 j 。2 0 世纪5 0 年代到8 0 年代，欧洲学者对植物药进行了系 统筛选，并将山楂确定为治疗心脏病的首选植物药。进一步的研究结果表明，山 楂( 叶、花) 的标准化提取物具有增加冠脉流量、改善人体的心肌功能【5 “j 、降血 压、降血脂【9 、抗心律失常【2 5 】、镇静、耐缺氧、抗氧化【2 “埘、清除自由基、抗 艾滋病毒( h i v - 1 ) 1 2 9 一o l 、抗癌等多方面重要药理作用( 详见表1 ) 。 近年来的很多临床试验结果( 见表2 ) 均表明，山楂标准化提取物与安慰剂 相比，可明显改善患者的心脏功能，主要表现为：增加最大训练负荷、降低血压、 调节心律等，治疗效果与传统的心脏病药地高辛、磷酸二酯酶抑制剂、a c e 抑制 剂、强心甙等效果相似，而其副作用较地高辛等强心药物小得多，已经得到医药 学专家的肯定评价1 5 6 1 。 8 0 年代以来采用高效液相色谱法( h p l c ) 对山楂活性成分进行的大量分析 和研究，这些结果提示山楂中的代表性活性成分主要是两类植物多酚类物质。一 类是以牡荆素和槲皮素为苷元的黄酮类，在欧洲的标准化山楂提取物中其含量为 2 左右。关于山楂黄酮的各方面分析和研究开展得比较全面，其部分原因可能得 益于其标准物比较容易获得，因而较早就建立了很完善的分析方法。而另一类较 复杂的活性成分，以表儿茶素为单元的前花青素类( p r o c y a n i d i n s 简称p c ) ，虽 然其在标准化提取物中含量达2 0 左右，但是由于其化学性质很不稳定，且存在 多种聚合方式和不同的聚合程度，这些困难导致至今为止除单体的表儿茶素可以 较容易获得以外，p c 聚合物的标准品均很难获得，这使得其含量分析、药理活性、 吸收代谢、临床评价等一系列的研究全面滞后。 国内一些学者片面借鉴外国阶段性研究结果，提出中国山楂中的主要活性成 分是黄酮类化合物的判断t 5 7 ，5 8 1 , 这种观点是不够严肃的。按欧洲一些国家的药典 规定，山楂的药用原料主要为欧洲山楂的叶和花，其中确实含有可观的黄酮类成 分，而且这些成分也确实具有多种重要的药理作用。但是中国药典规定，山楂的 药用原料主要是中国山楂的干燥果实，虽然一些学者用分光光度法分析得到中国 山楂( 果实) 中有高含量“黄酮”的结果【5 7 1 ，但采用高效液相色谱法对3 7 个品 河北农业大学硕士学位论文 种山楂的分析结果表明，山楂鲜果中两种主要黄酮，金丝桃苷和i s o q u e r e i t r i n 的 含量之和平均值不到1 0 0m g k g ，而其中4 种主要低聚前花青素( o l i g o m e r i c p r o c y a n i d i n ，简称o p c ) 的含量之和平均为4 0 0 0m g 瓜9 1 5 9 j 。显然，中国山楂代表 性的活性成分应该是p c ，而高含量的p c 在分光光度法分析黄酮“含量”时所产 生的严重的干扰，应该是导致得出失真的结果的原因。 在这些“结果”的影响下，中国从9 0 年代追踪国外技术，开发了以中国山楂 叶为原料提取制备山楂黄酮的工艺，进而研制出多种山楂黄酮新药产品，实现了 临床应用。在取得了这些成果的同时，也应该注意，在一些制剂的研制过程中， 为了达到国家新药的标准，对山楂黄酮进行了精细分离，去除了原料中大量共存 的“杂质”o p c 。 表1 欧洲山楂提取物的一些药理作用 t a b l e1s o m ep h a r m a c o l o g i c a le f f e c t so f e u r o p e a nh a w t h o r ne x t r a c t s 山楂原料中前花青素的分析方法及稳定性研究 表2 欧洲山楂提取物的临床研究 t a b l e2s o m ec l i n i c a le f f e c t so f e u r o p e a nh a w t h o r ne x t r a c t s 然而在最近的几项研究结果中，欧洲山楂提取物制剂中导致心脏主动脉血管 扩张作用的活性成分是o p c ，而其中的黄酮没有却没有表现这种作用【6 0 1 。低浓度 的山楂o p c 即可表现通过促进n o 释放的活性，从而抑制心脏动脉血管内皮细胞 中e t - i ( e n d o t h e l i n 1 ) 的合成与释放，使心脏衰竭的恶性循环得以逆转1 6j ，而这 种作用是一种与o p c 的空间结构( 聚合度) 有关的特异性效应，而与其抗氧化作 用机理无关j 。有迹象表明，一个关于山楂o p c 在改善心脏功能方面的治疗和 保健作用的新学说正在初步形成1 6 1 1 。 p c 是植物界广泛存在的一类聚多酚化合物，在松、葡萄、山楂、花生、银杏、 白烨、等众多的植物中都有较高含量畔】，在植物化学领域，起初被归入缩合鞣质 或黄烷醇类，现在则多归入原花色素类( p r o a n t h o c y a n i d i n s ) q b 。1 9 6 1 年，德国的 k a r l 等从英国山楂( c r a t a e g u s o x y a c a n t h a ) 新鲜果实的乙醇提取物中首次分离出 2 种多酚化合物，1 9 6 7 年，美国j o s l y n 等又从葡萄皮和籽提取物中分离出4 种多 酚化合物，他们得到的多酚化合物在酸性介质中加热均可产生花青素，所以将这 类化合物命名为前花青素( p r o c y a n i d i n ) 1 6 5 】。其中最简单的前花青索是由儿茶素 或表儿茶素形成的二聚体，此外，还有三聚体、四聚体等直至数十聚体。按聚合 度的大小，通常将二六聚体称为低聚前花青素( o l i g o m e r i cp r o c y a n i d i n ，简称 o p c ) ，而将七聚体以上的称为多聚前花青素( p o l y m e r i cp r o c y a n i d i n ，简称p p c ) 。 最早实现o p c 商业化开发利用的是法国海岸松的o p c 提取物，8 0 年代以来 葡萄成为另一种提取原花青素的主要来源，已经开发了许多从葡萄果实、籽、皮、 叶及其它部位分离制取o p c 的成熟方法，现已从葡萄籽和皮中分离鉴定了十几种 o p c ，其中包括8 种二聚体、4 种三聚体、以及其它的四聚体、五聚体和六聚体【6 5 j 。 在国外，以o p c 为主要活性成分的葡萄籽提取物已经以药品、化妆品、食品营养 补充剂等形式在消费市场得到广泛应用。在国内，这类产品也已经开始起步并且 河北农业大学硕士学位论文 表现了良好的发展趋势。 然而作为另一种o p c 重要资源的山楂，人们还没有给予充分的研究，前期研 究结果表明，山楂果中所含的o p c 成分，以单体、二聚体、三聚体居多，平均聚 合度在2 3 之间，优于葡萄籽o p c ，处于最易于与人体肠道吸收的范围i ”j ，是十 分优异的潜在o p c 资源。山楂o p c 还具有资源丰富，成本低廉等优点，其工业 化分离提取技术已经取得实质性成果。因此，为了系统地实旌这一资源的合理开 发利用，配合建立一套准确可靠的山楂o p c 质量评估体系是十分必要的。 由于p c 的组成和结构十分复杂，国内外关于p c 的一些分析方法有不同的原 理1 6 “。b a t e - s m i t h 法，是利用p c 在酸性条件下，加热转化为红色的花青素，通 过测定生成的花青素的量来确定其中p c 的含量，但是此方法，测定的结果重现 性较差，并且p c 在此条件下，反应不是很彻底。因此出现了p o r t e r 法，此法是 在试剂中加入f e 3 十以提高反应的程度，和颜色的稳定性，此法也是测定p c 的相对 含量，而且不能区分p c 的组成。此外还有测定总酚含量的f o l i n c i o c a l t e a u 法， 它是在碱性溶液中，酚类化合物将钨钼酸还原，生成蓝色化合物( 最大吸收波长 7 6 0n m ) ，颜色的深浅与多酚含量呈正相关，但是此法也有缺点，也不能区分多 酚的种类，而且蛋白质、核酸、抗坏血酸等易氧化的物质也参与反应，产生干扰。 香兰素检测法是在酸性条件下，具有间苯三酚、间苯二酚结构的成分可与香兰素 发生缩合，产物在酸的作用下形成有色的正碳离子，样品浓度与产生的颜色呈正 相关，p c 单体的黄烷醇其a 环具有问苯二酚结构，因此也有这种显色反应。这 些分光光度法的共同特点是，它们都属于相对方法，可用来测定p c 总量，但不 能分别对其中各组分的含量进行分析。这种方法曾被欧洲药典采用，用于分析山 楂及其制剂中的p c 。国内曾报道用这类方法分析葡萄籽o p c 含量，但中国山楂 中p c 的含量测定尚未见分光光度法的报道。 高效液相色谱法( h p l c ) 是一种分离分析方法，具有分离效率高，灵敏度 高，重现性好等特点，是对复杂样品中的多种成分同时进行分离和测定的较理想 手段，目前这种方法已被许多国家政府列为食品、药品、化妆品等领域g m p 和 h a c c p 程序的规定检测手段，是新产品开发、产品质量控制和分析检测的首选 方法，在植物多酚的分析方面h p l c 法具有十分优越的性能，因而被广泛采用。 山楂黄酮的h p l c 分析方法比较成熟，一些优秀的方法已经被一些国家药典采用。 有关山楂o p c 的分析测定，也已经报道了一些h p l c 方法，一种用甲醇水体系 的反相h p l c 法测定了山楂叶和花中的表儿茶素、o p c 的二五聚体及绿原酸的 含量，但其中一些组分的分离效果不好。另一种用乙腈水体系测定了山楂样品中 二六聚体的o p c ，但该方法需要复杂的样品前处理，不仅黄酮不能同时分析， 而且山楂中的重要成分绿原酸和表儿茶素也被去掉而不能同时检测。还有一种采 用带化学反应检测器的高效液相色谱法( h p l c c r d ) ，可以对山楂中的o p c 单 体、二聚体、三聚体以及其它多酚进行分离测定，但分析时间长达近4 个小时。 因此，开发一种适用于对中国山楂主要活性成分进行质量监控的h p l c 方法很有 必要。对一些o p c 分析的代表性方法汇总于表3 。 4 山楂原料中前花青素的分析方法及稳定性研究 表3 原花青素的测定方法 t a b l e3 d e i c r m i n a f i o nm e t h o d so f p t o a n t h o c y a n i d i n s p c 是一类比黄酮更不稳定的多酚化合物，而山楂果实中含有高浓度的有机 酸，这又增加了其中p c 成分不稳定的因素，而为了实现其工业化的生产，就必 须解决原料的周年供应，因此p c 在原料中的稳定性研究，是制定经济合理的原 料保存供应方案的科学依据。目前受分析方法所限，山楂p c 在原料中的稳定性 方面尚未见任何相关报道。从黄烷。3 醇类成分的化学性质可知，其缩合反应属于 氧化反应，因此包装方式或许会影响其稳定性。此外存放温度以及原料的形态等 方面都可能影响p c 的稳定性，探讨这些因素对山楂p c 的影响程度是一项同时具 有理论和应用意义的重要研究课题。 通过本论文的研究，预期达到以下结果： 1 建立一套快速、准确、简便、实用的分析山楂原料中p c 总量的分光光度 法。 2 建立一套具有足够高的精密度、灵敏度、准确度，方便快速的h p l c 分析 方法，以便实现对山楂原料中主要o p c 及其它活性成分的质量监控。 3 利用建立的两种方法，对山楂原料的保存方式进行考察，探索温度、包装 方式、原料形态等因素对p c 稳定性的影响，提供不同条件下p c 降解反 应速率的定量描述，为制定合理的山楂原料保存方案提供科学依据。 4 比较低温鲜果贮存与室温干片保存两种存储方法优缺点，为提高产品质 量、控制生产成本提供依据。 河北农业大学硕士学位论文 2 1 试验材料 2 1 1 仪器 2 材料与方法 高效液相色谱仪：由p2 0 0i i 高压恒流泵、u v2 0 0i i 紫外可变波长检测器、 h y p e r s i lb d sc 1 9 ( 4 ，6 姗i d 2 5 0m l n ，5 m ) 色谱分析柱及e c l l r o m9 8 色 谱工作站等组成，中国大连依利特分析仪器有限公司生产。 紫外可见分光光度计：u v1 1 0 0 型，北京瑞利分析仪器有限公司； 8 0 0 型离心沉淀器：上海手术器械厂： u s c - 2 0 2 超声波清洗器：上海波龙电子设备有限公司； p h s 1 0 a 数字酸度离子计：萧山市鑫龙医疗器械有限公司； s z - 9 3 自动双重纯水蒸馏器：上海亚荣生化仪器厂； 旋转蒸发仪( r e 5 2 a ) ：上海亚荣生化仪器厂； f a l 0 0 4 分析天平( 万分之一) ：上海天平仪器厂等主要仪器。 2 1 2 试剂 葡萄籽提取物( 9 5 ) 购于天津尖蜂有限公司； 表儿茶素( e p i c a t e c h i n ，简称e p i ) 购于s i g m a 公司； 绿原酸( c h l o r o g e n i ca c i d ，简称c a ) 购于s i g m a 公司； 咖啡酸购予s i g m a 公司： 芦丁( r u t i n ) 购于s i g m a 公司： 前花青素b 2 ( p r o c y a n i d i n ，简称p cb 2 ) ，购于日本f u n a k o s h i 试剂公司； 前花青素c i ( p r o c y a n i d i n c l ，简称p c c l ) 由日本信州大学农学部生体反应 控制学实验室从山楂果实中分离提纯，经e s i m s 和化学鉴定，与文献值一 致： 甲醇和乙腈为色谱纯，其余试剂为分析纯。 2 1 3 植物材料 用于分光光度法建立的植物材料为本实验室于 p i n n a t i f i d a b g e v a t m a j o r ) 青果自制的山楂提取物。 用于山楂稳定性试验的植物原料为河北承德产的新鲜干山楂片，2 0 0 4 年1 1 月购于河北保定果品批发市场。 用于低温冷藏放置试验的植物原料为2 0 0 4 年l o 月在河北龙门水库采摘的山 楂鲜果。 6 山楂原料中前花青素的分析方法及稳定性研究 2 2 试验方法 2 2 1 山楂原料的处理 山楂粉：将购于市场的干山楂片，用磨粉机一次磨粉1 连，准确称取0 5g ， 平行3 份，放入研钵中，加少许石英砂，一定量甲醇，研磨均匀后，完全转移至 2 5m l 容量瓶中，用超声波震荡器提取后用甲醇定容，静置过夜；从中吸取上清 液1 0 0r n l 直接用于分光光度法分析，另取1 0 0m l 放于带刻度的试管中，真空 挥干溶齐f j ，加入1 0 0 m l 流动相溶解残渣，再用超声波振荡器处理5m i n ，注射器 吸取上清液，于0 4 5l a m 微孔滤膜过滤后，用于h p l c 分析。 山楂片：准确称取约1 0g 左右，磨成粉后取样，处理同山楂粉。 山楂鲜果：一次取出三袋贮存山楂鲜果，每袋1 0 个鲜果为一份样品，除籽打 碎后，准确称取3g 于研钵中，之后处理按山楂粉项下“加少许石英砂”开 始同法操作进行。 2 2 2 钼酸铵分光光度法 取两只1 0m l 容量瓶，分别加入0 5 0m lo 0 8m o l l 的钼酸铵溶液，在其中 一支容量瓶中加入1 0 0m l 甲醇，作为空白对照液，另一支容量瓶中加入1 0 0m l 样品上清液，两者用酸化( p h = 40 0 ) 的重蒸水定容、摇匀后，在4 0 0n r n 处测 定其吸光度。此方法是在钼酸铵分光光度法测定葡萄籽提取物中原花青素的基础 上改进后的方法1 7 7 1 。 2 , 2 3 高效液相色谱法 山楂中表儿茶素、p cb 2 、p cc l 、绿原酸活性成分测定的色谱条件： 色谱柱：h y p e r s i lb d sc i s 分析柱( 4 6m mi d 2 5 0m m ，5i , t m ) ： 流动相：甲醇乙脖水= 2 1 2 7 7 ，含5 0 0 u u l 的甲酸； 紫外检测器，检测波长：2 8 0n m ； 流速：0 8m l m i n ： 温度：室温； 进样量：】oh l ； 峰面积外标法定量。 7 河北农业大学硕士学位论文 3 结果与分析 3 1 分光光度法测定山楂中总前花青素方法的建立 前花青素是自然界广泛存在的一大类多酚化合物的总称，具有许多重要的生 物活性，但关于前花青素的测定方法国内尚无统一的标准。不同来源o p c 的组成 不同，当采用分光光度法进行分析时其干扰成分的种类和含量不同，o p c 的显色 能力也有差异。目前文献报道的分光光度法中主要集中在对葡萄籽提取物中前花 青素的分析，而对山楂中的前花青素研究较少，为此本文参考葡萄籽中原花青素 的测定方法进行了改进，开发出一种能用于工业生产质量控制的、简便、快速、 稳定、准确的分析山楂中总前花青素的检测方法。 3 1 t 分光光度法的比较 从目前检索到的测定o p c 总量的分光光度法中，筛选出了3 种有代表性的方 法，它们是卫生部规范法、硫酸香草醛法以及钼酸铵分光光度法，其中卫生部法， 是测定保健食品中前花青素的规定方法，其原理是通过测定前花青素在水解过程 中生成的深红色花青素离子，来计算试样中原花青素含量：硫酸香草醛法是在酸 性条件下，利用香草醛和多酚类物质中黄烷3 醇单体的一对一的特异性结合，测 定试样中前花青素的含量；还有钼酸铵分光光度法，其原理是利用前花青素与钼 酸铵在弱酸性条件下反应生成黄色钼酸酯，定量测定试样中前花青素的含量。本 项研究首先按文献方法以山楂提取物为样品进行了方法对比试验，结果见表4 。 表4 几种分光光度法测定山楂o p c 总含量的比较 t a b l e4 c o m p a r eo f t h es e v e r a ls p e c t r u mm e t h o d so i lt h et o t a lo p co f h a w t h o r n 注：a 线性范围为实际参加反应的样滚的浓度( 比色液中的浓度) 山楂原料中前花青素的分析方法及稳定性研究 由表4 可知，卫生部规范的方法，不仅精密度、准确度相对欠佳，面且其操 作相对繁琐、耗时；硫酸香草醛法灵敏度更高些，但其显色时间及显色温度均没 有钼酸铵法简便、快捷。而钼酸铵法具有良好的精密度，且操作简便，虽然灵敏 度稍低，但对于山楂原料及产品的质量监控来说这项指标影响不大。所以本试验 选锢酸铵法作为山楂中前花青素总量的测定方法。经改进后进行的评价结果显示 ( 见表4 ) ，这种方法不仅简便快速，而且精密度、准确度都有所提高，可用于山 楂原料以及提取物中o p c 总量测定。 3 1 2 分析条件的选择 对钼酸铵分光光度法进行了分析条件摸索，包括检测波长、显色剂用量、显 色时间及温度、最适酸度等，结果与文献报道基本一致( 数据从略) ，但对检测波 长的选择方面，文献所选检测波长确定在原花青素最大吸收波长3 3 2a m 处，而 没有考虑其它相似成分在此处的吸收干扰；而山楂中含有一定量的酚酸和少量黄 酮类成分，在此波长处这两类物质也会产生较强吸收，干扰前花青素的测定，因 此根据这几种物质的紫外吸收光谱图，在同时兼顾灵敏度不是很低，而且干扰最 小的情况下，选用4 0 0n l n 作为本方法的最佳检测波长。采用这一波长的另一个 优点是可以使用可见分光光度计进行分析，从而使方法更为简便易行。 3 1 - 3 酚酸及黄酮类成分对前花青素测定结果的影响 考虑到山楂中共存的其它多酚类成分对分析结果的影响，本试验用绿原酸及 黄酮为标准品在选定的分析条件下进行测定，按以往对3 7 个山楂品种中各成分的 大致含量考察这些成分对前花青素测定结果的影响程度，详见表5 。 袭5 绿原酸和黄酮类成分对分析结暴酌影响 t a b l e5 e f f e c to f c h l o r o g e n i ca c i da n df l a v o n o i d s 注a ：两种黄酮的古量以芦丁为标品计算 注b ：y 衷示暧光度；x 表示浓度( m g m l ) 由表可知，在此条件下，绿原酸对吸光度的贡献为2 7 0 2 ，两种黄酮类成分 对吸光度的贡献和为7 1 3 ，而前花青素只占总吸光度的6 5 8 5 ，因此，山楂鲜 河北农业大学硕士学位论文 果中绿原酸对测定的影响较大，两种黄酮影响不是很大。因此，可以利用各组分 占的百分比，对分光光度法测定的结果进行修正，计算出山楂样品中前花青素的 含量。在进行修正时，因不同形态的样品绿原酸的含量不同，若要准确修正绿原 酸的影响，应结合色谱的方法，相互补充共同作为工厂生产原料的质量控制方法。 3 2 山楂多酚主要成分h p l c 分析方法的建立 山楂中所含的酚类活性成分中，以黄烷醇类的表儿茶素、前花青素b 2 ，前花 青素c l 及酚酸类的绿原酸为多口9 j ，关于这些成分的h p l c 分析方法已经有一些 报道，这些方法多采用乙腈或甲醇与水为流动相的反相色谱体系，但实验发现在 甲醇体系下，o p c 三聚体c 与另外几种低聚体的色谱峰重叠现象严重，而在乙 腈体系下绿原酸前移到b 2 色谱峰之前，并与另外几种成分重叠，为此本试验在以 往工作的基础上，用乙腈和甲醇的混合体系建立了一种快速分析这几种主要成分 的简便方法。 3 2 1 色谱条件的选择 在反相高效液相色谱中，流动相种类的选择和配比对组分的分离至关重要， 一般使用甲醇、乙腈等有机溶剂和水组成的二元体系，高分子量的聚合型前花青 素( 如c ，) ，对流动相中甲醇含量的变化比较敏感，且随着甲醇含量增大，c l 就 会前移直至与绿原酸重合，丽e p i ，b 2 ，c a 对此变化比较迟钝