（外科学专业论文）神经碎片联合nt3修复陈旧性周围神经缺损的实验研究.pdf

神经碎片联合n t - 3 修复陈旧性周围神经缺损的实验研冤6 9 5 5 i ! i i ! i ! u i i 螋i i e j l j ii jljl 丫17 墨 中文摘要 大鼠4 0 只( 山东大学动物实验中心提供) ，体重2 0 0 9 左右，抓阉法随 、 机分为4 组，每组10 只。行盐酸氯胺酮腹腔麻醉后，于大鼠左股后外侧作 纵行切口，自肌间隙进入并显露坐骨神经约2 5 e r a ，于梨状肌下缘3 r a m 处切 取长约6 r a m 的坐骨神经干，任其自然回缩，制备陈旧性周围神经损伤模型， 四周后分别对四组进行实验。a 组尘理盐水组：切除神经断端增生膨大的神 经瘤，在手术显微镜下以9 0 无创缝合线均匀缝合神经外膜及导管管壁，使导 管内的神经断端相距10 m m ，于部分脱乙酰甲壳质生物套管中注入0 1m l 生 理盐水。b 组神经营养素一3 ( n t - 3 ) 组：同样处理神经断端，导管内注入0 1 m l 神经营养素3 ( 10 u g m 1 ) ；c 组神经片段+ 神经营养素3 组：切取两断端增生 膨大的神经瘤，显微镜下剥离外膜组织，将其切碎至1m i n x1m m x1m m 大小， 取适量片段填充神经导管，9 0 无创缝线缝合管壁与神经外膜后于导管内注 入0 1 m l 神经营养素3 ( 10 u g m 1 ) 。d 组自体神经移植组：切除神经瘤至肉 眼观正常神经，取前足胫神经以9 0 缝线吻合两断端。术后分笼饲养。 结果 实验用大鼠4 0 只，皆进入结果分析。大体观察：陈旧性模型制备后2 周内各组大鼠实验侧足趾均呈并拢状不能着地行走，并出现不同程度肿胀， 无溃疡形成。第3 周各组均出现足部溃疡，手术切口愈合尚好，缝线脱落。 至第4 周a 、d 组各两只及b 、c 组各一只大鼠出现掉趾。第二次术后8 周， 自体神经移植组和神经碎片+ n t - 3 组试验侧足趾均可着地，足部皮肤溃疡愈 合( 图9 ) ，跛行改善，腓肠肌均存在不同程度的肌肉萎缩，其中，自体神经 移植组可引出展趾反射；n t - 3 组和生理盐水组的足趾不能落地行走，且肌肉 1 萎缩相当明显，无展趾反射。第二次术后术后12 周时，自体神经移植组和 神经碎片+ n t - 3 组无论是展趾反射还是腓肠肌形态观察，都有不同程度的改 善，具体表现为跽趾可外展，展趾反射较灵敏：n t - 3 组及生理盐水组的足趾 可落地行走，但展趾反射未引出，并且腓肠肌萎缩显著及足部皮肤溃疡不愈 合。第二次术后12 周神经外膜形成完整，可见n t - 3 组内神经纤维较神经碎 片+ n t - 3 组内再生神经直径细，神经碎片+ n t - 3 组再生神经排列较规则， 无明显增生的纤维组织。自体神经移植组可见移植段神经张力可，活动度无 异常，形态学观察与正常神经无显著差异，其吻合口平滑，并未见周围组织 与其粘连。生理盐水组外观上见吻合口膨隆，与周围较多结缔组织粘连，再 生神经组织迂曲、增生。于第二次手术后l2 周，行肌电图检查、测小腿三 头肌湿重、再生神经纤维行组织学病理切片并分析图像，各检测项目数据以 j s p s sl6 0 进行处理，单因素方差分析后示：各组恢复程度均好于生理盐水组， 其中神经碎片+ n t - 3 组及自体神经移植组的神经功能恢复情况优于n t - 3 组 p 0 0 5 。 结论 ( 1 ) 神经瘤加工后的神经碎片联合n t 3 作为桥接神经导管内的填充物 能够促进陈旧性周围神经缺损的修复。 ( 2 ) 积极进行陈旧性周围神经损伤的修复与治疗具有一定的临床意义。 关键词神经碎片、神经营养素3 、神经缺损、神经导管、组织工程 t h ee x p e r i m e n t a ls t u d yo fn e r v ef r a g m e n t sj o i n n t 一3f o rr e p a i r i n gp r o l o n g e dp e r i p h e r a ln e r v e d e f e c t s p o s t g r a d u a t es t u d e n t ：l i u z h e n r e s e a r c ho r i e n t a t i o n ：s u r g e r y g r a d u a t es t u d e n tt u t o r ：p r o f e s s o rl i b i n g s h e n g a bs t r a c t o b j e c t i v e t oo b s e r v et h en e r v ef r a g m e n t sj o i nn t 一3i n d u c e p r o l o n g e dp e r i p h e r a l n e r v ed e f c t sr e p a i rr o l ef o r t h ec l i n i c a le n c o u n t e rc a s e so fp e r i p h e r a ln e r v e d e f e c t st of i n daw a yo ff e a s i b l er e s t o r a t i o n m e t h o d w i s t a rr a t s4 0 ，m a l e ，b o d yw e i g h t2 0 0 9a r o u n d ，r a n d o m l yd i v i d e di n t o4 g r o u p s ，e a c hw i t h 10 a n e s t h e t i z eb yk e t a m i n ei na b d o m i n a l ，r e v e a ll e f t l e g s c i a t i cn e r v ei ns t e r i l ec o n d i t i o n s ，c u ta p a r tt h en e r v ei nt h ep i r i f o r m i sm a r g i no f a b o u t3 m m ，w h i c hi st h es c i a t i cn e r v es t e ma b o u t6 r a m ，r e t r a c ta st h e i rn a t u r a l g r o u pa ：p h y s i o l o g i c a ls a l i n e ( o 1m 1 ) w a sa d d e di n t ot h eb i o l o g i c a lc o n d u i ta f t e r n e u r o m ab e i n gc u t 9 0n o n - i n v a s i v es u t u r ec l o s u r eo ft h eo u t e rm e m b r a n ea n d c o n d u i tw a l ls ot h a tm a k i n gt h et w oe n d so ft h et u b ef r o m10m m g r o u pb ： n t - 3 ( 1 0 u g m 1 ) w a sa d d e di n t ot h ec o n d u i t g r o u pc ：t h eh y p e r p l a s t i c n e u r o m aw a sc u tt ot h es i z eo fo 5 m m 3u n d e rt h e m i c r o s c o p e a p p r o p r i a t e f r a g m e n t sw e r ef i l l e dc o n d u i t ，9 0n o n - i n v a s i v es u t u r eo u t e rw a l la n dn e u r a l t u b ea f t e ri n j e c t i n g0 1m ln t 一3 g r o u pd ：t h et i b i a ln e r v eo fp r o l e gw a s t r a n s p l a n t e dt ot h ed e f e c ta r e ab e f o r e9 0n o n - i n v a s i v es u t u r i n gt h en e r v e w e s u t u r et h ew o u n d sa n db r e e do n eg r o u pb yo n ec a g e r e s u i t g e n e r a lo b s e r v a t i o n ：r e g u l a ro b s e r v a t i o no fp o s t o p e r a t i v ew o u n da n dr a t g a i tc h a n g e sh a p p e na n dt h eh e a l i n gt i m eo fu l c e r sa n df o o tc h a n g e ；t oo b s e r v e t h ee x t e n to ft h el e f th i n dl i m bm u s c l ea t r o p h y ，j o i n ts t i f f n e s sa n de x h i b i t i o nt o e f l e x i o nr e f l e xs i t u a t i o n ；t h ee s t a b l i s h e de x p e r i m e n t a lo p e r a t i o n w e r ec o m p l e t e da f t e r4w e e k s ，e x p o s e dn e r v ea f t e r12w e e k st oo b s e r v et h ee x p e r i m e n t a l g r o u p ，n e r v er e g e n e r a t i o ns i t u a t i o n ；o b s e r v a t i o no fc o m p a t i b il i t yb e t w e e nt h e 1 c o n d u i ta n ds u r r o u n d i n gt i s s u ei na d d i t i o nt ot h es i t u a t i o no fn e r v ea n a s t o m o s i s t h et u b ew a l lc o l l a p s e ，o rw h e t h e rt w i s tf r a c t u r e ，w h e t h e rn e a ro rf a r s i d e a n a s t o m o t i ce n l a r g e m e n ta n dn e u r o m af o r m a t i o n ，t u b es u r f a c ea v a i l a b i l i t yf o r s u p e r f i c i a lb l o o df o r m a t i o n ，t h ea v a i l a b i l i t yo fs u r r o u n d i n gt i s s u ea n da d h e s i o n s ， t h e i m p r o v e ds i t u a t i o n o fu l c e r sa n dm u s c l e a t r o p h y b yd e t e c t i n ge m g g a s t r o c n e m i u s ，t r i c e p ss u r a em u s c l ew e tw e i g h t ，r e g e n e r a t i v en e r v eb i o p s ys t u d y m i c r o s t r u c t u r ea n di m a g ea n a l y s i s ，t h er e s u l t sw a sa p p l i e dw i t hs p s s16 0f o r o n e w a ya n o v aa n dtt e s t ，p o 0 5f o rs t a t i s t i c a ls i g n i f i c a n c e ，a n a l y s i ss h o w s ： a f t e r12w e e k s ，t h er e c o v e r yo fe a c hg r o u pw e r eb e t t e rt h a ns a l i n eg r o u p ；n e r v e f r a g m e n t s + n t 一3g r o u po fn e u r o l o g i c a lr e c o v e r ya n da u t o l o g o u sn e r v eg r a f t g r o u pb e t t e rt h a nn t - 3g r o u pp 0 0 5 c o n c l u s i o n 1 n e r v ef r a g m e n t sa n dn t 一3 c a nb eu s e da sn e r v ec o n d u i tb r i d g i n gt h e f i l l e rt op r o m o t ep r o l o n g e dp e r i p h e r a ln e r v er e p a i r i n gt h ed e f e c t 2 t h e r ei sac l i n i c a l l ys i g n i f i c a n c et ot r e a tp r o l o n g e dp e r i p h e r a ln e r v e i n j u r ya c t i v e l y k e y w o r d s n e v e rf r a g m e n t ；n t 一3 ；n e v e rd e f e c t ；n e v e rt u b e ；t i s s u ee n g i n e e r i n g 4 英文缩写英文全称 n t - 3 p h b p g a p l g a p l l a l n f n n g f m s c s a d s c s o e c s e c m b d n f c n t f s c s v e g f n e u r o t r o p h i n 一3 p o l y h y d r o x y b u t y r a t e p o l y g l y c o l i c a c i d 符号说明 p o l y l a c t i ca c i d - p o l y g l y c o l i c a c i d p o l y - l l a c t i ca c i d l a n a i n i n f i b r o n e c t i n n e v e rg r o w t hf a c t o r m e s e n c h y m a ls t e mc e l l s a d i p o s et is s u e d e r i v e ds t e mc e l l o l f a c t o r ye n s h e a t h i n gc e l l s e x t r a c l l u l a rm a t r i x 中文全称 神经营养素3 聚羟基丁酸酯 聚羟乙酸 聚乳酸聚羟基乙酸 聚左旋乳酸 层粘连蛋白 纤维连接蛋白 神经生长因子 骨髓间充质干细胞 脂肪干细胞 嗅鞘细胞 细胞外基质 b r a i n d e r i v e dn e u r o t r o p h i cf a c t o r 脑源性神经生长因子 c i l i a r yn e u r o t r o p h i cf a c t o r s c h w a n nc e l l s 睫状神经营养因子 雪旺细胞 v a s c u l a re n d o t h e l i a lg r o w t hfa c t o r血管内皮生长因子 i c a m 1i n t e r c e l l u l a ra d h e r s i o nm o l e c u l a ri细胞内粘附分子i m h c i i m a j o rh i s t o c o m p a t i b i l i t ic o m p l e x主要组织相容性复合体i i ) 刖吾 当前骨创伤外科及显微外科医生面临的最棘手也极具挑战性的难题之 一为周围神经损伤，尤其是陈旧性周围神经缺损，其原因为多方面的，既可 因外伤，也可由肿瘤导致。对于修复周围神经缺损的方法有较高的要求，不 但能有效的恢复神经功能，而且经济实用，推广可行性高。最先用于周围神 经缺损修复的方法为自体神经移植，其修。复效果相对理想，被誉为周围神经缺 损修复的金标准i l 】。但这种方法在临床应用中受到限制，主要是由于供体神 经有限并且伴随供区神经功能障碍等缺点。随着组织工程技术的发展，近二 十年来以组织工程技术修复周围神经缺损日渐成为热门话题，并以其潜在的 临床应用前景，吸引了众多组织材料学，生物工程学及临床工作者参与到研 究当中。 组织工程技术为一门运用生命科学和工程学的原理来研究正常及病变 的哺乳类动物组织结构和功能及其相互关系，开发研制修复损伤组织功能和 形态的生物替代材料的科学技术1 2 】。随着组织工程技术的不断发展，各种神 经导管材料和神经营养因子的深入研究，周围神经缺损修复的临床效果得到 了明显改善。 周围神经的再生理论包括两种：一、神经轴突的接触引导，即周围神 经离断后，轴突重新长入远端的基础不仅仅是实质性细胞条索或结构的接 触，而且要求能引导轴突的生长方向【3 j 。二、神经营养趋化，周围神经离断 后远近端神经间再生轴突的相互吸引作用被称之为神经趋化性，对于神经轴 突间精确的对合起引导作用，这使他们可能成为解决神经轴突再生“迷途”的 钥匙【4 】。正是有了以上理论依据，在研究如何弥补自体神经移植缺陷的基础 上，众多学者开始探讨以组织工程学的方法来诱导周围神经的再生，以期达 到解决周围神经缺损的目的。神经导管材料及其导管内填充物的研究为其核 心内容。 聚左旋乳酸( p o l y - l - l a c t i ca c i dp l l a ) 、聚乳酸( p o l y g l y c o l i ca c i dp g a ) ， 聚氨酯( p o l y u r e t h a n e ) 、聚乳酸聚羟基乙酸聚合物【p o l y ( 1 a c t i c c o g l y c o l i c ) a c i d ，聚羟基丁酸酯p h b ( p o l y h y d r o x y b u t y r a t e ) 、壳聚糖及其合成物、衍 生物等为主要研究材料，这些可降解组织材料中，p l a 、p g a 及两者的共聚 物p l g a 于19 9 9 年首先被美国食品药品监督管理局( f d a ) 批准使用，故此三种 6 材料在临床及科研实验中的应用最为广泛。董红让等1 5 】将聚乳酸( p g a ) 与 神经生长因子制备成神经导管桥接大鼠坐骨神经缺损，实验显示该导管在体 内呈逐步降解吸收过程，与周围组织粘连较轻，术后3 个月组织学观察及电 生理学检测发现该神经导管能够有效的促进神经再生，其修复效果接近自体 神经移植，这说明聚乳酸( p g a ) 作为一种可吸收的组织工程材料，可以用 来修复周围神经缺损。聚羟基丁酸脂( p h b ) - 是一种天然高分子聚合物，为 微生物在不平衡生长条件下储存于细胞内的。生物相容性、生物可降解性、 无刺激性、无毒性以及无免疫原性为其特殊性质，被广范应用于组织工程及 生物医学领域中。对聚羟基丁酸脂多孔材料行表面处理，聚羟基丁酸脂材料 的亲水性及对细胞的吸附力可得到有效的提高，从而为神经修复提供支架。至 于神经纤维的解剖结构和功能的恢复均与自体神经移植的效果接近这一点， 也在有关聚羟基丁酸脂导管复合神经生长因子的动物实验中得到证实【6 】。几 丁质是生物可降解材料导管材料中比较重要的一种，其为天然高分子多糖，从 蟹、虾及昆虫等节肢动物的外壳和藻、菌类等低等植物细胞壁中提取的。甲 壳素经脱乙酰基后得到壳聚糖，为甲壳素的重要衍生物之一，具有无刺激性、 无毒、无抗原性、组织相容性好且可降解吸收等特点，其良好生物学特性为 实验奠定了基础。苟三怀等采用几丁质管作为桥接物来修复周围神经缺损， 显示其效果优于肌桥1 7 】。r o s a l e s 等的研究结果表明，壳聚糖不但可作为导管 材料用于周围神经损伤的修复，而且不会引起机体的排斥反应。之所以具有良 好的应用前景，还在于其具有可降解性，降解产物无毒、不聚积、无免疫原性， 可以抑制成纤维细胞的生长，具有防止瘢痕形成的效果。基于生物型可降懈 材料的以上优点，北京大学人民医院和中国纺织科学院共同发明的一种部分 脱乙酰甲壳质生物神经套管，其载体为海藻酸纳水溶液，使神经生长因子附 着于部分脱乙酰甲壳质套管的管壁，后经固化得到含药物型生物神经套管， 其桥接修复周围神经损伤的作用在研究中得到肯定1 8 】。本实验采用此部分脱 乙酰甲壳质生物套管联合n t - 3 进行陈旧性周围神经损伤的研究。 随着对神经导管等组织工程学研究的不断深入，人们逐渐提出理想的神 经导管应具有以下特点：其降解性要良好，并且降解物无毒性；生物组织 相容性佳；神经导管的结构需有利于轴突的再生和雪旺氏细胞的粘附和迁 移，从而使神经导管内雪旺氏细胞有序地排列；具备一定的机械强度和较好 的可塑性；为使导管内外物质能够顺利进行交换，其管壁良好的通透性尤 为重要；易于加工。为了修复受损神经，制作出理想的神经套管，一种、多 种材料或多种材料复合神经营养因子所制成的复合神经套管被反复实验研 究。研究的同时，对其认识亦不断地提高，总结出在选择神经导管材料同时，重 视神经导管内良好“微环境”的构建也十分重要。其中复合外源性神经营养因 子就是一种应用较多、效果较好的方法。神经营养因子种类繁多，对于维持受 损后神经细胞的存活和再生起着不可忽视的作用。 周围神经损伤修复的研究中，神经营养因子( n e u r o t r o p h i cf a c t o r sn t f s ) 作为一类神经生物活性物质，在神经修复过程中起重要作用。其主要由神经 膜细胞及神经末梢分泌，相应的胞体接收到由轴突逆行传输到神经元的神经 营养因子，促进轴突再生和髓鞘化。已经被发现f l 勺n t f s 共2 0 多种，其化学结 构、分子量皆己明确，既可从动物体内提取，少数也可人工合成，其中部分神经 营养因子已经应用于临床当中并取得良好的效果。n t f s 作为机体产生的一 类多肽分子，具有特殊神经营养活性，可通过与靶细胞表面特定的酪氨酸激酶 受体结合发挥作用。概括来讲具有以下功能：调节神经元的发育阻止 成体神经元损伤后继发死亡促进神经元的修复、轴突的再生、调节突触 的可塑性等。根据n t f s 受体的不同，可分4 个大类：神经营养素，包括神 经生长因子( n e r v eg r o w t hf a c t o rn g f ) 、脑源性神经营养因子( b r a i nd e r i v e d n e u r o t r o p h i cf a c t o rb d n f ) 、神经营养素一3 ( n e u r o t r o p h i n 一3n t - 3 ) ，以及源自 非哺乳动物的神经营养素6 ( n e u r o t r o p h i n 6n t - 6 ) 和神经营养素7 ( n e u r o t r o p h i n 7n t - 7 ) 。各营养素间存在多个氨基酸同源，并可与p 7 5 低亲 和力受体结合，但是其表达时间、部位以及生物学效应等方面还是存在一定差 异。神经细胞分裂素：主要包括睫状神经营养因子( c i l i a r yn e u r o t r o p h i c f a c t o rc n t f ) 、白介素1 、3 、6 ( i n t e r l e u k i n 一1 ，3 ，6 i l 1 ，3 ，6 ) 等，其中c n t f 研究较多，具有代表性。最初是在小鸡眼球提取物中取得的，因其具有促进鸡 胚睫状神经节神经元存活的功能而得名。c n t f 的结构及信号转导方面不同 于神经营养素家族其他成员，但与神经营养素在生物特异性方面有交叉。成 纤维细胞生长因子，属非靶源性n t f s ，是一类具广泛生物活性的肽类物质。 f g f 家族至少包括21 个成员，其中哺乳动物有9 个，一般由l5 0 2 5 0 个氨 基酸残基组成，多数能与肝素高亲和结合1 3 j 。按其p i 的不同进行分类，可分为 酸性成纤维细胞生长因子( a c i d i cf i b r o b l a s tg r o w t hf a c t o ra f g f ) 和碱性成纤 维细胞生长因子( b a s i cf i b r o b l a s tg r o w thf a c t o rb f g f ) 。其结构同源性为5 0 ， 对热和酸不稳定，生物活性范围相似，可通过相同的细胞表面受体群发挥作 用。其他神经营养因子，如胰岛素样生长因子( i n s u l i n 1 i k e g r o w t h f a c t o r i g f ) 、胶质源性神经营养因子( g l i a dc e l l 1 i n e d e r i v e d n e u r o t r o p h i cf a c t o r g d n f ) 等也具有不同程度的促神经生长和保护神经元的作用。其中，g d n f f l , 作用体现在营养神经元方面，如对运动神经元、感觉神经元、多巴胺能神经 元及交感神经元。其次表现在周围神经元存活的维持，调节不同发育期的神 经元。在众多的神经营养素当中，神经生长因子和脑源性神经营养因子的同 源性研究中发现了神经营养素一3 ( n t - 3 ) ，与前两者相比较，n t - 3 可促进和分 化多种不同发育阶段的神经元【9 1 ，其作用范围广泛。s t e r n e l l 0 1 通过骨骼肌 细胞与n t - 3 体外培养及体内局部注射n t - 3 证实了其防止肌萎缩的作用。并 且揭示n t - 3 不但可有效的促进运动神经元存活和出芽，而且对感觉神经轴突 的生长也有显著促进作用。当前，n t - 3 已经进入了临床实验阶段，s a h e n k 等 1 人的临床实验发现应用n t - 3 以后，实验组损伤部位的有髓神经纤维数目、 神经电生理数据和神经损伤评测分数与对照组相比，得到显著提高。 周围神经损伤为骨创伤外科及显微外科的常见疾病，也是最棘手也极具 挑战性的难题之一，陈旧性神经损伤往往是由于在急性期因各种原因未行妥 善治疗导致。陈旧性神经损伤修复时，神经瘤及瘢痕组织必须切除，神经缺 损距离的扩大致使神经功能修复的难度进一步增大。周围神经断端间距离大 于其直径的4 倍以上时，必须借助于神经移植或神经替代物桥接才能修复神 经。传统认为陈旧性神经损伤无修复价值。但随着神经生物学研究的不断深 入，证实神经轴突及运动终板具有再生能力。陆裕补等l l2 j 对16 9 例陈旧性 神经损伤进行了修复，8 5 的病例获得有价值的结果。突破了在学术界占统治 地位的“神经损伤1 年以上无修复价值”的观点。 大量退变、破坏的髓鞘磷脂和轴突碎片来源于自体神经片断或碎片的变 性，其具有释放化学性物质刺激雪旺细胞增殖的能力【1 3 】，包括n g f 、b d n f 、 c n t f 、成纤维细胞生长因子在内的多种神经生长因子可分泌2 0 多种蛋白 质、e c m 和细胞黏附因子，这些物质对促进周围神经的发育、再生以及修 复起到至关重要的作用引。所以，本实验利用部分脱乙酰甲壳质生物套管桥 接大鼠坐骨神经lo m m 缺损，将陈旧性神经损伤两断端形成的神经瘤剥除外 膜组织，将其切碎至l m m 1m m 1m m 大小，取适量片段填充导管，其内注 a , o 1 m l 神经营养素3 ( 1 0 u g m 1 ) ，诱导周围神经再生，观察此复合桥接体对 陈旧性周围神经损伤修复的作用，旨在为临床找到一种方便可行的治疗周围 神经缺损的方法。 1 0 1 实验材料 材料与方法 1 1 实验动物：清洁级w i s t a r 大鼠( 山东大学医学院动物实验中心提供， 许可证号：s c x k 鲁2 0 0 9 0 0 01 ) ，6 周龄，4 0 只，均为雄性，体重l8 0 2 0 0 9 ， 抓阄法随机分为四组，每组10 p , ， 1 2 饲养及实验地址：济南军区总医院动物实验中心 1 3主要试剂及其来源： 神经营养素3 ( n t - 3 )( 美国r & d 公司) 盐酸氯胺酮注射液( 2 毫升，o 1 支)( 山东新华制药股份有限公司) 硫酸庆大霉素( 8 万u 支)( 山东鲁抗制药股份有限公司) 脱毛剂( 硫化钠8 克+ 蒸馏水10 0 克)( 济南军区总医院动物实验中心) 苏木精伊红染液( 济南军区总医院病理科提供) 1 4 实验器材及其来源： 15 号手术刀片、7 号刀柄、止血钳、缝针 、持针器、组织剪、4 - 0 缝线、无菌纱布( 济南军区总医院麻醉科) 敷料包、医用无菌手套 显微外科器械 9 o 无损伤缝合线 手术显微镜( g x s s z z 3 型) 生理信号采集处理系统及相关器械 医用天平 数码相机 m i a s p r o 图像分析系统 显微镜 石蜡切片机 2 实验方法 ( 浙江宁波医疗器械厂) ( 浙江宁波医疗器械厂) ( 上海医用光学仪器厂) ( 成都精密仪器厂) ( 长春精密仪器厂) ( p a n a s o n i cd m c f x 01 ) ( 四川大学计算机图像研究所研发) ( 日本o l y n p u sb h 2 系列) ( 樱花c 3 5 a d 2 ) 2 1 部分脱乙酰甲壳质生物套管的制备 原料为甲壳胺，经过中空纤维纺丝和牵伸工艺所制得的具有尺寸及物理 机械性能适宜的甲壳胺中空套管，继而对所取得的甲壳胺中空套管行乙酰化 1 l 处理，形成脱乙酰度为15 4 0 的部分脱乙酰甲壳质生物套管。以海藻酸纳 水溶液为载体促使神经生长因子附着于甲壳质套管的管壁，经过固化后得到 含药物型生物神经套管。该导管由中国纺织科学研究院与北京大学人民医院 联合研制，张培训博士提供。 2 2 麻醉 以o 5 碘伏常规消毒大鼠右下腹部，1m 1 无菌注射器抽取盐酸氯胺酮注 射液，针头自外下斜向内上进入腹腔，缓慢注射盐酸氯胺酮注射液 ( 10 0 m g k g ) ，将其放置于实验台上，5 分钟后，麻醉成功。 2 3 陈旧性周围神经损伤动物模型的制备： 高压蒸汽灭菌手术器械。麻醉成功后，以脱毛剂脱左股部及臀部毛发， 生理盐水纱布擦洗干净，将大鼠取俯卧位固定于无菌实验用手术台上。以 o 5 碘伏常规消毒术区皮肤，铺无菌巾单，穿无菌手术衣，戴无菌手套。取 左侧股后部纵形切口，长约1 5 c m ，分离股后侧肌群，自其肌间隙进入，充 分暴露坐骨神经，游离坐骨神经长约2 5 c m ，将坐骨神经于梨状肌下缘3 m m 处锐性切断，并切除长约6 m m 的坐骨神经干，任其自然回缩，并以9 0 显微 缝线将神经断端固定于局部肌膜上，1 0 缝线关闭切口。实验用大鼠术后皆 腹腔注射庆大霉素2 万单位，预防感染。如上方法将4 0 只w i s t a r 大鼠依次 处理，制备陈旧性周围神经损伤模型( 图1 ) ，单只分笼饲养，3 天后合笼。 四周后分别对四组进行实验。 2 4分组实验 周围神经陈旧性损伤模型制备后四周，原手术切口愈合良好，缝线已脱 落。各组大鼠实验侧足趾均呈并拢状不能着地行走，并出现不同程度肿胀， 溃疡形成。a 、d 组各两只及b 、c 组各一只大鼠出现掉趾( 图10 ) 。 a 组：切除神经断端增生膨大的神经瘤( 图2 ) ，在手术显微镜下9 0 无 创缝合线均匀缝合神经外膜和导管管壁，使神经断端在导管内相距1 0 m m ，于 部分脱乙酰甲壳质生物套管中注入0 1 m l 生理盐水。( 图5 ) b 组：同样处理神经断端，导管内注入o 1m l 神经营养素一3 ( 图4 、6 ) ： ，c 组：切取两断端增生膨大的神经瘤，显微镜下剥离外膜组织，将其切 碎至1m m 1m m x 1m m 大小( 图3 ) ，取适量片段填充导管，9 0 无创缝线缝 合管壁与神经外膜后于导管内注入0 1 m l 神经营养素3 ( 图7 ) 。 1 2 d 组：自体神经移植组：切除神经瘤至肉眼观正常神经，取前足胫神经 以9 0 缝线吻合两断端。术后分笼饲养( 图8 ) 。 1 号缝线缝合创口，腹腔注射庆大霉素2 万单位，预防感染，待麻醉清 醒后单只分笼饲养，3 天后合笼。 3 观察指标及方法： 3 1 、实验动物的大体观察： 二期手术术后第12 周，观察各组动物失神经改变情况：实验侧足趾外 形、足趾及踝关节肿胀、足趾脱落、足底和足跟溃疡形成和愈合情况( 包括 时间、程度，爪张开、后蹬动作、步态及坐骨神经支配肌肉( 包括股四头肌、 股二头肌、胫前肌、腓肠肌、趾伸肌、趾屈肌) 恢复情况。分别以盐酸氯胺 酮麻醉大鼠，无菌条件下，手术显露实验侧坐骨神经断端观察再生神经大体 情况。 3 2 神经电生理( n e p ) 的检查： 二期手术术后第12 周分别在大鼠浅麻醉状态下，以肌电图仪检测患肢 小腿三头肌的复合动作电位、潜伏期及双侧坐骨神经传导速度。 3 2 1 测定方法： 手术前，须采用针灸针将大鼠的尾部固定并可靠接地。沿原手术切口切 开皮肤、钝性分离股后侧肌肉、解剖出损伤段坐骨神经，双极针状刺激电极 的放置位置为神经吻合处近端一个，远端两个。再次确认安放位置正确及接 触良好后刺激神经的近端，重复刺激直至找到引起诱发动作电位的阈值及极 限刺激阈值后再刺激数次，直至荧幕所显示的复合动作电位图形稳定，并且 其伪迹及电位的起点清楚后，记录仪器自动测量的实验数据。运动神经传导 速度( m n c v ) 的计算方法为：记录的两电极点潜伏期的差除此两点间之间 距离。即：m n c v ( 米秒) = s ( 米) ( t 一 ) ( 秒) 。t 1 、t 2 分别代表两1 t 2 记录电极的潜伏期，s 代表两点之间的距离。 2 8 0 c 室温下，应用无菌生理盐水湿润游离的神经及肌肉。双极针状刺激 电极安置在神经吻合处的近端，于踝关节上方10 r a m 处放置另外一个双极针 状电极，其插入方向为4 5 0 ，并保持其走形方向与肌肉纤维一致。再次确认 电极放置位置正确及接触良好后刺激神经的近端，重复刺激直至找到引起诱 发动作电位的阈值及极限刺激阈值后再刺激数次，直至荧幕所显示的复合动 作电位图形稳定，并且其伪迹及电位的起点清楚后，记录仪器自动测量的实 验数据。 。 3 2 2 组织形态学光镜观察： 各项电生理检查内容结束后行坐骨神经取材，即分别取各组大鼠中段坐 骨神经组织5 m m ，并将其放置于1o 甲醛溶液中固定，时间为2 4 小时，依 次梯度酒精脱水，坐骨神经行石蜡包埋，切片厚度约5 9 m ，将其帖覆于玻片 上，分别行苏木精伊红染色及固绿髓鞘染色，以期达到观察再生神经组织中 的有髓神经纤维数目及髓鞘的目的。 3 2 3h e 染色步骤 3 2 3 1 h e l 0 0 0 毫升的配制： a 液：在7 5 0 毫升蒸馏水中加入硫酸铝5 9 。 b 液：苏木精2 克加入无水乙醇2 5 0 毫升中，将其充分遥匀。 o 2 克氢化剂碘酸钠加入a 、b 混合液之前与之后需注意将其充分摇匀。 5 分钟以后，作为中和剂的丙三醇5 0 毫升及促染剂柠檬酸o 3 克依次加入混 合液中，经过数分钟的震荡摇匀，次日便可以使用。 3 2 3 2h e 的染色步骤： ( 1 )于二甲苯中使切片脱蜡，时间为5 l0 分钟。( 2 ) 将切片放置于 二甲苯和纯酒精( 1 ：1 ) 混合液中5 分钟。( 3 ) 分别入10 0 、9 5 、8 5 、 7 0 酒精，每级时间2 5 分钟。转入染液前，行自来水洗及蒸馏水洗各1 分钟，。( 4 ) 苏木精染液中5 l5 分钟。( 5 ) 玻片上的多余染液水洗掉，以 o 5 1 盐酸酒精进行分色数分钟。( 6 ) 在碳酸锂饱和液中将其蓝化，即使 细胞核呈蓝色。( 7 ) 蒸馏水短洗。( 8 ) 以o 1 o 5 伊红染液染色，时间1 5 分钟。( 9 ) 然后脱水，分别过7 0 、8 5 、9 5 、10 0 酒精，各级时间 为2 3 分钟。( 10 ) 以石炭酸二甲苯混合液行透明( 二次) ，共计时间lo 分 钟。( 1 1 ) 封片：加盖玻片封固前擦拭去其周围多余二甲苯，滴加适量中性 树胶。 3 2 3 3固绿髓鞘染色步骤： 3 2 3 3 1 配制制剂： ( 1 ) 固绿酒精溶液：固绿( f c f ) o 5 克及1 冰醋酸0 5 毫升加入浓度为 9 5 的酒精1 0 0 毫升。 1 4 ( 2 ) 核固红水溶液：由核固红0 1 克、硫酸铝5 0 克、蒸馏水10 0 毫升配 置而成。加核固红煮沸前应先将硫酸铝加入蒸馏水当中，溶液冷却以后经过 过滤即可使用。 ( 3 ) 碳酸锂水溶液：碳酸锂0 3 克加入蒸馏水1 0 0 毫升中备用。 3 2 3 3 2 染色方法： ( 1 ) 切片脱蜡至蒸馏水 ( 2 ) 9 5 的酒精处理切片1 分钟 ( 3 ) 于固绿酒精中3 7 度温箱条件下3 0 分钟 ( 4 ) 以9 5 酒精清洗2 次，每次l 0 秒 ( 5 ) 再以蒸馏水清洗3 次，每次1 5 秒 ( 6 ) 0 3 碳酸锂分色2 次，每次1 5 秒 ( 7 ) 蒸馏水清洗3 次，每次1 5 秒 ( 8 ) 核固红染液复染核3 0 分钟 ( 9 ) 蒸馏水清洗5 分钟 ( 10 ) 常规梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。 3 3再生有髓神经纤维计数恢复率的测定： ， 二期手术后的第1 2 周，取各组大鼠坐骨神经组织切片，采用固绿髓鞘 染色观察神经组织横断面髓鞘及有髓神经纤维的情况。单张切片中的十个视 野为观察横断面切片的测量对象，相应的观察指标为神经纤维的数目、直径 及其髓鞘厚度，此外再生的神经组织有效神经截面积也是测量内容之一。获 取以上数据后，将实验侧与正常侧相对比，得到再生有髓纤维恢复率。再生 神经回复率= 实验侧再生神经有效截面积( 4 0 0 倍视野内) 健侧再生神经有 效截面积( 4 0 0 倍视野内) 1o o 3 4 三头肌湿重恢复率的测量： 二期术后第1 2 周，将实验组左侧小腿三头肌紧贴骨面自起止点处切断、 取出，去除表面结缔组织，在精确至o 1 m g 的分析天平上称其湿重前以滤纸 吸干表面血液，以相同的方法取右侧小腿三头肌，在精确到o 1 m g 的天平上 称其湿重。损伤侧肌湿重健侧肌湿重计算两者的恢复率。小腿三头肌湿重恢 复率计算公式：小腿三头肌湿重恢复率= ( 损伤侧肌湿重健侧肌湿重) 10 0 。 3 5 统计学处理 所有数据均采用s p s s l 6 0 进行统计学处理，数据以又士s 表示，行单因 素方差分析，p o 0 5 为有统计学意义。 1 6 争甲 ：日木 1 大体观察 1 1 大鼠在实验周期内生命体征稳定，无异常死亡情况。第一次手术后 各组大鼠皆表现出实验侧肢体不能有力支撑躯体，而且足趾聚拢，无主动伸 趾动作。手术切口于手术后第2 周基本愈合，实验侧足部出现不同程度的溃 疡形成及掉趾。二期手术后8 周，自体神经移植组和神经碎片+ n t - 3 组试验 侧足趾均可着地，足部皮肤溃疡已经愈合( 图9 ) ，跛行得到改善，腓肠肌均 存在不同程度的肌肉萎缩，其中，自体神经移植组可引出展趾反射；n t - 3 组和生理盐水组的足趾不能落地行走，且肌肉萎缩相当明显，无展趾反射。 第二次术后术后12 周时，自体神经移植组和神经碎片+ n t - 3 组无论是展趾 反射还是腓肠肌形态观察，都有不同程度的改善，具体表现为拇趾可外展， 展趾反射较灵敏；n t 3 组及生理盐水组的足趾可落地行走，但展趾反射未引 出，并且腓肠肌萎缩显著及足部皮肤溃疡不愈合。 1 2 第一次术后4 周，浅麻醉状态下观察神经断端，可见局部组织增生 膨大，与周围组织粘连，游离神经瘤过程中可触发左下肢保护性动作。第二 次术后1 2 周部分脱乙酰甲壳质生物套管已基本降解完毕，神经外膜形成完 整，可见n t - 3 组内再生神经纤维的直径与神经碎片+ n t - 3 组相比较细( 图 13 ) ，神经碎片+ n t - 3 组再生神经排列较为规则，无明显增生的纤维组织( 图 11 ) 。自体神经移植组可见移植段神经张力可，活动度无异常，形态学观察 与正常神经无显著差异，其吻合口平滑，并未见周围组织与其粘连( 图12 ) 。 生理盐水组外观上见吻合口膨隆，与周围较多结缔组织粘连，再生神经组织 迂曲、增生( 图14 ) 。 2 电生理检测 第二次手术后1 2 周神经组织取材之前，要完善电生理检测，内容包括 动作电位波幅和潜伏期以及神经传导速度。测试时应注意电极安放位置准 确，保持电极与神经干接触良好。神经传导速度( n e r v ec o n d u c t i v e v e l o c i t y ，n c v ) = m n c v ( 米秒) =