（应用化学专业论文）β环糊精衍生物手性固定相的制备及分离性能.pdf

摘要 b 环糊精衍生物手性固定相的制备及分离性能 专业：应用化学 导师：章伟光 姓名：罗文军 摘要 手性药物的对映体在人体内的药理活性、代谢过程以及毒性上均存在显著差 异，往往只有某种对映体对疾病有效，而其它对映体则疗效低或无效，甚至有明 显的毒副作用。所以分离和提纯手性药物单一对映体己显得非常迫切。采用高效液相色谱 技术，在手性固定相上直接拆分手性药物是对手性药物纯度分析以及制备单一的手性药物 最重要的方法之一。 首先，采用分步法制备了全苯基异氰酸酯取代b 环糊精手性柱。以6 单取代对甲苯磺 酰一b 一环糊精为原料，与n a n 3 反应合成了6 叠氮b 环糊精；加入苯异氰酸酯，合成得到 全苯异氰酸酯取代b 环糊精；通过s t a u d i n g e r 反应，将全苯异氰酸酯取代8 环糊精键合到 硅胶上去，制备得到全苯异氰酸酯取代b 环糊精键合硅胶手性固定相，并在高压下填装成 色谱柱。采用红外光谱、元素分析、核磁共振、热重对产物进行了表征。 其次，在自制的全苯异氰酸酯取代b 环糊精手性柱上分离了2 4 种手性化合物，并讨 论其分离机理。通过对1 9 种带有结构相似的芳香手性化合物在全苯异氰酸酯取代b 环糊 精手性柱上的分离，结果表明手性分子中苯环上取代基的结构、数目及位置都会对分离效 果有很大的影响。选取了5 种常见的药物和中间体进行分离，表明在本实验室自制的全苯 异氰酸酯环糊精手性柱上有很好的手性分离效果。 最后，讨论了不同硅胶基质及不同的手性选择剂对分离效果的影响。结果表明，在同 等装柱条件下，颗粒大小一样的硅胶越均匀圆滑，最后装填成手性柱的柱效越高，分离效 果也越好；而均匀圆滑度一样的硅胶颗粒，颗粒大小为3 # m 的色谱柱比取m 的色谱柱有 更好的柱效和分离效果。在硅胶上键合不同的手性选择剂，会对手性分离效果有明显的改 摘要 变。选用了手性商品柱d a i c e lc h i r a l c e lo d 和自制的全苯异氰酸酯环糊精手性柱进行分离 比较，结果表明自制的全苯异氰酸酯环糊精手性柱对某些手性化合物有着更好的分离效 果，而且分析时间能够大大的缩短，可以很大的提高分析效率。 关键词：手性；硅胶；环糊精；全苯异氰酸酯b 环糊精；手性固定相 a b s t r a c t s y n t h e s i sa n ds e p a r a t i o np r o p e r t i e so f ac h i r a ls t a t i o n a r yp h a s e d e r i v e df r o mb - c y c l o d e x t r i nd e r i v a t i v e m a j o r ：a p p l i e dc h e m i s t r y s u p e r v i s o r ：p r o lz h a n gw e i g u a n g p o s t g r a d u a t e ：l u ow e n j u n a bs t r a c t t h es t u d i e so ns e p a r a t i n ga n dp u r i f y i n gs i n g l ee n a n t i o m e r so fr a c e m i cd r u g sh a v ea t t r a c t e d w i d ea t t e n t i o ni nr e c e n ty e a r sb e c a u s et h eh u m a nb o d yw i l li n t e r a c tw i t he a c he n a n t i o m e r so fa r a c e m i cd r u gd i f f e r e n t l yb yas e p a r a t ep a t h w a yt op r o d u c ed i f f e r e n tp h a r m a c o l o g i c a la c t i v i t y t h u s ，t h ep r o d u c t i o no fi n d i v i d u a le n a n t i o m e r sh a sb e c o m em o r ea n dm o r ei m p o r t a n t c h r o m a t o g r a p h i ce n a n t i o s e p a r a t i o no nc h i r a ls t a t i o n a r yp h a s e s ( c s p ) r e p r e s e n t so n eo ft h em o s t d i r e c ta n df a c i l ea p p r o a c h e sf o rt h ed e t e r m i n a t i o no fe n a n t i o m e r i cp u r i t ya n dt h ep r e p a r a t i o no f p u r ee n a n t i o m e r i cd r u g s f i r s t l y , t h ep e r p h e n y l c a r b a m o y l a t e d1 3 - c y c l o d e x t r i nc s pw a sp r e p a r e ds t e pb ys t e p i nt h e p r o j e c t ，m o n o - 6 一a z i d o - 6 - d e o x y 一1 3 一c y c l o d e x t r i n w a s s y n t h e s i z e db y s t a r t i n g m o n o - 6 - d e o x y - 6 一( p t o l y s u l f o n y l ) 一b - c y c l o d e x t r i nr e a c t i o nw i t hs o d i u ma z i d e ，t h e nr e a c t i o nw i t h p h e n y li s o c y a n a t e a f f o r d e d p e r p h e n y l c a r b a m o y l a t e dm o n o 一6 - a z i d o 一6 - d e o x y b - c y c l o d e x t r i n t h e r e a f t e r , i m m o b i l i z a t i o no fp e r p h e n y l - c a r b a m o y l a t e dm o n o - - 6 - a z i d o - - 6 - d e o x y - - 1 3 - c y c l o d e x t r i n o n t ot h es u r f a c eo fa m i n i s e ds i l i c ag e lu n d e rm i l dc o n d i t i o n sb ys t a u d i n g e rr e a c t i o na f f o r d e d p e r p h e n y l c a r b a m o y l a t e d1 3 - c y c l o d e x t r i nc s p a n dp a c k e di ti n t os t a i n l e s ss t e e lh p l cc o l u m n s u n d e rh i g hp r e s s u r e t h ep r o d u c t i o n sw e r ec h a r a c t e r i z e db yl hn m r ，i r ，e l e m e n ta n a l y s i sa n d t g s e c o n d l y ，s e p a r a t i o n o ft w e n t y - f o u rc h i r a l c o m p o u n d so np e r p h e n y l c a r b a m o y l a t e d i i i a b s t r a c r g - c y c l o d e x t r i nc s pw a si n v e s t i g a t e d as e r i e so fn i n e t e e nc h i r a lc o m p o u n d sw i t hp e n y lr i n g w e r ea n a l y z e do np e r p h e n y l c a r b a m o y l a t e dl i - c y c l o d e x t r i nc s p t h er e s u l ti n d i c a t e dt h a tt h e s e p a r a t i o na b i l i t yw a sa f f e c t e db yt h es t r u c t u r e ，p o s i t i o na n dt h en u m b e ro fs u b s t i t u t e dg r o u n p s o nt h ep h e n y l t h e r e a f t e r , s e p a r a t i o no fs e v e r a lr a c e m i cd r u g sa n dr a c e m i ci n t e r m e d i a t eo nt h e c s pi n d i c a t e dt h a tt h ep e r p h e n y l c a r b a m o y l a t e d1 3 - c y c l o d e x t r i nc s pa f f o r d e di nl a b o r a t o r yh a v e ag o o dc h i r a ls e p a r a t i o n f i n a l l y , t h es e p a r a t i o ne f f e c t sa f f e c t e db ys i l i c ag e la n dc h i r a ls e l e c t o rw e r es t u d i e d i tc a n b ed r a wt h ef o l l o w i n gc o n c l u s i o n ：t h es i l i c ag e lw i t h3 mp a r t i c l es i z eo b t a i n e db e t t e re f f i c i e n c y a n ds e p a r a t i o na b i l i t yt h a nt h es i l i c ag e lw i t h 靴mp a r t i c l es i z e t h es i l i c ag e lw i t hs p h e r i c a l s h a p eo b t a i n e db e t t e re f f i c e n c ya n ds e p a r a t i o na b i l i t y t h a nt h es i l i c ag e lw i t h i r r e g u l a r s h a p e d i f f e r e n te n a n t i o s e p a r a t i o np r o p e r t i e sw e r eo b t a i n e do na c c o u n to ft h ed i f f e r e n c e si nt h e s t r u c t u r e so ff u n c t i o n a lg r o u po nt h ec s et h ee n a n t i o s e p a r a t i o no fs o m ec h i r a lc o m p o u n d so n t h ep e r p h e n y l c a r b a m o y - l a t e di - c y c l o d e x t r i nc s ph a v eb e t t e rs e p a r a t i o ne f f e c t sa n dl e s sa n a l y t i c t i m et h a nt h ec o m m e r c i a lh p l cc o l u m nd a i c e lc h i r a l c e lo d ，t h e r e f o r ec a ni m p r o v e dt h e a n a l y t i ce f f i c i e n c y k e y w o r d sc h i r a i ，s i l i c ag e l ，c y c l o d e x t r i n ，p e r p h e n y l - c a r b a m o y l a t e db - c y c l o d e x t r i n ，c h i r a l s t a t i o n a r yp h a s e i v 华南师范大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论 文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文 的研究做出重要贡献的个人和集体均已在文中以明确的方式标明。 本人完全意识到此声明的法律结果由本人承担。 论文作者签名：可乏弓 j t 日期：力侈矽年月名日 学位论文使用授权声明 本人完全了解华南师范大学有关收集、保留和使用学位论文的规 定，即：研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属华南师 范大学。学校有权保留并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电 子版和纸质版，允许学位论文被检索、查阅和借阅。学校可以公布学 位论文的全部或部分内容，可以允许采用影印、缩印、数字化或其他 复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的论文在解密后遵守此规定) 保密论文注释：本学位论文属于保密范围，在年后解密适用 本授权书。非保密论文注释：本学位论文不属于保密范围，适用本授权 书。 论文作者签名：、罗友争 日期： 彩年石月易日 f 翩虢幸 日期：矽多年月多曰 第一章绪论 第一章绪论 手性( 英文名c h i r a l i t y 源自希腊文c h e i r ，手或者h a n d e d n e s s ) 是用来表达化 合物分子由于原子的三维排列引起的结构不对称性的术语。人的手是不对称的， 左手和右手相互不能叠合，彼此是实物和镜像的关系，如图1 1 。这种关系在化 学中称为“对映关系”，具有对映关系的两个物体互为“对映体”。“手性 这一术语 形象而又科学地表达出化合物分子间的对映关系。饱和碳原子具有四面体结构， 如果连接了四个不同的原子或基团，那么形成的分子就具有手性性质，这个碳原 子就称为手性碳原子或手性中心。此外，分子中的硫原子、磷原子等也可能成为 手性原子。 图1 1 一对手性分子的立体化学结构 由于自然界生命体存在的手性属性，也就产生了药物的手性问题。严格地说， 手性药物是对分子结构中存在手性因素的药物而言。但是通常，手性药物是指具 有药理活性的手性化合物组成的药物，其中只含有效对映体或者以含有效的对映 体为主。就物理化学性质而言，手性药物对映体之间的区别仅仅是旋光性的不同， 其他均无区别，故而对映体也称作光学对映体。能使偏振光的偏振面按顺时针方 向旋转的对映体称为右旋体( d e x t r o i s o m e r ) ( 药名前加( + ) 或d 表示) ；反之， 称为左旋体( 1 e v o i s o m e r ) ( 药名前加( ) 或l 表示) 。药物的药理作用是通过与 体内的大分子间严格的手性识别和配对而实现的。在许多情况下，对映体在生物 体内的药理活性、代谢过程、代谢速率及毒性等均存在显著的差异，这就可能存 在以下不同情况【l 2 1 ： 只有一种对映体有活性，而另一种无显著的药理作用。例如沙丁胺醇1 ， 和特布他林2 是两个支气管扩张药物，它们的r 构型药效分别比s 构型强8 0 - - 2 0 0 倍。又比如，l 多巴4 是治疗帕金森病的药物。它实际是一种前药，进入体内后 在酶的作用下进行脱酸成为起作用的多巴胺。体内酶的作用是专一性的，只对左 第一章绪论 旋体发生脱羧作用，而对右旋体是无作用的。 两个对映体具有等同或者相近量的同一药理活性。在这种例子中，如果毒 副作用也相差不大就没有必要使用单一的对映体纯的化合物，例如盖替沙星6 。 两个对映体具有完全不同的生理活性。例如右旋丙氧吩是一种镇痛剂，而 其左旋体则是一种止咳剂，两者表现出完全不同的生理活性，又如t i m o l o l8 的 s 构型是b 阻断剂，而其r 构型则用于治疗青光眼。 两个对映体中一个有活性，另一个不但没有活性，反而有毒副作用。最出 名的例子当属t h a l i d o m i d e5 悲剧。在2 0 世纪6 0 年代，镇静药物肽胺哌啶酮( 反 应停t h a l i d o m i d e5 ) 是以两个对映体的混合物( 消旋体) 用作缓解妊娠反应药物 的。但后来发现在欧洲曾有服用此药物的孕妇产下四肢呈海豚状的畸形儿，成为 震惊国际医药界的悲惨事件。随后的研究表明，肽胺哌啶酮的两个对映体中只有 ( r ) 对映体具有镇静作用，而( s ) 对映体是一种强力致畸剂，会导致胎儿畸 形；近期研究还表明，问题还涉及体内消旋化等复杂问题。这样的例子还有很多， 例如e t h a m b u t o l9 的一种构型用于治疗结核病，而另一种构型却是致盲的，对于 这种情况尤应特别谨慎。 对映体中两个都有相近的活性，但是从全面平衡仍宜选用单一异构体。如 o m e p r a z o l e3 的两个异构体对治疗胃溃疡的活性相差不多，但是对消旋体个体差 异较多，而s 异构的差异小，而且治疗指数也高，因而发展了单一异构体药物 p e r p r a z o l e 。 对映体中，一个有活性而另一个不但没有活性而且发生拮抗作用。在黄皮 酰胺的研究中发现左旋异构体有明确的促智作用，而右旋体无促智作用反而抑制 l t p 作用，左旋体的促智作用是消旋体的1 0 倍。 综上所述，由于以上诸多情况的出现，对手性药物的应用，应该注意不同异 构体的药理作用，并最好以单一异构体的形式应用。这些事实表明，手性药物的 研制和生产在临床上起着十分重要的作用。 在目前市场销售的化学药物中，约有7 0 是消旋药物。其中大部分对映体的 疗效及药物动力学的差别远未被认识和深入研究。而许多手性药物各对映体的生 物活性差别显著，并可能产生严重的后剁3 1 。1 9 9 0 年美国食品药物管理局做出政 策性规定：今后凡研制具有不对称中心的药物，必须对其各个对映体进行分别测 2 第一章绪论 定和评价【4 1 。对于已上市的消旋体药物，如果制药公司能够使得其单一对映体药 物上市，则可使该药的专有权延长几年。可见，新的规定和条款对新药研究与开 发中单一手性化合物的分离提出了迫切的要求【5 1 。 1 1 手性化合物的分离 对映体的存在是自然界的一种普遍现象，在有机化学、生物化学及药物化学 领域尤为常见。然而这些对映体大多以外消旋体的形式存在。外消旋体是由相等 数目的对映分子组成的。在气态、液态，以及在溶液中，外消旋体通常是理想的 或近理想的混合物。因此，在这些状态下，除了对偏振光所呈现的性质不同之外， 外消旋体和纯对映体应当具有相同的性质。例如，它们具有相同的沸点、折射率、 液态密度和红外吸收光谱。然而，在晶态的情况下，对映体分子之间的晶间力的 相互作用是有明显差别的。一个( + ) 分子对另一个( + ) 分子的关系，虽然 相同于一个( 一) 分子对另一个( 一) 分子的关系，但是( 一) 。分子和( + ) 分子之间的关系却不相同。为了获得单一光学活性手性化合物就需要对外消旋 体进行分离【6 l 。外消旋体分离是指将一个外消旋体的两个对映体分开，使之成为 单一对映体。外消旋体的分离主要分为五类，包括直接结晶分离法、化学分离法、 微生物或酶作用下的分离、手性膜分离法和色谱分离澍7 。9 】。 1 1 1 结晶法分离 若外消旋体所形成的晶体是外消旋混合物，则可直接在其过饱和溶液中加入 单一对映体晶种进行诱晶得到该对映体。依加入晶种方式的不同，可分为同时结 晶和有择结晶两类。同时结晶是在过饱和溶液两个区域分别加入相反手性的晶 种，同时得到两种对映体结晶。有择结晶是轮流加入两对映体晶种以更迭诱导其 结晶。 1 1 2 化学分离法 外消旋体中的两种对映体具有完全相同的能焓，只有当它们与手性试剂作用 时才会表现出不同的化学性质。而化学分离法就是通过化学反应的方法，用手性 试剂将外消旋体中的两种对映体转化为非对映异构体，然后利用非对映异构体之 3 第一章绪论 间的物理性质和化学性质都不同的原理进行分离，再将衍生物还原为纯对映体。 我国手性药物的工业生产多采用此方法，它是一种非常适合于酸、碱物质的传统 分离方法，对外消旋最终产物或消旋中间体进行分离，通常是用光学纯的分离试 剂形成非对映异构体盐进行分离。分离实验的成功关键是选择合适的分离剂和溶 剂。合适的分离剂必须具备以下条件：a 、必须容易与外消旋体中的两个对映体 结合生成非对映异构体，经分离后，又容易再生出原来的对映体化合物：b 、所 形成的非对映异构体至少二者之一能形成好的结晶；c 、分离剂应当尽可能达到 旋光纯：d 、分离剂必须廉价易得，或可方便地回收。化学分离法的操作方法是 大多数化学工作者都比较熟悉，容易操作的，在许多情况是行之有效的，因此这 种方法至今仍然是普遍采用的重要拆解方法。 1 1 3 微生物或酶作用下的分离 酶的活性中心是一个不对称环境，有利于识别消旋体，在一定条件下，酶只 能催化消旋体中的一个对映体发生反应而转化为另一种化合物，从而使两个对映 体得以分离，反应产物的对映体过剩率可达1 0 0 。因此，用催化效率高、专一 性强的酶分离消旋体是获取光学纯化合物的一条重要途径。目前，绝大多数氨基 酸都能用酶法分离达到到光学纯度，此法已经应用于许多常用的氨基酸的大规模 生产。例如【广泛内酰胺，s 布洛芬等等许多药物都可以用酶法从其对应的消旋体 获得【1 0 l 。但如果想要获得较高纯度的单一对映体，则需要较长的生产周期，选择 有效的酶也十分困难。此外，许多酶的价格也十分昂贵。在工业上，酶法分离仍 然主要应用于氨基酸的生产。 1 1 4 膜分离法 又可分为液体膜分离法和手性固体膜分离法。前者基于选择性萃取，后者基 于对映体间亲和性的差异。从大量制备的角度看，膜法具有优势，但目前选择性 和效率还比较差。 1 1 5 色谱分离法 色谱法是指利用手性对映体与固定相之间不同的相互作用力，在流动相洗脱 4 第一章绪论 时具有不同的保留时间这一原理达到分离手性对映体的目的。利用色谱法分离物 质的装置有许多种，例如薄层层析、气相色谱、高效液相色谱、制备色谱、模拟 移动床、毛细管电泳等，它们的基本原理完全一样，只是实现的方法、分离能力、 分离精度和使用范围等方面有所不同【1 1 】。在液相色谱中，手性衍生化( c d r ) 法是外消旋体与手性衍生化试剂先反应后再用常规色谱法分离【1 2 】；手性流动相 ( c m p ) 法是将手性试剂加入流动相中用常规色谱柱分离；手性固定相( c h i r a l s t a t i o n a r yp h a s e s ，简称c s p ) 法是利用手性固定相直接分离对映体，这种方法在 液相色谱中更具优势。手性固定相色谱的优势在于：1 ) 可用于多种外消旋体的分 离；2 1 可以同时高收率地得到两种高旋光纯度的对映体：3 ) 口- i n 分离一些特殊的 外消旋体( 如不能衍生化或易消旋的化合物，具有特殊手性结构如螺旋或螺旋桨 构象的化合物) ；4 ) 口- t 实现大量制备。色谱法作为一种分离检测手段，可用于测 定分子量很低的常量或痕量物质，又可分离分子量很大的天然或合成物。还可分 离性质相近的同位素、同分异构体、空间异构体或光学异构体等，由于它的快速、 准确、操作方便等优点，巳经受到广泛重视。色谱的重要性首先在于它使性质上 非常相近的物质分离成为可能，这一点正是近代化学、生物学研究与发展中极为 重要和不可缺少的手剐1 3 j 。 综上所述，外消旋体分离方法各有其特点和适用对象。结晶法利用两种对映 体的结晶形态不同，直接进行结晶机械分离，此法生产效率低，只适用于极少数 产品的生产；化学衍生法分离利用手性试剂与两种对映体形成复合物的热力学和 动力学、反应能力、反应速度、物理性质不同进行合成或分离，缺点是需要较纯 手性试剂，但由于具有操作方便简单、原料廉价、处理量大等好处，所以现在工 业上已有许多应用；微生物或酶作用下的分离的反应参数必须精确控制，如温度、 p h 值、离子强度等，这些参数的变化范围较小，一旦变化幅度超过它们的允许 值，将会引起酶或微生物的活性丧失；膜分离法具有低能耗、连续生产的特点， 有良好的应用前景，但是该技术的研究才刚起步；色谱分离法由于能提供高效的 分离、灵敏的检测、快速的分析，而且操作简便，即能用于微量组分的分析测定， 又能用于制备分离，灵活多样，其应用范围已超过其它各种分离方法，尤其在生 化医药样品的分析分离方面更能充分发挥它的特长，其缺点是需要手性分离介 质，处理量小，成本高。 5 第一章绪论 1 2 手性固定相的研究现状 多年来用于色谱分离的手性固定相( c s p ) 已有1 0 0 多种，大致分为蛋白质键 合相、环糊精类键合相、大环类键合相、冠醚键合相、合成手性聚合物键合相、 p i r k l e 型手性固定相及其它一些手性固定相【1 4 】。一个有效的手性固定相，应能快 速准确测定对映体纯度，尽可能适应多种类型对映体分离；对一系列结构相似的 手性化合物，其d 、l 或r 、s 对映体洗脱顺序基本不变；可提供绝对构型信息； 应有较高对映体分离选择性( a 1 2 ) 和柱容量；具有制备分离能力。而迄今为止， 还没有一种c s p 都能满足上述五方面的要求。 合成的手性固定相可以分为“协同型”和“独立型”两大类。“协同型”c s p 手性 识别决定于次级结构单元协同作用，次级结构单元本身也可以是手性的。如纤维 素、蛋白质、合成手性高分子等。这类固定相手性识别机理比较复杂，与其超分 子结构有关【1 5 】。“独立型”c s p 的每个键合手性分子具有独立手性识别能力，大多 可用d a l g l i e s h 三点作用规律解释。固定相分子设计，对映体洗脱顺序一般可从 理论上预测，并可提供溶质绝对构型的有关信息【1 6 】。 目前，国际上发展的高效液相色谱手性固定相( h p l c c s p ) 若按照填料的类 型可以分为以下两大类。 1 2 1 多糖衍生物手性固定相 纤维素是d ( + ) 一葡萄糖单元由1 ，4 一糖苷键形成的高度有序、呈螺旋空穴结 构的光学活性天然高分子。它可以制成凝胶直接作为c s p 分离某些对映体并获 得了一定的成功。在手性h p l c 中，纤维素及其衍生物大多涂渍在微粒硅胶载体 上【1 7 1 ，也有化学键合在硅胶表面【1 8 】。h e s s e 等制备了微晶纤维素等三乙酸酯 ( c t a ) ，o k a m a t o 小组成功的发展了第一个商品化的以硅胶为载体的c t a c s p 柱，并继续开发出一系列纤维素衍生物c s p 。已报道分离氨基酸、醇、酮以及各 种手性药物的8 0 8 5 是使用o d ，o j 两种固定相。 1 2 2 蛋白质手性固定相 蛋白质手性固定相能分离广泛的不同类型外消旋体，是手性药物h p l c 分离 中最具吸引力的c s p 之一【1 9 1 。交联蛋白质对有机溶剂具有高抗去活能力，因其 6 第一章绪论 c s p 带电荷且具疏水性，因而常常采用与普通液相色谱类似的流动相。流动相的 组成，包括缓冲液p h 值、离子强度、有机改性剂性质和浓度是影响溶质保留和 分离选择性的因素【2 0 】。蛋白质c s p 分离条件的优化一般相当困难，不仅流动相 对蛋白质c s p 次级结构立体活性点之活性的影响非常敏感，而且不同的键合技 术可能造成蛋白质络合到不同的微环境，以致改变其手性选择性。疏水效应、氢 键形成、电荷性质、立体效应、温度等因素将影响其手性选择性。由于蛋白质 c s p 超分子结构相当复杂，对其分离机理知之甚少，而且这类c s p 样品容量低， 价格昂贵等在一定程度上也妨碍了这类c s p 的普遍应用。但这类c s p 的特殊对 映体选择性，若采用一般反相色谱操作条件，多种外消旋体，包括许多药物，也 能在蛋白质c s p 上分离。 1 2 3 大环类手性固定相 1 9 9 4 年，美国a r m s t r o n g 实验室首先报道了采用这三种大环物质：糖肽类( 万 古霉素v a n c o m y c i n ，硫链丝菌素t h i o s t r e p t o n ) 和柄状霉菌素类( 利福霉素 s v r i f a m y a i ns v ) 抗生素作为手性选择剂，制备的h p l c c s p 具有广泛的手性分 离能力。而且这种手性固定相与环糊精类手性固定相相似，既可在正相色谱和反 相模式下使用，又可在极性有机溶剂为流动相的模式下使用。近年来，大环抗生 素己成功地应用于h p l c 【2 ，t l c 2 2 1 、毛细管电泳( c e ) 【2 3 , 2 4 】，g c ，和超临界流体 色谱( s f c ) 【2 5 1 ，等技术来进行手性分离，显示出高效、高选择性等优势。大环抗 生素一般为多手性中心、多官能团的化合物，可通过多种手性识别机制进行手性 识别，是一种高效的手性选择剂。 1 2 4 手性冠醚键合固定相 与金属离子、氨阳离子等形成主客体包结络合物是冠醚的重要特性。g r a m 等首次合成手性冠醚用于分离光学异构体，手性识别主要基于其“空穴”的主一 客体络合和氢键作用。冠醚主体一般是取代联蔡衍生物，它们可键合到硅胶或聚 苯乙烯基质上。目前，此类c s p 品种还极其有限，主要用于分离胺、氨基酸及 其衍生物对映体【2 6 1 。 7 第一章绪论 1 2 5 环糊精类手性固定相 1 8 9 1 年，v i l l i e r 发现了环糊精( ( c y c l o d e x t r i n ，简称c d ) 并将其命名为 ”c e l l u l o s i n e ”。1 9 0 3 年s c h a r d i n g e r 用分离的菌株消化淀粉得到了两种晶体化合物， 为了区别，把与碘碘化钾反应生成蓝灰色的晶体叫做a 环糊精( a c y c l o d e x t r i n ) ， 生成红棕色的晶体的叫做b 环糊精( b c y c l o d e x t r i n ) 。早期环糊精化学只涉及到催 化高选择反应、酶类催化反应和不对称催化反应。随着科学技术的不断发展，各 种研究手段的不断推陈出新，近期环糊精成为构筑超分子的重要主体，以及认识 各种有机、无机客体被环糊精或修饰环糊精包合的性质和控制超分子互相作用的 因素。可以预见，未来环糊精化学以传统的物理方法与现代技术相结合，建立和 完善时间分辩光谱仪、高分辨率电子显微镜和隧道电子显微镜以及计算机化学等 研究方法，将有助于在更深层次上认识由环糊精、修饰环糊精及其类似物所进行 的识别与结合的本质。 环糊精又名s c h a r d i n g e r 糊精、环聚葡萄糖，是由环糊精葡萄糖残基转移酶 ( c y c l o d e x t r i ng l y c o s y lt r a n s f e r a s e ，c g t a s e ) 作用于淀粉、糖原、麦芽寡聚糖等葡萄 糖聚合物，而形成的由6 1 3 个d 毗喃葡萄糖基以a 1 ，4 葡萄糖苷键连接而成的环 状低聚糖。a c d ，b - c d ，) - c d 结构表达式如图1 2 所示。 c c c - c dp c d 8 y - c d 第一章绪论 垮由啊池 图1 2 环糊精的分子结构 在环糊精的分子结构中，由于葡萄糖的2 位和3 位仲羟基位于截锥体的下面 端口和外部，6 位的伯羟基位于截锥体的上面开口，使环糊精分子外部亲水：同 时6 位的c h 2 和葡萄糖结合的氧原子排列在空隙的内部，呈疏水性。这种性质 与表面活性剂相似，故可起乳化剂的作用。环糊精的主要特性是其疏水空洞内可 嵌入各种有机化合物，从而形成稳定的络合物。a 、p ，) ，三种环糊精均为白色结 晶粉末，无一定熔点，加热到约2 0 0 开始分解。三种环糊精的结构相似，但三 者间的水溶解度、穴洞大小等差别很大( 见表1 1 ) 表1 1 环糊精的物理和化学性质 9 第一章绪论 1 9 8 3 年，f u i i m u r a 2 7 】和s h o n o 2 8 】等首次通过氨或酰胺键将c d 键合到硅胶表 面。c d 键合固定相可用于正相和反相两种色谱体系。正相色谱体系最常用的溶 剂是正己烷、异丙醇混合物，其他烃、卤代烃、醇类亦可选用。反相色谱体系流 动相主要是水溶性有机溶剂如甲醇、乙腈、d mf 、t h f 与各种缓冲液的混合物。 在反相色谱中，其保留和立体识别机理是溶质在c d 空穴中的包容络合及溶质 与c d 空穴边缘c 一2 、c 一3 上羟基的氢键作用。这两种作用必需同时提供手性 识别所需要的三个能量以上的不同作用点。在正相色谱体系，其有机分子占据 c d 空穴，溶质不容易形成包容络合，未能观察到对映体选择性。至今，手性分 离主要采用反相体系，而正相体系常用于结构异构体及胡萝b 素的分离。 1 2 6 配体交换色谱( l e c ) 手性固定相 氨基酸对映体的分离可采用气相色谱和液相色谱法，但通常需要进行柱前样 品衍生化，衍生过程不仅费时麻烦，而且有可能使被分析物发生消旋，从而影响 分析结果。配体交换色谱( l e c ) 手性固定相分离对映体是基于手性配体、中心金 属离子与被分离溶质形成的多元配合物热力学稳定性的差异和动力学的可逆性。 由d a v a n k o v 等人于2 0 世纪7 0 年代早期发展起来的手性配体交换色谱法( c l e c ) ， 是分离手性化合物，特别是氨基酸和羟基酸对映体的一种有效方法，其选择性高， 不需要进行柱前衍生化。d a v a n k o v 首次将脯氨酸键合到苯乙烯二乙烯苯树脂上， 通过流动相引入铜离子形成铜离子配合物，用c l e c 分离了氨基酸对映体，但由 于机械强度较差的原因而难以满足高效液相色谱( h p l c ) 的需要。适用于h p l c 的硅胶键合手性配体交换色谱固定相( l e c c s p ) 是由g f i b i t z 等人发展起来的，与 以聚合物为载体的手性固定相相比，它具有耐压、高效等优势【2 鲥。 1 2 7 “印渍”技术手性固定相 手性分子“印渍”技术，即在聚合过程中加入一个适当模式分子，然后从聚合 物中出去模式分子，留下一个“形状选择性”空穴，形成适用于空穴立体选择的聚 合物。1 9 7 2 年w u l f f 利用酶和抗体具有分了形状、空间结构选择性等特点，首次 人工合成了用于色谱手性分离的分子印迹聚合物。基于该技术制备的分了印迹聚 合物具有构效预定性、亲和性和选择性高、稳定性好、应用范围广等特点广泛 1 0 第一章绪论 用于手性物质分离、仿生传感器、固相萃取、抗体模拟、酶催化模拟及控释药物 等领域中【3 0 1 。 1 3 环糊精类手性固定相研究进展 天然的环糊精存在某些缺点：其一是它的孔径太小，对所能包合的分子大 小有所限制；其二是b 环糊精具有7 个葡萄糖单位，比较有利于包合作用，但溶 解度太小，限制了其运用；其三，丫环糊精有8 个葡萄糖单位和约8 a 的内径， 虽具最明显的优点但事实上不能大量生产，因此不可能在工业上应用；其四，天 然环糊精能拆分的药物和外消旋体有限；其五，天然环糊精熔点高，成膜性能较 差。所以有必要对环糊精进行修饰使其能够更好的应用。修饰环糊精( m o d i f i e d c y c l o d e x t r i n s ) 是指在保持大环基本骨架不变的情况下引入取代基，修饰后的环糊 精随取代基的不同，性质也各有不同。环糊精衍生物具有以下优点引入基团增 加水溶性，特别是包结物或超分子复合体的水中溶解度；在结合位附近构筑立 体几何关系，形成特殊的手性位点；进行三维空间修饰，扩大结合空腔或者提 供有特定几何形状的空间，以与底物或客体分子有适宜的匹配；引人特殊基团， 构筑有特殊功能的超分子和自组装成超分子聚集体；引入特殊原子或基团，构 筑研究弱作用力模型；融入高分子结构，获得有特殊性质的新材料。 1 3 1 环糊精类手性固定相的制备 根据环糊精键合到硅胶上方式的不同，环糊精类手性固定相的合成方法有以 下两种：一是首先在环糊精上接上适当长度的空间臂，再将空间臂的另一端键合 到硅胶上；二是首先将空间臂键合到硅胶上，然后在空间臂的另一端接上环糊精。 如图1 3 法一2 手性选择剂一环糊精兰望旦( 一潲骂手性固定相手性选择剂一环糊精( 结合体) 斗丁i 土凹肥r h 法二：硅胶壁堑l f c i h 取代基c f 3 、f 、c i 是吸电子基团，属于p 酸，而苯基异氰酸酯取代b 环糊精手 性固定相是属于p 碱，所以引入取代基c f 3 、f 、c l 的手性化合物会增强和固定 相之间的p - p 相互作用，分离效果因此比1 号样好。 而在反相条件甲醇一0 1 的醋酸_ - - 7 , 胺缓冲液( 7 0 3 0 ，v v p h = 4 0 ) 下，这四 种化合物没有分离效果。同样也可能因为n h c o o ( c h 3 ) 在手性化合物分子结构 上向外扩展，可能会导致不容易进入b 环糊精的空腔，所以分离效果不是太好。 3 2 3 2r l 为o h 的手性化合物取代基飓不同对分离效果的影响 在条件1 、条件2 下，对5 , - - + 7 号手性化合物进行了分离比较，分离谱图如下： 表3 45 - 7 分离数据 4 3 第三章全苯异氰酸酯环糊精手性固定相的手性分离性能 5 i ： i ： ，八， ： ： # o ： n 确5 l 一 ： ： u n 。k 。 k 1 = 4 6 8 0k t = 4 2 2 7 ，k 2 = 5 8 8 3 ， 不能分离 q = 1 3 9 2 ，r s = 2 8 7 4 6j a 飞 5 i人 彳 k 人n 八i 一八 月 1 1 1 1 - - k ，-7 。一。 o h 一、 k 1 = 5 5 3 3k l = 1 5 4 8 ，k 2 - 2 - 0 7 3 ， 不能分离、q = 1 3 3 9 r s = 2 0 9 0 7 k 1 = 8 1 8 3 不能分离 k l = 2 3 4 1 ，k 2 = 3 9 5 0 q = 1 6 8 7 r s = 3 8 8 3 由表3 4 可知，手性化合物5 7 在反相条件甲醇一o 1 的醋酸三乙胺缓冲液 ( 7 0 3 0 ，v v p h = 4 0 ) 下的分离效果都达n - ；2 以上，7 号样的分离度甚至达到 了3 8 8 3 ，具有很好的分离效果。这可能是由于带有取代基一o h 的手性化合物5 7 和b 环糊精内腔能够很好的形成包结配合物，所以能够在条件2 下达到很好的 分离效果。 同时我们发现，在反相条件甲醇一o 1 的醋酸三乙胺缓冲液 ( 7 0 3 0 ，v v p h = 4 o ) 下能够分离的5 7 三种手性化合物中，取代基的不同对分 离有很大的影响，三种手性化合物的分离度递减顺序如下： ( r 3 = ) c f 3 h c h 3 这也因为c f 3 是一个吸电子基，属于p 酸，7 号样增强了和属于p 碱的苯基异氰 酸酯取代b 环糊精手性固定相之间的p - p 相互作用，所以分离效果比5 号样好； 而一c h 3 是供电子基，属于p 碱，6 号样削弱了和属于p 碱的苯基异氰酸酯取代b - 环糊精手性固定相之间的p - p 相互作用，因此比另外两个样的分离度都低。 q c u 嗯 第三章全苯异氰酸酯环糊精手性固定相的手性分离性能 在正相条件正己烷一异丙醇一醋酸( 9 0 1 0 0 1 ，v ，、，v ) 下，3 种化合物都没 有分离效果。这可能是因为，取代基r 1 是o h 的手性化合物与手性固定相之间 的p - p 相互作用和氢键作用相对比较弱，所以在该条件下不能获得分离。 3 2 4 取代基在芳香基上的取代位置的不同对分离的影响 3 2 4 1 在正相中的分离效果 在条件2 下，对1 0 种苯环上取代基位置不同的手性化合物进行了分离比较， 分离谱图如下： 表3 5 在正相条件下的分离效果 分离数据 s n化合物流动相 分离结果色谱图 a a 一 k l = 1 8 5 0 2 絮百。篙，k 篡2 = 2 0 0 0 , ；一 。 k 。 灸冬k ，= 1