（外科学专业论文）bclxl过表达促进氧化损伤后血管内皮细胞快速修复的体外实验研究.pdf

材料与方法：1 2 结果2 6 结论3 0 讨 仑3 l 第二部分 b c l x l 过表达抗氧化应激介导的h u v e c 凋亡及细胞功能检测3 4 材料与方法3 5 结果4 4 结 仑5 4 讨 仑5 5 参考文献6 2 论文综述6 8 致谢7 6 原创性声明及使用授权书7 7 北京协和医学院中国医学科学院博士研究生学位论文 b c l x l 过表达促进氧化损伤后血管内皮细胞快速修复的体外 实验研究 中文摘要 背景和目的 血管重建术后内膜增生引发的再狭窄一直是临床的热点和难点问题。而血管 内膜损伤是导致后续一系列级联反应( 血小板及炎性细胞粘附活化、平滑肌细胞 增殖迁移) ，并最终引发再狭窄的首要环节。而多种损伤因子( 手术、高血糖、高 血脂、吸烟、缺血再灌注等) 均可通过氧化应激反应引发血管内皮细胞凋亡进而 造成内膜损伤。因此，抑制氧化应激导致的血管内皮细胞凋亡，增强对血管内膜 的保护作用可能成为减轻损伤后内膜增生的新方法。以往研究中多采用抗氧化药 物以减轻氧化应激介导的细胞凋亡，但系统性给药难免使损伤局部血药浓度过 低，达不到真正意义上的抗氧化效应。随着基因治疗技术的发展，血管局部定位 基因转染逐步成为防治再狭窄研究的热点，可将特定基因精确转染至血管壁，最 大程度的在局部发挥作用。本研究在体外脐静脉内皮细胞( h u v e c ) 氧化损伤模 型的基础上，利用重组腺病毒载体预先将抗凋产基凶b c i x l 导入内皮细胞，研究 b c i x l 过表达可否抑制氧化应激导致的内皮细胞凋亡以及对内皮细胞功能的保 护作用，进而为促进受损内皮细胞的快速修复、防止术后管腔再狭窄的基因治疗 提供实验依据。 内容和方法 l 、重组腺病毒基凶载体的构建 ( 1 ) 提取目的基因b c l x i 及构建质粒载体p g e m t b c l x i ； ( 2 ) 以上述质粒载体为模板构建重组腺病毒载体p a d x s i g f p b c l x l ，同时构 建空病毒载体p a d x s i g f p 作为对照； ( 3 ) 以不同感染复数( m o i ) 的重组腺病毒感染h u v e c ，评估感染率，通过 w e s t e mb i o t 检测感染后h u v e c 中目的蛋白b c l x l 的表达情况。 2 、b c l x l 过表达的h u v e c 抗氧化捌亡能力及内皮细胞相关功能检测 ( 1 ) h 2 0 2 诱导h u v e c 凋亡模型的建立； ( 2 ) 实验细胞分组：正常h u v e c 纽( n o r m a i 窒f 1 ) 、正常h u v e c + h 2 0 2 组( h 2 0 2 北京协和医学院中国医学科学院博士研究生学位论文 组) 、经p a d x s i g f p b c l x l 转染的h u v e c + h 2 0 2 组( a d v g f p b c l x l 组) 、 经p a d x s i g f p 转染的h u v e c + h 2 0 2 组( a d v g f p 组) ； ( 3 ) b c l x l 过表达的h u v e c 抗氧化凋亡能力检测 夺通过倒置显微镜观察、h o e c h s t 3 3 2 5 8 细胞核染色，了解各组在氧化应 激刺激下细胞形态学改变的差异 令通过p i 染色流式细胞仪进行细胞周期检测，得出g 0 g l 期细胞比例， 进而评估凋亡率 夺通过w e s t e mb l o t 进行凋亡相关蛋白( c a s p a s e 7 ，p a i 冲) 检测 ( 4 ) 探索b c l x l 过表达可否保护氧化应激条件下内皮细胞的正常功能 通过c c k 8 检测及细胞免疫组化染色了解细胞增殖能力 夺通过细胞划痕试验了解各组在氧化损伤后的迁移能力上有无差异 令通过r e a l t i m ep c r 检测氧化损伤后各组细胞内e n o s 在m r n a 水平 上的表达差异 通过e l i s a 检测各时间点( o h 、2 4 h 、3 6 h 、4 8 h ) 每纽细胞培养上清中 v e g f 的分泌量 研究路线图 北京协和医学院中国医学科学院博士研究牛学位论文 结果 l 、重组腺病毒成功感染h u v e c ，最适m o i 为1 0 0 。w e s t e mb l o t 结果显示目 的蛋白b c l x l 高表达于病毒感染后的h u v e c 。 2 、b c l x l 过表达增强h u v e c 耐受氧化损伤的能力，同时保护了内皮细胞功能 ( 1 ) 成功建立h 2 0 2 诱导h u v e c 凋亡模型，凋亡率与h 2 0 2 浓度具有量效关系； ( 2 ) 正常h u v e c 在氧化应激条件下细胞形态发生改变，同时染色体固缩。而 b c l x l 过表达的h u v e c 在形态上无明显改变，固缩核细胞比例明显降低； ( 3 ) b c l x l 过表达后的h u v e c ，处于g 0 g l 期的细胞比例明显降低； ( 4 ) w e s t e mb i o t 检测凋亡相关蛋白结果显示：h 2 0 2 组及a d v g f p 组细胞在氧 化应激下，细胞内可检测到c l e a v e dc a s p a s e 7 及c l e a v e dp a r p 表达，而 a d v g f p b c l x i 组上述蛋白表达量明显降低； ( 5 ) 在细胞增殖方面，h 2 0 2 组及a d v g f p 组细胞在氧化应激条件下，细胞倍增 速度明显下降。而a d v g f p b c l x l 组细胞的生长曲线与正常组细胞荩本一 致。同时a d v g f p b c l x l 组p c n a 阳性细胞比例有所升高； ( 6 ) 细胞划痕试验结果显示a d v g f p b c l x l 组划痕愈合较h 2 0 2 组及a d v g f p 组明显加快，与正常组细胞愈合能力基本一致； ( 7 ) r e a l t i m ep c r 结果显示氧化应激刺激后，a d v g f p b c l x l 组较h 2 0 2 组及 a d v g f p 组细胞内e n o sm r n a 表达量明显上调； ( 8 ) e l i s a 结果显示h 2 0 2 处理的三组细胞较正常纽细胞v e g f 分泌量明显升 高，同时a d v g f p b c i x i 组v e g f 分泌量高于h 2 0 2 组及a d v - g f p 组。 结论 l 、重绢腺病毒对h u v e c 具有较高的感染效率，最适m o i 为1 0 0 ； 2 、通过细胞形态学、细胞蒯期及w e s t e mb l o t 凋亡相关蛋白检测，结果表明 b c i x l 过表达可明确抑制氧化应激诱导的内皮细胞凋广； 3 、通过r e a l - t i m ep c r 、e l i s a 、细胞划痕试验等方法行内皮细胞功能相关榆 测，结果表明b c l x i 过表达在氧化应激条件下可以保护内皮细胞的增殖、迁 移、合成及分泌等功能。 关键词 内膜增生；冉狭窄；氧化应激；活性氧；抗凋广；b c l x l ；基凶治疗 北京协和医学院中国医学科学院博士研究生学位论文 b c l - x lo v e r e x p r e s s i o np r o t e c t sh u v e cf r o mo x i d a t i v es t r e s s i n d u c e da p o p t o s i sa n dr e s t o r e se n d o t h e l i a lc e l l s f u n c t i o n a b s t r a c t b a c k g r o u n da n do b j e c t i v e i n t i m a l h y p e r p l a s i a ( i h ) r e s u l t i n gf 沁mv a s c u l a r 两u 叫i n i t i a t e db yp r o c e d u r e ss u c h a sb y p a s sg r a rs u 唱e 呵o rp e r c u t a n e o u st r a n s l u m i n a ia n g i o p l a s t yw i t ho rw i t h o u ts t e n t c o n t i n u e st ol i m i tt h es u c c e s so ft h e s et h e r a p e u t i ci n t e l 。v e n t i o n s v a s c u l a re n d o t h e l i a l c e l l ( e c ) a p o p t o s i si n d u c e db yo x i d a t i v es t r e s sa r e ri n j u f yi so r e nr e g a r d e da st h e t r i g g e r i n ge v e n tf o rt h ed e v e l o p m e n to fl h m a n ya t h e r o s c l e m s i sr i s kf a c t o r s ，s u c ha s d i a b e t e s ，h y p e r l i p i d e m i aa n ds m o k i n gc a na c c e i e r a t ee cd a m a g ea n di ho w i n gt o h e i g h t e n e do x i d a t i v es t r e s s t h e r e f b r e ，i n h i b i t i n ge ca p o p t o s i sa n dp r o t e c tv a s c u l a r t i s s u ea g a i n s to x i d a t i v es t r e s si n j u 叫c o u l db ea ne f 凳c t i v et r e a t m e n ts t r a t e g yt ol i m i t i h p r e v i o u ss t u d i e s s u g g e s t e da d m i n i s t r a t i o n o fa n t i o x i d a n ta g e n t ss u c ha s n a c e t y i c y s t e i n e ( n a c ) a n dp r o b u c o li m p r o v e se cc o v e r a g ea n dd e c r e a s e slhb y i n h i b i t i n gr e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ( r o s ) f o n l l a t i o n ，s c a v e n g i n gr o s ，a n di n t e r f e r i n g w i t hr o sp a t h o g e n i cs i g n a i i n gp a t h w a y s b u tt h ea n t i o x i d a n te 何e c t sc a nb eh a r d l y o b t a i n e db e c a u s eo ft h ei o w e rd r u gc o n c e n t r a t i o ni nt h el o c a ir e g i o no fv a s c u l a rw a l l w i t ht h ed e v e l o p m e n to fg e n et h e r a p y ，l o c a ll yt r a n s f e 州n gt a 唱e tg e n ei n t ov a s c u l a r w a l li s g r a d u a l l yb e c o m i n gac o m m o nm e t h o df o rp r e v e n t i n gr e s t e n o s i s 1 nt h e p r e s e n ts t u d y ， w et r a n s f e r r e db c l - x lg e n e ，o n eo fa n t i a p o p t o t i cg e n e s ，i n t ot h e c u l t u r e dh u m a nu m b i l i c a lv e i ne n d o t h e l i a lc e l i s ( h u v e c s ) i nv i t r oa n ds o u g h tt o d e t e n n i n et h ee f n c a c yo fb cj x lo v e r e x p r e s s i o np r o t e c t i n ge cf 沁mr o sm e d i a t e d i n s u l t ，a n dt h e ni m p r o v i n ge n d o t h e l i a lr e g e n e r a t i o n ，a c c e i e r a t i n gt h er e c o v e 叫o f e n d o t h e l i u m d e p e n d e n tb i o l o g i c a i f u n c t i o n sa n dp r o v i d i n ga ne f f e c t i v e t h e r a p e u t i c a d j u n c tt of a c iii t a t et r a n s f e ro fe x p e r i m e n t a it r e a t m e n t sf o rv a s c u l a ri n j u t ot h e c l i n i c m e t h o d s t h e7 0 2 - b ph u m a nb c l x lg e n e ，o r i g i n a l i yc i o n e df 而mh u m a nt e s t i sc d n al i b r a 以 5 北京协和医学院中国医学科学院博士研究生学位论文 w a sf i r s t l ys u b c l o n e di n t oa d e n o v i r u ss h u t t l ev e c t o rp s h u t t l e g f p c m va n dt h e n ， t h et a r g e tg e n ew a sc l o n e di n t ot h ei c e uia n dl s c els i t e so fa d e n o v i m sb a c k b o n e v e c t o rp a d x s it og e n e r a t et h er e c o m b i n a n ta d e n o v i r u sv e c t o r sp a d x s i - g f p - b c l - x 1 w e u s e dp a d x s i - g f pe m p 妙v e c t o rt ob ec o n t r 0 1 h u v e c sw e r ei n f e c t e dw i t ht h e r e c o m b i n a n ta d e n o v i r u sa td i f 艳r e n tm u i t i p l i c i t i e so fi n f e c t i o n ( m 0 1 ) i nt h er a n g e5 0 t o2 0 0 i n f e c t i o ne f f i c i e n c yw a sd e t e r n l i n e db yn o wc ”o m e t r y t h ee x p r e s s i o no f b c l - x ii nh u v e c sa r e ri n f e c t i o nw a sa s s e s s e db yw e s t e mb l o t h u v e c sw e r ei n c u b a t e dw i t hh y d r o g e np e r o x i d e ( h 2 0 2 ) f o rl2h o u r sa td i f i e r e n t c o n c e n t r a t i o n sf r o m0 2 m mt o2 5 m m w ea s s e s s e dt h ea n t i a p o p t o t i ce f f e c to fb c l x l o v e r e x p r e s s i o nt oh u v e c se x p o s e dt o0 2 m mh 2 0 2f 沁ma s p e c t so fm o r p h o l o g y ， c e l lc y c l e sa n da p o p t o s i sa s s o c i a t e dp r o t e i n a r e ri n c u b a t e dw i t hh 2 0 2 ，t h eg r o 、t h c o n d i t i o n sa n dm o r p h o l o g i c a lc h a n g e so ft h eh u v e c sw e i eo b s e r v e dw i t ha n i n v e n e dm i c r o s c o p e ，t h en u c i e a rm o r p h o l o g yo f c e l l sw a so b s e r v e db yh o e c h s t3 3 2 5 8 s t a i n i n g t h ep e r c e n t a g eo fg 0 g l p h a s eh u v e c sw e r e m e a s u r e dt h r o u g hp i s t a i n i n ga n df l o wc ”o m e t r y ，a n dt h ee x p r e s s i o nl e v e lo fa p o p t o s i sa s s o c i a t e dp r o t e i n c a s p a s e 7a n dp a r p w e r ed e t e c t e db yw e s t e mb l o t f u r t h e m o r e ，w ee x p l o r e di fb c l x lo v e r e x p r e s s i o nc o u l dp r o t e c tt h eb i o l o g i c a i f h n c t i o n so fh u v e ci nt h ec o n d i t i o no fo x i d a n ts t r e s s t h ev i a b i i i t yo fh u v e cw a s d e t e c t e db yc c k - 8 a s s a ya n da n t i - p c n ac y t o i m m u n o h i s t o c h e m i s t ys t a i n i n g 1 nv i t r o s c r a t c h i n ga s s a yw a su s e dt oa s s e s st h ei m m i g r a t i o nf u n c t i o no fh u v e c i nd i f f i e r e n t g r o u p s t h ee x p r e s s i o n so fe n o sm r n a w e r ei n v e s t i g a t e db yr e a l t i m ep c ra n dt h e c o n c e n t r a t i o no fv e g fi nt h ec u l t u r em e d i u mi nd i f f e r e n tt i m e s ( 0 h 、2 4 h 、3 6 h 、4 8 h ) w e r em e a s u r e du s i n ge l i s ak i ta g a i n s th u m a nv e g f r e s u i t s 0 v e r e x p r e s s i o no fb c l - x lg e n ei nh u v e c a r e rr e c o m b i n a n ta d e n o v i l l j sj n f e c t j o n w a sc o n f i m l e db yf l u o r e s c e n c em i c r o s c o p ea n dw e s t e mb l o t w eo b s e r v e dt h e h u v e c so ft h eh 2 0 2a n da d v - g f pg r o u pw e r ed e f o r m e da n dc o n t r a c t e d ，h a d i n c r e a s e di n t r a c e l i u l a rg r a n u l a rm a t e r i a la n ds h o w e dar o u 曲e n e dp r o n l e b u tt h e h u v e c so fa d v - g f p b c l - x lg r o u pd i d n ts h o wt h e s em o 巾h o l o g i cc h a r a c t e r i s t i c s a t m e a n t i m et h ep r o p o r t i o no fa p o p t o t i cc e l l sl a b e l e dw i t hh o e c h s t3 3 2 5 8w a so b v i o u s l y 6 s u g g e s t e db c l - x lo v e r e x p r e s s i o nc o u l da c c e l e r a t et h er e g e n e r a t i o no fh u v e c i nt h e c i r c u m s t a n c e so fr o s t h er e s u i t s6 fs c r a t c h i n ga s s a yr e v e a l e dt h ei m m i g r a t i o n f u n c t i o nw a sr e s t o r e da r e rb c i - x lg e n et r a n s f e r r i n g a r e rl2 ha n d2 4 he x p o s i n gt o h 2 0 2 ，e n o se x p r e s s i o ni nt h el e v e lo fm l 之n ai nh u v e c sw e r es i g n i 6 c a n t l yh i 曲e r i na d v g f p - b c l x lg r o u pt h a nt h eo t h e rt w og r o u p s h 2 0 2c a ni n c r e a s et h ee x p r e s s i o n o fv e g fi nh u v e c s ，i nt h em e a nt i m e ；a d v - g f p - b c l x lg r o u ph a dh i g h e rv e g f e x p r e s s i o nt h a nt h eo t h e r t w og r o u p s c o n c l u s i o n 1 t h eo p t i m a lm o if o rg e n et r a n s f e r r i n gt oh u v e cb ya d e n o v i r u sv e c t o r si s 1 0 0 2 b c l - x lo v e r e x p r e s s i o nc a na t t e n u a t et h eo x i d a t i v es t r e s sd a m a g ef o rh u v e ci n v i t r ot h r o u g he x e n i n ga n t i a p o p t o t i ce f 佗c t 3 b c l - x lo v e r e x p r e s s i o np r o t e c t st h eb i o i o g i c a lf u n c t i o no fh u v e ca g a i n s t o x i d a t i v es t r e s sa n dr e m a i n st h ec e l lv i a b i l i t ya n df u n c t i o n so fi m m i g r a t i o n ， s y n t h e s i sa n ds e c r e t i o n k e y w o r d s i n t i m a lh y p e r p l a s i a ；r e s t e n o s i s ；o x i d a t i v es t r e s s ；r o s ；a n t i - a p o p t o s i s ；b c l x l ； g e n et h e r a p y 一7 北京协和医学院中国医学科学院博士研究生学位论义 缩略词表 ( a b b r e v i a t i o n s ) 8 北京协和医学院中困医学科学院博十研究生学位论文 引言 动脉闭塞性疾病( p a o d ) 已成为威胁中老年人健康的重要问题。在美国，4 0 岁以上人群中有8 0 0 万人患有p a o d 【。我国北京地区流行病学资料显示：6 0 岁 以上人群中，p a o d 发病率为1 5 3 【2 】。随着人口老龄化的进展，每年凶p a o d 接 受手术治疗的患者数量在逐年增加，这些干预手段包括自体人工血管旁路术、 内膜剥脱术以及球囊扩张支架植入术等。但损伤处血管及吻合口内膜增生导致 的管腔再狭窄以及继发的血栓形成严重影响了血管重建术后远期通畅率。而手术 引发的多种病理牛理改变( 如缺血再灌注、炎性反应等) 以及多种伴随疾病( 如高 血糖、高血脂) 均可通过氧化应激造成血管内皮细胞凋产而使内膜受损，这是引 发后续内膜增生及再狭窄的始发点。因此，如何减轻内皮细胞的损伤程度，促进 内皮快速修复，进而防止内膜增生已成为血管外科领域亟待解决的问题。 在预防内膜增生方而，药物涂层支架是最早获得f d a 审批应用于临床的介入 材料，临床研究结果证实支架植入术后因内膜增牛导致的管腔再狭窄明显减轻， 但其远期疗效并不令人满意，多项r c t 结果表明，药物涂层支架植入后9 个月内， 支架内血栓发生率明显增加【3 4 】。其原冈是涂层中的细胞周期抑制物( 如紫杉醇等) 在阻断血管平滑肌细胞( v s m c ) 增殖、迁移的同时，也抑制了受损内膜处的内皮 细胞再生，延迟了损伤部位血管内皮化的进程，继而引发血栓形成1 5 j 。而促进内 皮细胞再生，可切断后续血小板聚集、炎性细胞粘附活化、释放多种生长冈子、 内膜下v s m c 增殖、迁移等一系列级联反应，从而达到抑制内膜增生的目削6 | 。 因此，近些年来，人们将目光从抑制平滑肌增生逐渐投向了如何促进受损处内皮 快速修复的问题上。 迄今为止，人们己尝试过多种方法促进损伤后内皮再生。如应用v e g f 等生 长| 大| 子涂层支架、雌激素涂层支架、能捕获循环中内皮祖细胞的抗c d 3 4 涂层支 架以及应用预先包被有白体内皮细胞及纤维基质的人工血管等方i 去【7 西】。但动物 实验结果显示其防i 卜内膜增生的效果并彳i 一致，例如w a l t e r 等在高脂饮食的兔颈 动脉植入v e g f 涂层支架，发现较对照组内皮化速度明显加快，2 周后观察内膜 增生程度明显降低i l0 1 。但也有学者却得卅棚反的结果，认为v e g f 可刺激内皮细 胞释放b f g f 和t g f 一6 ，后两者可促进v s m c 的迁移和增殖，加重内膜增生。通过 应用可溶件v e g f 受体s f l t 1 阻断v e g f 可达到减轻内膜增生的效果_ 引。上述不 北京协和医学院中国医学科学院博士研究生学位论文 同的结果可能也与损伤形式及观察时间点不同有关。因此，在防治血管损伤后内 膜增生及再狭窄的问题上，理想的干预措施是一方面促进受损内皮细胞的增殖及 再生，同时抑制血管平滑肌细胞的过度增生【3 】。 多项研究结果表明，血管内皮细胞及平滑肌细胞凋亡在损伤后管腔再狭窄的 发生发展中扮演重要角色【陴1 6 】。氧化应激导致的细胞凋亡是多种心血管疾病的核 心环节，同样也贯穿于多种损伤因子造成血管损伤后内膜增生的始终【i 。7 1 。凋亡 的内皮细胞可增强血小板的粘附作用，促进炎性细胞及脂质浸润，诱发v s m c 增 生、迁移及血栓形成【1 8 棚】。球囊损伤可通过增加血管壁内n a d p h 依赖超氧化物 产生，介导v s m c 凋亡使细胞间粘附分子脱失，促进中层v s m c 向内膜迁移，导 致内膜增生f 】们。冈此，抑制损伤后氧化应激导致的血管壁内皮细胞及v s m c 凋亡， 增强对血管内膜的保护作用可能成为预防损伤后内膜过度增生的新思路。这也正 是本研究的意义所在。目前，多数动物实验研究通过口服抗氧化剂( 如n 乙酰半 胱氨酸、普罗布可) 以清除体内过多的活性氧( r o s ) ，达到减轻氧化损伤程度的 目的【1 7 ，2 0 1 ，但系统性给药往往使损伤血管局部药物浓度过低，不能达到真正意 义上的抗氧化效果。为此，我们尝试通过局部基因治疗的方法，将抗凋亡基因定 位转染至血管壁并实现表达，最大限度的使其住局部发挥抗凋亡作用，增强细胞 的抗氧化能力，从而缩小氧化应激造成的内膜损伤范围，保护尚存内皮细胞的功 能，最终达到促进损伤后内皮快速修复，防止内膜增牛的效果。 基凶治疗的前提是要使目的基凶高效表达于效应细胞，尤其面对时刻有血流 冲击的血管内膜，高转染效率对于以血管为靶向的基因治疗尤为重要。本研究第 一部分中，我们通过基因克隆等分了生物学技术，成功构建了抗凋亡基因b c l x l 重绢腺病毒载体p a d x s i g f p b c l x i ，并证实了经该病毒感染后的h u v e c 可瞬时 高效表达日的基冈b c l x l 。在第二部分实验中，我们在体外h u v e c 氧化应激模 型的基础上，通过预先转染抗凋产基凶b c l x l 并使其过表达，探究其能否抑制氧 化应激导致的内皮细胞凋亡以及保护内皮细胞的功能。为卜一步的体内实验奠定 基础，同时也为临床上促进损伤血管快速修复、防止术后管腔再狭窄的局部基因 治疗拓展新的思路。 重组腺病毒载体p a d x s i g f p b c l x l 的构建 及h u v e c 转染 北京协和医学院中国医学科学院博士研究牛学位论文 实验材料 1 菌株 菌株 e c d ，fd h 5 0 【 材料与方法 基因型用途来源 f 一( d 8 0 d l a c z ml5r e c a l e n d a1 g y r a 9 6 t h i l 质粒的扩增基础所3 0 8 h s d r l7 ( r k - m k + ) s u p e 4 4r e l a l与转化实验室 d e o r ( 1 a c z y a - a 唱f ) u l6 9 2 质粒载体 p g e m t ：购自p r o m e g a 公司，用于p c r 产物的克隆； p a d x s i 重组腺病毒骨架载体：由诺赛基因组研究中心提供，用于腺病毒包装 p s h 嘣l e - g f p - c m v 穿梭载体：由诺赛基因组研究中心提供，用于病毒包装 所用载体的结构及多克隆位点如下： p g e m - t 载休的结构及多克隆位点 1 矾 1 4 2 b 3 1 3 7 帕 5 5 6 2 6 2 7 3 7 5 配 * 1 0 3 ”2 1 2 6 p a d x s i 载体的结构及多克隆位点 p s h u t t l e g f p c m v 的结构及多克隆何点 1 2 北京协和医学院中固医学科学院博十研究牛学位论文 3 c d n a 文库 人睾丸c d n a 文库( c y t o t r a p1 b r a 巧) 由协和基础所3 0 8 实验室保存。 4 细菌用培养基 l u r i aa g a r 购自g i b c o b r l 公司。哪声t o n e ，y e a s te x t r a c t 购自o x o i d 公司。 5 细胞系及培养基 原代人脐静脉内皮细胞( h u v e c ) 及e c m 培养基购白s c i e n c e l l 公司；人胚肾 细胞系h e k2 9 3 t 购自a t c c ；d m e m 培养基、胰蛋白酶为g l b c o b r l 公司产 品；胎牛血清( f b s ) 购自h y c l o n e 公司及天津灏洋生物公司。 6 工具酶 名称用途来源 8 主要仪器、设备 电子大平 l 7 6 5 冷冻超速离心机 p c r 仪 m i l l i qp i u s 超纯水系统 s a t o r i s b e c k m a n a p p l i e db i o s y s t e m s m i l l i p o r e 1 3 北京协和医学院中国医学科学院博士研究牛学位论文 9 引物的设计与合成 使用d n a m a n5 2 2 软件设计，根据一般引物设计原则选择引物。然后对所 选择引物进行同源性比较分析( h 业；丛塑盟盟曼垒i ：旦! 也：旦i h ：g q y 坦! 垒煎) ，针对特定基因 选择特异的引物对。引物合成由i n v i r o g e n 公司完成。 从c d n a 文库钓取目的基因b c l x l 引物： f p r i m e r s ：5 一a c c t g c c t g c c t 丌g c c t a a 3 r p “m e r s ：5 a g g g t a g a g t g g a t g g t c a g t 3 ， 实验方法 1 目的基因b c l x l 片段的提取和扩增 以人c d n a 文库为模板，进行p c r ，扩增含有目的基因b c l x l 的d n a 片 段。建立如下反应体系： t e m p i a t e d n t p ( 2 5m m ) f p r i m e r s r - p r i m e r s t a qp o l y m e r a s e 5 t a qp o l y m e r a s eb u 仟e r d d h 2 0 l 此 4 肚l 0 5 u l 0 5 l 0 5 此 1 0 肛l 3 2 5 “l t o t a lv o l u m e 5 0 此 离心混匀后按如卜程序进行扩增： 9 4 2m i n 9 4 3 0s e c - 、 5 3 3 0s e c 3 0 c y c i e s 7 2 4 5s e c j 7 2 5 m i n 4 一 取出5 此p c r 产物进行】a g a r o s e e t b r ( 1x t a e 电泳缓冲液) 电泳，鉴 定d n a 片段大小。剩余p c r 产物2 0 保存。 2 p c r 产物的纯化回收 使用d n a 快速纯化刚收试剂盒对上述p c r 产物进行纯化。具体方法如下： 1 4 北京协和医学院中国医学科学院博士研究生学位论文 1 ) 切取琼脂糖凝胶中的d n a 条带，放入清洁的离心管中，称重，如胶重 为1 0 0 m g ，体积可视为1 0 0m l ( 1 0 0m 萨1 0 0 肚) ，以此类推。 2 ) 加入3 倍体积溶胶液，于5 5 水浴溶胶( 确保胶块完全融化) ，使凝胶完 全溶化后，加入l o l 玻璃奶，颠倒混合数次，冰上放置1 0 m i n ，使d n a 与玻璃奶吸附，其间每2 m i n 颠倒混匀一次。 3 ) 1 2 ，0 0 0 叩m 离心3 0 s ，弃上清，沉淀中加入3 0 0 斗l 漂洗液，吹打混匀， 1 2 ，0 0 0 r p m 离心3 0 s ，弃上清。漂洗2 次。 4 ) 沉淀于3 7 完全干燥后，加入d d h 2 02 0 p l 混匀，6 0 水浴1 0 m i n ，洗脱 吸附于玻璃奶上的d n a 。1 2 ，0 0 0 r p m 离心6 0 s ，吸取回收上清为d n a 产物。 将洗脱的d n a 于2 0 保存。 3 将回收的含有目的基因b c l x l 的d n a 片段连入p g e m t 载体 而g 酶能够在d n a 平端片段的3 端加上一个核苷酸，通常为( 1 a t p ，从 而p c r 产物的末端加入一个突出的“a ”。而p g e m t 载体为线性载体两平末 端各带有一个核苷酸“t ”。利用上述特性，可将p c r 产物d l n a 构建入t 载 体。 首先使用t a q 酶在纯化的p c r 产物末端加入“a ”，方法如下： 3 5l i l 纯化p c r 产物 i + 2 5u 历g 酶 上+ d n t p 至终浓度2 5 0 n m 1 0u l 反应体系 上，。瓷i n 2 “j 产物j | j 于下游连接 4 过夜连接反应体系如卜： 2 t 4i i g a s eb u 腋r 5 此 p g e m t p c r 产物 t 4d n a l i g a s e d d h 2 0 1 1 0 t a l 、，o l u m e 0 5 止 2 肛l l 止 1 5 山 1 0 “l 北京协和医学院中国医学科学院博士研究生学位论文 经过上述连接反应，最终将目的基因b c l x l 插入到p g e m t 中得到 p g e m - t b c l - x l 。 4 p g e m t - b c l x l 的扩增及质粒提取 4 1 感受态细胞的制备 1 ) 挑取宿主菌d h 5 a 或b l 2 l 单菌落接种于5m ll b 培养基中，3 7 振荡 培养过夜( 1 2h r ) 。 2 ) 取0 5m l 菌液接种至5 0m ll b 培养基巾，3 7 剧烈振荡培养1 5h r 左右， 至o d 6 0 0 。m 达0 3 0 5 。 3 ) 将菌液置冰浴冷却1 0m i n ，移至5 0m l 离心管中，4 4 0 0 0r p m 离心1 0 m i n ，弃上清。 4 ) 将细菌沉淀重新悬浮于1 0m l 预冷的0 1 mc a c l 2 中，冰浴3 0m i n 。 5 ) 4 4 0 0 0r p m 离心1 0m i n ，弃上清液。 6 ) 将细菌沉淀重悬于2m l 预冷的o 1 mc a c l 2 甘油溶液中，每管5 0 1 0 0 此分装至无菌1 5 m l e p 管中。 7 ) 8 0 放置1 2h r 后，即可用于转化。 4 2 连接产物p g e m t - b c i x l 转化感受态细胞( 蓝白筛选) 1 ) 感受态细胞d h 5 a 于冰浴解冻。 2 ) 取5 p l 连接产物加入1 0 0 p l 感受态细胞，轻轻混匀，冰上孵育3 0 m i n 。 3 ) 4 2 热激9 0 s ，然后迅速置于冰浴2 3 m i n 。 4 ) 加入4 0 0 “ll b 液体培养基，3 7 振荡培养( 2 0 0 r p m ) 4 5 m i n 。 5 ) 取10 0 l 转化茼液均匀涂布于含有a m p ( 氨苄青霉素l0 0 p