（物理化学专业论文）纳米粒子增强蛋白质直接电子传递及其传感应用.pdf

摘要 摘要 研究蛋白质与电极之间的直接电子传递具有重要的理论和实践价值。蛋白质 与电极表面的紧密接触将引起蛋白质的结构和功能发生重要改变，对电极或蛋白 质进行修饰，可以改善蛋白质的直接电子传递性质。碳纳米管与二氧化锆纳米粒 子能够为固定在其上的蛋白质分子提供一个类似于其天然系统的微环境，给蛋白 质分子更自由的取向，因而降低了蛋白质分子壳层直接电子传递的绝缘性质，并 通过纳米粒子通道加速其电子传递过程。本论文就蛋白质分子在纳米粒子上的固 定、电子传递和传感应用开展了如下工作： ( 1 ) 碳纳米管增强蛋白质在低导电基质上的直接电子传递及其传感研究 研究了血红蛋白( h b ) 在聚氨酯薄膜( p u e ) 上的固定及其直接电化学性 质。聚氨酯是一种成膜性和稳定性较好的高分子材料，但其导电性和渗透性较差。 红外光谱研究表明，固定在p u e 膜中的h b 分子保持了其天然活性，在上述体 系中加入碳纳米管，红外光谱结果显示h b 分子仍有特征峰出现。h b ，p u e 修饰 石墨电极在0 1m o f l ，p h7 0 磷酸盐缓冲溶液( p b s ) 中循环扫描，可得到一对 氧化还原峰，但峰电流较小，h b p u e m 、州t s 修饰石墨电极在上述体系中循环 扫描，其循环伏安图出现一对稳定且峰形较好的氧化还原峰，峰电流增加4 倍， 式量电位e = - 3 3 4m v ( v sa g a g c l ) 。随着溶液p h 的增加，氧化还原式量电位 与溶液p h 值成一直线关系，斜率为5 4 4 7m v p h ( r = 0 9 9 3 ) 。对比可知，纳米面0 2 和z r 0 2 的加入使得峰电流比不加纳米粒子分别增加1 5 和2 5 倍。扫描电子显微 镜( s e m ) 结果显示，添加碳纳米管的h b p u e 膜是一种表面清洁、粒径均一、 多孔的网状结构，使得h b m w n t s p u e p g 修饰电极表现出稳定、灵敏的电化 学响应。利用此修饰电极捡测n 0 2 一，可以得到较灵敏的电化学响应，检测线性 范围为0 0 8 3 6m m o f l ，检测限为6 8p m o l l 。 摘要 ( 2 ) 葡萄糖氧化酶在二氧化锆纳米粒子上的固定与生物传感 研究了固定在二氧化锆纳米粒子( z r 0 2 ) 修饰裂解石墨电极( p g ) 上葡萄 糖氧化酶( g o d ) 的直接电化学行为和电催化性质。分别采用带正电性或带负电性 的铂胶溶液( it p l l 和p t p v a ) 和不带电荷的d m s o 溶液来制备z r 0 2 纳米粒 子修饰电极，发现纳米粒子的带电性对酶的直接电子传递性质有显著的影响。研 究了各种电极的式量电位、蛋白质吸附量和电子传递速率。实验表明由z r 0 2 纳 米粒子、金胶和p v a 混合修饰的g o d 电极表现出最快的电子传递速率和最小的 式量电位e 0 1 。固定在z r 0 2 p t p l l 和z r 0 2 p t - p v a 纳米粒子上的葡萄糖氧化酶 分子能保持它的生物活性和天然结构，对葡萄糖有较好的电催化响应，而在 z r 0 2 d m s o 和z r 0 2 f d d a b 修饰的电极中没检测到g o d 的活性。 ( 3 ) 细胞色素p 4 5 02 8 6 在= 氧化锆纳米粒子修饰电极上的电化学行为 将二氧化锆纳米粒子与p t - p l l 混合后固载细胞色素p 4 5 0 得到的修饰电极 具有比较好的电化学信号，使得p 4 5 0 与电极之间的直接电子传递速率增大。纳 米z r 0 2 粒子与p t - p l l 都起到了增强电子传递的作用，固定化c y p 2 8 6 对氧气 表现出优良的电催化信号，通过向缓冲溶液中加入抗癌药物利多卡因可以促使这 种电催化氧还原的反应更明显，采用安培法可以构建一种针对p 4 5 0 底物的药物 检测传感器。 关键词：多壁碳纳米管，纳米二氧化锆，血红蛋白，葡萄糖氧化酶，细胞色素 p 4 5 02 8 6 ，聚氨酯 n 英文摘要 n a n o s t r u c t u r e dm a t e r i a l se n h a n c e dt h e d i r e c t e l e c t r o nt r a n s f e ro ft h ei m m o b i l i z e dp r o t e i na n di t s a p p l i c a t i o nf o rb i o s e n s i n g a b s t r a c t t h ee l e c t r o c h e m i c a la m p e r o m e u i cb i o s e n s o r sh a v eb e e nc o n s i d e r e dt ob e p r o m i s i n gf o rd e t e r m i n a t i o n sb e c a u s eo ft h ea d v a n t a g e ss u c ha sh i 曲s e n s i t i v i t y , l o w c o s t , e a s ym i n i a t u r i z a t i o na n da u t o m a t i o n t h e yh a v ee x c e l l e n ts e l e c t i v i t y , a n dc a l l m e e tt h ec h a l l e n g e sp o s e db yc o m p l e xs a m p l e s ，a l s oc a nb ea p p l i e dt oo n - l i n ea n di n v i v oa n a l y s i s t h ek e yp r o c e d u r ei nt h ee l e c t r o c h e m i c a lb i o s e n s o rf a b r i c a t i o ni st h e c o n s t r u c t i o no fab i o n i ci m e r f a c eo ne l e c t r o d es u r f a c e ，w h i c hi sa l s oc a l l e dt h e i m m o b i l i z a t i o no fb i o m o l e c u l e s t ou s i n gn a n o s t r u c t u r em a t e r i a l sb i o m o l e c u l e i m m o b i l i z a t i o ni sas i g n i f i c a n tw o r kf o re l e c t r o c h e m i c a lb i o s e u s o rd e v e l o p m e n t c e n t e r i n go nt h i sp u r p o s e ，w ec a r r i e do u ts o m er e s e a r c h e sa sf o l l o w f i r s t , w ei n v e s t i g a t et h ed i r e c te l e c t r o nt r a n s f e rr e a c t i v i t yo ft h ei m m o b i l i z e d h e m o g l o b i n ( 1 - r o ) o np o l y u r e t h a n ee l a s t o m e r ( p u e ) f i l mf o rb i o s e n s o rd e s i g n t h e p o l y u r e t h a n ee l a s t o m e rf i l ms y n t h e s i z e db ya na d d i t i o n a lp o l y m e r i z a t i o np o s s e s s e s g o o db i o c o m p a t i b i l i t y , g o o du n i f o r m i t ya n dc o n f o r m a b i l i t y , a n di sr e a d yf o rp r o t e i n i m m o b i l i z a t i o n e l e c l r o e h e m i c a la n ds p e c t r o s c o p i cm e a s u r e m e n t ss h o wt h a tt h e p r e s e n c eo fm u l t i w a l lc a r b o nn a n o m b c s ( m w n t s ) i n c r e a s e dt h ep r o t e i n o p u e i n t e r a c t i o n , v a r i e dp o l y m e rm o r p h o l o g y , i m p r o v e d t h e p e r m e a b i l i t y a n dt h e c o n d u c t i v i t yo ft h ep u ef i l m ，a n dt h u sf a c i l i t a t e dt h ed i r e c te l e c l r o nt r a n s f e rb e t w e e n t h ei m m o b i l i z e dh ba n dt h ec o n d u c t i v i t ys u r f a c et h r o u g ht h ec o n d u c t i n gt u n n e l so f m u l t i w a l lc a r b o nn a n o t u b e s t h ei m m o b i l i z e dh bm a i n t a i mi t sb i o a c t i v i t i e sa n d d i s p l a y sa ne x c e l l e n te l e c t r o c h e m i c a lb e h a v i o rw i t haf o r m a lp o t e n t i a lo f - ( 3 3 4 + 7 ) m v t h ea d d i t i o no fn a n 0 2l e a d st ot h ei n c r e a s eo ft h ee l e c t r o c a t a l y t i cr e d u c t i o n i i i 英文摘要 c u r r e n to fn i t r i t ea t - 0 7vn l i sa l l o w su st od e v e l o pan i t r i t es e n s o r 谢t hal i n e a r r e s p o n s er a n g ef r o mo 0 8t o3 6m m t h ep r o p o s e dm e t h o do p e n saw a yt od e v e l o p b i o s e n s o r sb yu s i n gn a n o s t r u c t u r e dm a t e r i a l sm i x e d 、) l ，i t l ll o we l e c t r i c a lc o n d u c t i v i t y m a t r i c e s s e c o n d ，t h ed i r e c te l e c t r o nt r a n s f e rb e t w e e ne l e c t r o d e sa n dg l u c o s eo x i d a s e ( g o d ) i m m o b i l i z e di nam a t r i x c o n t a i n i n gz i r c o n i u md i o x i d en a n o p a r t i c l e s ( z a 9 9i s d e s c r i b e d t h ep r o t e i n - n a n o p a r t i c l ea s s e m b l yi ss t a b i l i z e db yc h a r g e da n du n c h a r g e d c o m p o u n d sa n dt h ed i r e c te l e c t r o nt r a n s f e ri se n h a n c e d t h ee f f e c t so fd i f f e r e n t c o m p o s i t i o n so i lt h ee l e c t r o c h e m i c a lp a r a m e t e r s ，f o r m a lp o t e n t i a l ，s u r f a c el o a d i n g ， a n dc o n s t a n th e t e r o g e n e o u se l e c t r o nt r a n s f e rr a t e ，i sc h a r a c t e r i z e dw i t hc y c l i c v o l t a m m e t r y n 圯f a s t e s te l e c t r o nt r a n s f e rr a t ew i t ht h es m a l l e s td e v i a t i o no f t h ee 0 i s o b t a i n e dw h e ng o di si m m o b i l i z e d1 i t hz 1 0 2n a n o p a r t i c l e s c o l l o i d a lp l a t i n u ma n d p o t y l y s i n e ( p u 0 i n c o r p o r a t i o no fc h a r g e dc o m p o u n d sf o ri m m o b i l i z a t i o no fg o d c a u s e sal a r g e r p o s i t i v e s h i f to ft h ef o r m a l p o t e n t i a l e l e c t r o c h e m i c a la n d s p e c t r o s c o p i cm e a s u r e m e n t ss h o wt h a tt h eg o de n t r a p p e di nz r 0 2 p t - p l lo r z r 0 2 ，p t p v af i l mr e t a i n si t s b i o a c t i v i t ye f f i c i e n t l y a n de x h i b i t se x c e l l e n t e l e e t r o e a t a l y t i cb c h a v i o u rt o w a r d sg l u c o s e n oe n z y m i ca c t i v i t yo ft h ei m m o b i l i z e d g o dc a l lb eo b s e r v e do nz r o z d m s oa n dz r 0 2 ，d d a bf i l m t h i r d ，w ei n v e s t i g a t e dt h ed i r e c te l e c t r o c h e m i c a la n de l e e t r o c a t a l y t i cb e h a v i o ro f t h ei m m o b i l i z e dc y t o c h r o m ep 4 5 02 8 6 ( c y p z b 6 ) o nz i r c o n i u md i o x i d e n a n o p a r t i c l e s ( z r 0 2 ) t h i nf i l m s o fn a n o - s t m e t u r e dz r 0 2w i mi n c o r p o r a t e d c y t o c h r o m ep 4 5 02 8 6 ( c y p 2 8 6 ) 州mc o l l o i d a lp a l t i ns t a b l e db yp o l y - l y s i n e ( p t - p l l ) w e r ep r e p a r e d0 1 1g l a s s yc a r b o ne l e c t r o d e s n l em o d i f i e de l e c t r o d e sw e r e c h a r a c t e r i z e db yc y c l i ca n ds q u a r e - w a v ev o l t a m m e t r i cm e t h o d s t h ei m m o b i l i z e d c y p 2 8 6c o u l db er e d u c e df a s t0 1 1z r 0 2 m o d i f i e dg l a s s yc a r b o ne l e c t r o d e si nt h e p r e s e n c eo fp t - p l l i na n a e r o b i cs o l u t i o n s ，t h eb i o s e u s o re x h i b i t e ad i r e c tr e v e r s i b l e e l e c t r o nt r a n s f e rb e t w e e nt h eh e i n ee l e c t r o a c t i v ec e n t e ro fc y p 2 8 6a n de l e c t r o d e s w i t haf o r m a lp o t e n t i a lo f - ( 0 4 4 9 ：t 0 0 0 4 ) v 砒p h7 4 i na i r - s a t u r a t e ds o l u t i o n a l l i n c r e a s e db i o e l e e t r o e a t a l y t i cr e d u c t i o ne t t r r e n tc o u l db eo b t a i n e d 、) l r i l l lt h e c y p 2 8 6 - m o d i f i e de l e c t r o d eo na d d i t i o no f a n t i - c a n c e rd r u gs u c ha sl i d o c a i n e t h i si s i v 英文摘要 p o t e n t i a lt oc o n s t r u c td i s p o s a b l eb i o s e n s o r sf o rd r u g sb yu t i l i z i n gt h ee l e c t r o c h e m i c a l a c t i v i t ya n dc a t a l y t i cr e a c t i o n so f t h ei m m o b i l i z e dc y t o c h r o m ep 4 5 0 k e y w o r d s ：z r 0 2n a n o p a r t i c l e ，c a r b o nn a n o t u b e ，p o l y u r e t h a n ee l a s t o m e r , h e m o g l o b i n , g l u c o s eo x i d a s e ，c y t o c h r o m ep 4 5 02 8 6 v 学位论文独创性声明 本人郑重声明： 1 、坚持以“求实、创新”的科学精神从事研究工作 2 、本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作和取得的研究 成果。 3 、本论文中除引文外，所有实验、数据和有关材料均是真实的。 4 、本论文中除引文和致谢的内容外，不包含其他人或其它机构 已经发表或撰写过的研究成果 5 、其他同志对本研究所傲的贡献均已在论文中作了声明并表示 了谢意。 作者签名： 趣赁擘 日期：萼阻 学位论文使用授权声明 本人完全了解南京师范大学有关保留、使用学位论文的规定，学 校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电 子版和纸质版；有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论 文进入学校图书馆被查阅；有权将学位论文的内容编入有关数据库进 行检索；有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在 解密后适用本规定。 作者签名； 独鸶绎 日期：丑耻业 第一章绪论 第一章绪论 1 1 生物传感器的基本概念 1 1 1 生物传感器概述 传感器是一种信息获取与处理的装置。对物质成分传感的器件就是化学传感 器，它是一种小型化的、能专一和可逆的对某种化学成分进行应答反应的器件， 并能产生与该成分浓度成比例的可测信号。而生物传感器是在化学传感器的基础 上发展起来的，它是一类特殊的化学传感器，是以生物活性单元( 如酶、抗体、 核酸、细胞等) 作为生物敏感基元，对目标被测物具有高度选择性的检测器i l , 2 1 ， 并且能在复杂的体系中进行快速，在线，连续监测。生物传感器能广泛应用于基 础研究、生物、l 临床化学和诊断、农业和畜牧兽医、化学分析、军事、过程控制 与检测、环境监控与保护等领域1 3 棚。 生物传感技术已成为电化学分析和生物技术研究最为活跃的领域之一，也是 世界各国都十分重视的一项高新技术。到目前为止。生物传感器大致经历了三个 发展阶段：第一代生物传感器是由固定了生物成分的非活性基质膜( 透析膜或反 应膜) 和电化学电极所组成；第二代生物传感器是将生物成分直接吸附或共价结 合到转换器的表面，不需要非活性的基质膜：第三代生物传感器是把生物组分直 接固定在电子元件上，他们可以直接感知和放大界面物质的变化，从而把生物识 别元件和信号的转换处理结合在一起。1 9 2 1 年h e y r o v s k y 创立极谱学，为电分 析化学的发展做出了巨大的贡献 9 1 。m u l l e r 于1 9 2 8 年发现了葡萄糖氧化酶。2 0 世纪4 0 年代，酶开始用作分析试剂来检测底物为有机物的特定物质【1 0 】。2 0 世 纪6 0 年代，c l a r k 等首次提出了将酶和电极组合起来用以测定酶底物的原理的 设想【5 l 。1 9 6 6 年，u p d i k e 和h i c k s 根据c l a r k 的设想，将葡萄糖氧化酶在聚丙 烯酰胺凝胶中固定化，并安装在c l a r k 型电极上，用来测定葡萄糖，从而制成 了第一支酶电极【i l 】。j a n a t a 于1 9 7 5 年研制出了电化学免疫生物传感器【1 2 1 。1 9 7 7 年出现了电位型免疫传感器【1 3 l 和提出了酶场效应等理论【1 4 1 。组织传感器和线粒 体电极则是分别于1 9 7 8 年和1 9 8 0 年出现【l ”。1 9 8 3 年l o w e 和g o l d f i n c h 第 第一章绪论 一次将光学换能器引入了酶传感器领域。此后，随着生物、化学、物理学、医学、 电子技术等相关学科的迅速发展，生物传感器的发展也被带动了，各种类型的生 物传感器也相继出现。 生物传感器自诞生以来，虽然只有很短的时间，但已在医疗，工农业生产， 环保、人工智能、生物学领域里进行了卓有成效的应用。随着生物传感器的不断 发展，它必将展示出越来越多方面的应用前景。 1 1 2 生物传感器的基本组成 生物传感器是一种新兴的生物技术产品，在分子领域中具有极大的发展潜力 和前景。从严格意义上讲，生物传感器是一种能够连续和可逆地感受化学量和生 物量的一种装置，即可以进行分子识别的装置，还可被视为信息采集和处理链中 的一个逻辑元件。生物传感器的应用领域广阔，品种也十分繁多，一般由敏感膜、 换能器和信号处理器三部分组成【1 6 1 ( 见图1 1 ) 。 生 换 卜 二 i 被分析秒 錾 ：生物学反应信薏妙能l 电信号次 感 器 仪 膜 表 图1 1 生物传感器原理图 生物传感器的原理是：生物敏感膜内含有能与目标物进行选择性作用的生物 活性组分：换能器则能敏感捕捉生物活性组分与目标物之间的作用过程，并将其 表达为可检测的物理信号。当待测物与具有分子识别作用的特殊技术固定在换能 器内( 或表面) 生物活性因子作用时，产生光学、热学、压电学或电化学等响应信 号，最后把所得的电信号经过电子技术的处理后，在仪器上显示或记录下来。其 信号大小与分析物含量或浓度存在定量关系，从而实现对待测物质的定量检测。 敏感膜是生物传感器的关键部件，由膜基质和敏感材料组成。可做敏感材料的生 物材料有：酶、免疫系统、微生物、生物组织、细胞和d n a 。由于待测物与生 物组分之间产生可逆识别，因此，传感器在保持生物敏感组分有效活性情况下， 2 第一章绪论 可对同一底物反复多次检测。 1 1 3 生物传感器的分类 生物传感器按照生物特异性授予机制或信号转换模式，一般可以从以下三个 角度进行分类 l7 j ： ( 1 ) 根据传感器输出信号的产生方式，可分为生物亲和型生物传感器1 1 8 1 和代 谢型或催化型生物传感器【1 蝌) 1 。生物亲和型传感器利用免疫试剂对之间专一性识 剐或键合性质来对抗原、半抗原或抗体进行检测，它检测的是热力学平衡的结果 催化型生物传感器利用固定到电极表面的酶的专一性和催化性，在接近中性和室 温袈件下对特定底物产生作用，直接检测酶催化产物的电化学信号或通过电子媒 介获取响应信号，它检测的是整个反应动力学过程的总效应。 ( 2 ) 根据生物传感器中生物分子识别元件上的敏感物质的属性可分为：酶传 感器【2 ”、微生物传感器圜、组织传感器瞄】、细胞传感器【2 4 j 、免疫传感器【2 5 1 、 d n a 传感器 2 6 l 。 ( 3 ) 根据生物传感器的信号获取方式，可分为： ( a ) 电化学生物传感器。按测量信号不同，电化学生物传感器又可分为电流 型瑶7 l 、电位型闭和电导型。电流型酶传感器的原理是利用固定在电极表面上 的酶对酶底物的催化氧化或还原，产生可在电极上还原或氧化的组分，获得电流 信号；电位型传感器是基于离子选择性电极原理而发展起来的，固定到电极表面 酶对底物催化，产生离子型物质，能引起指示电极电位改变，电位变化关系遵循 n e r n s t 方程；电导型传感器利用酶催化底物反应，导致反应体系中离子种类及 浓度的变化，从而引起溶液导电性的改变，以溶液电导率为响应信号 ( ”光化学生物传感器【3 0 , 3 1 1 。此类传感器以光学信号变化量为测定信息，由 于可利用的光学信号很多，包括光吸收、反射、散射、荧光、磷光、化学发光、 表面等离子体共振等。 ( c ) 压电生物传感器口到。用压电晶体检测质量的依据是，压电晶体的振荡频 率与其表面质量的变化有关，在一定的条件下，晶体的共振频率与吸附的物质呈 线性关系。在压电晶体生物传感器内，晶体上涂有生物受体，后者与被分析物有 选择性反应。 第一章绪论 ( d ) 热传导生物传感器 3 3 j 。通过特殊的量热设备来测量由于化学和生物反应 导致反应体系的热量变化。 另外，生物传感器也可根据所监控的分析物或发生的反应进一步分为直接检 测反应产生的或消耗的分析物的浓度，及问接检测生物识别元件的抑制剂和激活 剂( 如图1 2 ) 。 圈1 2 生物传感器的分类示意图p q 1 1 4 酶传感器 酶传感器是最先被发明出来的，其应用也很广泛，应用酶传感器可以省去提 纯酶的繁杂步骤f 3 习。它也是生物传感器领域中研究最多的一种类型。酶生物传 感器是由一个固定化的生物敏感膜和与之密切结合的换能系统组成，它把固化酶 和电化学传感器结合在一起，因而具有独特的优点：( 1 ) 它既有不溶性酶体系的 优点，又具有电化学电极的高灵敏度；( 2 ) e h 于酶的专属反应性，使其具有高的 选择性，能够真接在复杂试样中进行测定。因此，酶电极在生物传感器领域中占 有非常重要的地位。酶电极的基本结构单元是由物质识别元件( 固定化酶膜) 和 信号转换嚣( 基体电极) 组成。当酶膜上发生酶促反应时，产生的电活性物质由 基体电极对其响应。基体电极的作用是使化学信号转变为电信号，从而加以检测， 基体电极可采用碳质电极( 石墨电极、玻碳电极、碳糊电极) 、p t 电极、金电极 及相应的修饰电极。 当酶电极浸入被测溶液，待测底物进入酶层的内部并参与反应，大部分酶反 第一章绪论 应都会产生或消耗一种可被电极测定的物质，当反应达到稳态时，电活性物质的 浓度可以通过电位或电流模式进行测定。因此，酶生物传感器可分为电位型和电 流型两类传感器。电位型传感器是指酶电极与参比电极间输出的电位信号，它与 被测物质之间服从能斯特关系。而电流型传感器是以酶促反应所引起的物质量的 变化转变成电流信号输出，输出电流大小直接与底物浓度有关。电流型传感器与 电位型传感器相比较具有更简单、直观的效果，且灵敏度也高。 自1 9 6 2 年c l a r k 【5 】提出设想、1 9 8 7 年u p d 搬和h t c k s t l l l 首次研制出生 物传感器以来，酶生物传感器得到了迅猛发展，主要经历了三个阶段：第一代酶 生物传感器是以氧为中继体的电催化；第二代酶生物传感器是以媒介体修饰剂为 基础的电催化，增加了化学修饰层即电子转移媒介体，目的是为了扩大基体电极 可测化学物质范围及提高测定的灵敏度，基体电极经过修饰后，可以看成是一个 改进了的信号转换器。电子媒介体的作用是能促进电子传递过程，降低工作电位， 以排除其它电活性物质的干扰：第三代酶生物传感器是酶在电极上的直接电化 学。图1 3 为三代电极的示意图。 第叫芑穗f 夔第：代酶电檄 第毒代酶电摄 ( 氧受体经典辫电授， 介体酶电撮)直接酶屯极 图1 3 生物传感器的电子传递例 l 1 s 传感器中酶的固定化技术 为得到性能优良的酶传感器，酶的固定化技术是获得研究和改进的重要技术 背景。酶的固定化是指利用化学或物理的手段将游离的酶定位于限定的空间区域 并使其保持活性和可反复使用的一种基本技术9 6 1 。与游离酶相比较，固定化酶 具有一系列的优点：热稳定性提高；可重复使用：反应后不需要进行催化 第一章绪论 物质与反应物质的分离。 酶固定化的传统方法常见的有以下几种圈( 如图1 4 所示) ： ( a ) 吸附法一吸附法分为物理吸附法和化学吸附法。吸附法操作简单、易 于在许多材料上进行。它是一种较为温和的蛋白质固定方法，能有效地保留蛋白 质活性。但这种方法的酶负载量较低，这就意昧着灵敏度较低，同时吸附一般是 可逆过程，因而随着时间的延长，解吸也会减少灵敏度。 共价键合法一将酶与聚合物载体共价键结合的固定化方法。此法的优 点是酶与载体的结合较为牢固，酶不易脱落。可提供非常高的不可逆负载。而且 这些键合的蛋白质在通常的操作条件下比较稳定。通常用的载体有纤维素及其衍 生物、多孔玻璃、石墨等。由于反应条件较为剧烈，这种方法比其它的固定方法 条件更恶劣，制备的酶电极灵敏度较低，某些共价固定法稳定性也并不突出。 ( c ) 包埋法一蛋白质的包埋法是将酶包埋于格子( l a t t i c e ) 内，格子的结构可 以防止蛋白质渗出，但是底物仍能渗入到格子内与酶相接触。此方法较为简便， 酶分子仅仅是被包埋起来，而未参加化学反应。蛋白质不是经化学键，而是由膜 保留下来。m i c h a c l i s - m e n t e n 动力学表明，信号与检测元件附近的活性酶的数量 成正比。包埋法可以保留大量的活性酶，因而电极的响应较高。但包埋膜通常很 脆弱，易于破裂而使酶渗漏，这样就会大幅度地减小装置的灵敏度和精确性。 ( d ) 交联法此法是借助双官能团试剂使蛋白质结合到惰性载体上或蛋 白质分子彼此交联成网状结构。双官能团试剂具有两个功能基团，能与蛋白质中 赖氨酸的氨基，n 末端的a 氨基、酪氨酸的酚基或半胱氨酸的s h 发生共价交 联，可供交联的双功能试剂有戊二醛、双偶氮苯、无水丁烯二酸乙烯共聚物等。 各种酶固定化方法的比较如表1 4 所示。 臣彦酶婚 吸附法 且j l j l 一 囫囫 回回 广 广 厂 共价键法 交联法 包坪法 图1 4 酶的固定化方法示意图p 1 6 第一章绪论 1 2 纳米材料及其在传感器中的应用 1 2 1 纳米材料的研究进展 纳米材料从兴起到现在，它的研究发展历程大致可分为以下三个阶段 2 9 , 2 9 1 ： 第一阶段( 1 8 世纪中期1 9 9 0 年) ，以在美国巴尔的摩召开的第一届国际纳米科学 技术会议为标志，正式把纳米材料科学作为材料学科的一个新的分支；第二阶段 ( 1 9 9 0 1 9 9 4 年) ，以第二届国际纳米材料学术会议为标志，提出了对纳米材料微 结构的研究应着眼于对不同类型材料的具体描述；第三阶段( 1 9 9 4 年至今) ，纳 米材料的特点在于按人们的意愿设计、组装和创造新的体系，即以纳米颗粒、纳 米线和纳米管为基本单元在维、二维和三维空间组装纳米结构的体系。 在纳米材料中，由于纳米级尺寸与光波波长、德布罗意波长等物理性质特征 尺寸相当或更小，使得晶体周期性的边界条件被破坏；纳米微粒的表面附近的原 子密度减小；电子的平均自由程很短，而局域性和相干性增强。这种变化使得纳 米材料产生在宏观尺度上完全看不到的或者特别优异的性质，主要包括表面效 应、小尺寸效应、量子尺寸效应和宏观量子隧道效应0 0 - 3 2 1 。这四种效应是纳米材 料的基本特性，也是纳米材料与常规材料有很大差异的原因【3 3 1 。 ( 1 ) 表面效应 表面效应是指超微粒子的表面原子数与总原子数之比随粒径的变小而急剧 增大。表面原子的晶场环境和结合能与内部原子不同，具有很大的化学活性，晶 体场的微粒化伴有这种活性表面原子的增多，表面能大大增加，这主要是由于表 面原子的周围缺少相邻的原子，有许多悬空键，具有不饱和性质，易与其他原子 相结合而稳定下来。 ( 2 ) 小尺寸效应 随着物质尺寸的量变，在一定条件下会引起物质性质的质变。由于物质尺寸 量变所引起的宏观物理性质的变化称为小尺寸效应。纳米颗粒尺寸小，比表面积 大，熔点、磁性、热阻、电学、光学、化学和催化性质等都与大尺度物质明显不 同，产生了一系列奇特的性质。 ( 3 ) 量子尺寸效应 、 大块材料的金属，它的箍带可以看成是连续的，而介于原子和大块材料之间 的纳米材料的能带将分裂成分立的能级，即能级量子化。这种能级间的间距随着 7 第一章绪论 颗粒尺寸的减小而增大，当能级间的间距大于热能、光子能量、静电能、磁能、 静磁能或超导态的凝聚能平均能级间距时，就会出现一系列与大块材料不同的反 应特性，称之为量子尺寸效应。这种量子尺寸效应导致纳米颗粒的磁、光、电声、 热以及超导电性等特性与大块材料显著不同。 ( 4 ) 宏观量子隧道效应 微观粒子具有穿越势垒的能力称之为隧道效应。近年来，人们发现一些宏观 的物理量，如微小颗粒的磁化强度，量子相干器件中磁道量以及电荷等也具有隧 道效应，他们可以穿越宏观系统的势垒而产生变化。宏观量子隧道效应的研究对 基础研究的应用都有重要的意义。例如，它限制可采用磁带磁盘进行信息存储的 最短时间。这种效应和量子尺寸效应一起，将会是未来电子器件的基础，他们确 定了微电子器件的迸一步微型化的极限。 尽管对纳米材料的研究刚起步，但已发现的一系列性能表明：一个崭新的研 究领域已经开拓，这些性能的研究将导致一系列具有新颖性能和广泛用途的新材 料问世，也就是说纳米材料的研究在科学上有着十分广泛的应用前景。目前，传 感器的研究逐渐成为人们研究的热点和焦点，这种具有优良特性的被誉为“通往 2 l 世纪的新材料”的纳米材料将在传感器的构建中有着广阔的前景。 1 2 2 纳米材料的分类 根据组成纳米材料的粒子在空间维数上的分布可分为三类：零维。指在空 间三维尺寸均在纳米尺度内如纳米尺度颗粒、原子簇等；一维。指在空间有 两维处于纳米尺度，如纳米丝、纳米棒、纳米管等；二维。是指在三维空问中 有一维处于纳米尺度，如超薄膜、多层膜、超晶格等。根据构成纳米材料的物质 类别，分为金属纳米材料、半导体纳米材料、纳米陶瓷材料、有机无机纳米复 合材料及纳米介孔固体与介孔复合体材料等。 1 2 3 无机纳米材料在电化学生物传感器中的应用 纳米结构所具有的小尺寸效应、表面与界面效应使无机纳米材料呈现出独特 性能。无机纳米材料具有无毒副作用，良好生物相容性，耐腐蚀等优异的性能， 受到生物材料研究者的广泛关注。无机纳米材料作为一种有潜力的生物纳米材料 8 第一章绪论 已经被广泛地用于生物、医药等领域】。目前，第三代电化学生物传感器正在 快速发展。但它的灵敏性和应用范围存在一定的局限性。这是由于：( 1 ) 没有一 种简便的方法来固定生物活性物质；( 2 ) 些生物活性物质( 如酶，细胞，微生物 等) 的活性中心在一定程度上被蛋白质所掩蔽，纳米材料具有比表面积大、表面 活性中心多、吸附能力强，表面亲水性强等优异性质。研究者将纳米材料应用于 生物电化学传感器中，实现了生物活性物质与电极之间的直接电子转移，提高了 电化学生物传感器的电信号响应灵敏度及稳定性。 纳米材料增强电化学生物传感器性能的可能机制为： ( 1 ) 由于纳米材料比表面积大、表面自由能高，因而生物活性物质在纳米颗 粒表面的吸附量有所增加，并且得到强有力的固定，有效地防止了生物活性物质 在测试溶液中的流失。因而可以显著提高电极的电流响应、灵敏度及稳定性。 ( 2 ) 纳米材料具有的表面效应使其表面存在许多悬空键，具有很高的化学活 性，并且纳米固体材料表面亲水性更强，这些性能能够增强无机材料的生物相容 性。 ( 3 ) 纳米材料具有宏观量子隧道效应，微观粒子具有贯穿势垒的能力称为隧 道效应。隧道效应能够促进酶的氧化还原中心与电极间通过纳米粒子进行电子传 递。 因此纳米材料可以在保持生物功能物质活性的基础上，实现固定化生物活性 物质之间、固定化活性物质与电极之间有效的电子传递。 应用最早的纳米粒子是纳米金胶颗粒，它是最稳定的金属纳米粒子，能为蛋 白质提供一个与本体环境相似的微环境，而且也有助于蛋白质与电极表面之间的 直接电子转移，被应用于多个体系来实现氧化还原蛋白质或酶与电极之间直接电 子转移，提高了生物传感器的性能。如陈洪渊课题组】先后成功地将辣根过氧 化物酶r p ) 、血红蛋白t h b ) 、肌红蛋白( m b ) 、乳酸脱氢酶( l d h ) 和辅酶( n a d ) 固定在纳米金胶的仿生功能界面，实现了氧化还原蛋白质和酶的直接电化学，研 制出了一氧化氮、乳酸、过氧化氢等第三代生物传感器，研究表明纳米金胶的引 入能够明显地提高传感器的灵敏性，使检出限浓度降低。c r u m b l i s s 等已报道了 基于酶标记的胶体金电沉积在导电基质( 铂或玻碳电极) 生物传感器1 4 7 1 。l i u 等将 纳米金掺杂到包埋肌红蛋白的碳糊电极中构建了无需电子介体的h r p 生物传 9 第一章绪论 感器【4 射。将葡萄糖氧化酶固定在纳米金修饰的碳糊电极表面构制了不需要电子 媒介的葡萄糖传感器也被报道即j 。纳米金颗粒能与疏基结合构成分子自组装膜 ( s a m s ) ，具有很好的生物相容性，b a i 5 0 1 将直径6 n m 的金胶体自组装在功能化 修饰的金电极表面，构造了自组装单分子膜( s a m ) ，研究了纳米金胶在电容型免 疫传感器上的应用，通过电极问阻抗的变化，实现对抗体的监测。其检出限达到 了5 0 n g l 。 人们在研究纳米金胶对电化学生物传感器增强作用的同时，也开展了对其它 纳米金属粒子的研究。c h e n 等人1 5 ”将g o d 吸附在纳米p t 上来修饰碳纳米管电 极，结果表明其稳定性和灵敏度都有明显的改善。唐芳琼等人1 5 2 ，5 3 】将g o d 固定 在纳米银、纳米铜上，也先后得到电信号增强的生物传感器。c a i 等人【矧还研究 了纳米银增强的纳米金标记的d n a 电化学生物传感器，灵敏性提高了两个数量 级，检出限达到了5 0 p m o l l 。 半导体材料( 氧化物) 具有良好的生物相容性【5 5 j 。相比纳米贵金属材料更加廉 价。因此将一些具有生物相容性的半导体氧化物引入电化学生物传感器体系中倍 受关注。纳米n 0 2 颗粒具有高比表面积，很好的生物相容性，相对较高的导电 率等优异的性能，因而被广泛地应用于蛋白质( 如细胞色素c ，肌红蛋白m b ，血 红蛋白h b ，辣根过氧化物酶h r p l 5 6 1 等) 在电极表面的固定化修饰，研究它们在 电极上的直接电化学行为。此外人们还研究了纳米z r 0 2 5 7 1 ，纳米s n 0 2 5 钔，纳米 n b ：0 5 5 9 1 ，纳米f e 3 0 4 6 0 l ，纳米z n o 6 1 】等纳米氧化物颗粒对氧化还原蛋白及酶的 直接电化学作用，以及在电化学传感器中的应用。 1 9 9 1 年i i j i m a 发现了纳米碳管，它优异的物理化学性能引起了人们的关注， 掀起了对典型一维纳米材料纳米管