（预防兽医学专业论文）猪源H9N2亚型流感病毒遗传变异和感染特性研究.pdf

摘要 猪被认为是流感病毒的“中间宿主”和。混合器”，可同时感染禽流感病毒和人流感病毒， 并可以通过在猪体内的重组产生具有流行潜能的新毒株。对猪流感的监测是流感流行病学研究中 的一项重要内容本研究对2 0 0 3 2 0 0 4 年分离自山东和河南两省不同猪场的1 2 株猪h 9 n 2 亚型流感 病毒的抗原性和遗传特性进行了分析抗原性分析结果表明，5 株山东分离株姒的抗原性不同于 以往所分离到的禽h 9 n 2 亚型流感病毒，说明发生了较大的变异，而7 株河南分离株的抗原性未发 生明显改变。眦裂解位点分析揭示，山东猪h 9 n 2 l 型流感病毒的f i a 裂解位点均为- r - l - s - r - ，不 同于已在我国禽群中流行的d k 砥y 2 8 0 9 7 亚系病毒，而河南分离株眦裂解位点则与 d k h k y 2 8 0 9 7 亚系病毒一致，均为一r s s r 一进化树分析显示，山东分离株的 i a 和n a 基因形成 了一个可能来源于早期h 9 n 2 亚型禽流感病毒的新的亚系，即s d 0 3 一l i k e 亚系；而且山东分离株部 分内部基因与h 5 亚型病毒高度同源，证明这些病毒可能是h 9 和h 5 两个亚型病毒的重排病毒；而河 南分离株的所有基因都与禽源h 9 n 2 亚型流感病毒亲缘关系较近。 流感病毒的宿主特异性是由 l a 与细胞上末端链接有糖基的唾液酸受体介导的。为了确定几株 猪h 9 n 2 亚型流感病毒分离株的受体结合特性，本研究在国内首次建立一种类似间接e l i s a 的固相 酶联试验，即利用。病毒一受体一酶”三者之间耦联的方法证实了猪h 9 n 2 甄型流感病毒 s w s d f f f n 0 3 仍然保持了禽源流感病毒的受体结合特性，即具有与s a a2 ，3 g a l 受体结合的能力， 而s , s d f n y 0 3 和s w h n 2 0 4 同时具有与s aa2 ，3 g a l 和s ao2 ，6 6 a l 两种受体结合的能力。受体结 合试验表明，h 9 n 2 禽流感病毒传播给猪后，有可能导致病毒受体结合特性的改变。 为了阐明猪源h 9 n 2 病毒感染哺乳动物后，t l r 7 在宿主抗病毒感染中的变化情况与作用，本研 究利用实时荧光定量p c r 技术检测了攻毒后不同时间内小鼠肺组织中t l r 7 基因m r n a 表达的变化。 结果发现，在感染流感病毒后的第1 3 天，肺组织中t l r 7 含量明显高于对照组( p d n c j 0 5 ir b 5 ，b j 4 ，0 5h 5 r t il k h n i l l 0 4 ，打 u 。l0 “b 肼1 7 4 ，甜h ， l 1 ；踩d ，d i , b n 。o j j 麓龇髭耀 f i g u r e3 - 2 f n p s ；w l - l z j 中国农业大学博士学位论文第三章猪h 9 n 2 亚型流感病毒的抗原性和遗传性分析 f i g u r e3 _ 2 备m f 唔u 3 - 2 h n s 图3 _ 2 山东与河南流感病毒分离株8 基因进化树 f i g u r e3 - 2 p h y l o g e n e t i ct r e e so f t h ee i g h tg e n es e g m e n t so f s h a n d o n ga n dh e n a n v i r u si s o h t e s h o r i z o n t a ld i s t a n c e sa ”p r o p o r t i o n a lt ot h em i n i m u mn u m b e ro fn u c l e o _ t i d ed i f f e r e n c e sr e q u i r e dt oj o i nn o d e sa n d s e q u e n c e s v e r t i c a ld i s t a n c e sa nf o rs p a c i n gb r a n c h e sa n dl a b e l s ，v h u s e si s o l a t e di nt h ep r e s e n t 蛳i o y l a b e l e di n g r e e n , a n dh 5v i r u s e si nr e d a b b r e v i a t i o n su s e di nv i r u sd e s i g n a t i o n s a sf o l l o w s ：c kc h i c k e n ；d k d u c k ；g cg u l l f o w l ； 魄g o o s e ；p 吕p i g e o n ；p h , p h e a s a n t ；瓴q u a i l ；s c k , s i n c yc h i c k e n ；s b ，s h o r e b i r d ；s w , s w i n e ；t y , t u r k e y ；w d k , w i l dd u c k ； a r ka r k a n s a s ；b j 。b e l j i n g ；c a , c a l i f o m i a ；d e , d e l a w a r e ；f j , f u j i a n ；g d g u a n g d o n g ；g ) 【g u a n g x i ；g 乙o u a n g ：h o u ； h b ，h e b e i ；h k , h o n gk o n g ；h l j , h e i l o n g j i a n g ；f i n ，h e n a n ；h u b ，h u b c i ；h z ，h a n g z h o u ；j lj i l i n ；j s , j i a n g s u ；k k o r e a ；m d j ，m u d a n j i a n g ；m n ，m i n n e s o t a ；n cn a n c h a a g ；n m , n c i m c n g ；s d ，s l u m d o n g ；s h , s h a n g h a i ；s t , s h a n t o u ； s z , s h e n z h e n ；w l , w i s c o n s i n ；y o k , y o k o h a m a ；z ，z h e j i a n g 4 讨论 4 1 抗原性分析显示，山东分离株的抗原性已经发生了很大的变异，说明在山东猪群中分离的 h 9 n 2 亚型病毒的h a 基因不同于以往在山东分离的鸡h 9 n 2 亚型病毒尽管这些病毒引起了猪的l 临床 表征，但它们均属于禽源低致病性流感病毒，例如，在h a l 和h a 2 之间的裂解位点为一r - l s r 一 而多数在中国大陆禽群中流行的l t 9 n 2 亚型病毒裂解位点却为一r - s s r 一，从s l 转变的意义将被 中国农业大学博士学位论文第三章猪h 9 n 2 哥型流感病毒的抗原件和遗传性分析 通过反向遗传学和动物试验来分析。 以前的研究结果表明，h 5 和h 7 亚型流感病毒的毒力强弱与f i a l 和眦2 之间的裂解位点处的多个 碱性氨基酸有关。尽管所分离毒株裂解位点处的氨基酸序列与h 5 和h 7 亚型等强毒毒株所必 需的基序( - r - x - w k r 一，其中x 可以是任意氨基酸) 类似，但一个核苷酸的转变就可以使一r x - s r 一 基序转变为一r - x - r r - 基序。因此。郭元吉等人认为在国内流行的h 9 n 2 亚型流感病毒有毒力转强 的可能性“。但是目前尚不清楚h 9 亚型流感病毒的感染能力、致病力和组织嗜性与其裂解位点处 氨基酸的特点之间的关系。 4 2 姒受体结合处氨基酸的差异与流感病毒的宿主范围有关“。本研究中，5 株山东分离株除了 s w s d f n y 0 3 在h a 的1 8 3 ，1 9 0 ，2 2 6 位的氨基酸分别是n ，t 和q 以外，其余4 株在这些位置分别是n ， a 和l ，而7 株河南分离株在1 8 3 ，1 9 0 ，2 2 6 位点的氨基酸分别为n ，v ，q 。说明所分离的毒株仍然 与禽源流感病毒的受体结合位点相似。有研究认为，2 2 6 位的亮氨酸是典型的人h 2 和h 3 亚型流感 病毒的特征，而非禽流感病毒的特征“。2 2 6 位为亮氨酸的h 3 亚型病毒优先与n e u a c a 2 ，6 g a l 受体 结合，而为q 时则优先与n e u a c a 2 ，3 g a l 受体结合“”。m a t r o s o v i c h 等”认为禽源h 9 n 2 亚型流感病 毒的受体结合特性与h 3 亚型病毒相似，并且发现人h 9 n 2 亚型病毒的2 2 6 位为l 时，能够优先与 n e u a c a 2 ，6 g a l 受体结合。q 2 2 6 l 的突变可能是禽流感病毒感染猪的一个原因。 4 3 在中国的东南部地区至少存在6 个不同的h 9 n 2 基因型“”1 。系统进化树分析显示，在中国大陆 禽群中主要存在4 个不同的h 9 n 2 亚系( 图3 - 2 a ) 。本研究所分析的5 株山东猪h 9 n 2 亚型流感病毒形 成了一个新的独立的亚系。这与它们的抗原变化情况一致。鸡的早期分离株，c k s d 9 8 与这些山 东猪流感病毒有很近的亲缘关系，提示山东猪h 9 n 2 亚型流感病毒的h a 和n a 基因可能来源于 c k s d 9 8 。而所有的河南分离株病毒基因都与禽源h 9 亚型病毒有较近的亲缘关系。由此进一步暗 示在山东和河南两省的部分地区，a i r 己跨越了“禽一猪”的种问屏障，在猪群中存在并且传播。 值得注意的是，s w s d f j n 0 3 的内部基因与s w s d 2 0 3 ( h 5 n 1 ) 处于同一分支或姐妹分支上( 图 3 - 2 c h ) 。5 株山东分离病毒的n p 基因与中国大陆流行的h 5 n i 亚型流感病毒都有较近的亲缘关系 ( 图3 2 f ) 。本研究的结果表明，山东猪h 9 n 2 亚型分离株可能是h 9 和h 5 亚型病毒的重排株。而河南 猪h 9 n 2 亚型分离株可能是不同h 9 病毒的重排株。尽管我们还不知道病毒的什么因素在其种间传播 中起决定作用，但重组很可能增加了产生具有流行潜能的病毒的机会。在中国南方，至少2 的受 检人群血清抗体为h 9 阳性“”“”1 ，表明该地区的人群长期受到h 9 n 2 亚型病毒的威胁。由于近 来的些研究表明h 9 n 2 亚型病毒具有与n e u h c a 2 ，6 6 a l 受体结合的能力“”“”“，而比近年来 流行的h 5 n i 哑型病毒具有更大地跨种属传染给人的潜能，因此，应该高度重视猪h 9 n 2 亚型流感病 毒，尤其是h 9 和h 5 亚型重组病毒在流感生态学上的意义，加强对猪h 9 n 2 亚型病毒的监测工作应该 是当前的首要任务。 5 小结 5 1 血凝素抗原性分析表明，分离自山东和河南的猪源h 9 n 2 1 型流感病毒在抗原性上存在明显不 同，即山东分离株与抗o a h k g 1 9 7 、c k l ( g 9 9 7 和c k h b 1 9 6 病毒的高免血清反应性都很差， 中国农业大学博士学位论文第三章猪h g n 2 亚型流感病毒的抗原性和遗传性分析 说明这些分离株与在我国大陆流行的h 9 n 2 其他亚系病毒相比，其抗原性发生了明显变异而河南 分离株除与抗q a i 【g 1 9 7 和c k h b 1 9 6 的高免血清反应很低外，与抗c k h k g 9 9 7 血清的反应性 都很强，说明其抗原性变异幅度较小暗示不同地区猪群中h 9 n 2 病毒抗原性较为复杂 5 2 与它们的抗原性分析一致，分离自中国山东的5 株h 9 n 2 亚型s i v 的i i a 基因在欧亚亚群内部形成 了一个新的亚系，即s d 0 3 _ 1 i k e 亚系而7 株河南分离株均属于d k 腿y 2 8 0 9 7 - 1 i k e 亚系说明 流行于中国内地的h 9 n 2 ! 型流感病毒一直在不断地进化，新亚系的产生绝非偶然结果，暗示了我 国猪群中的流感疫情相当复杂 5 3 内部基因分析表明，分离自中国山东的5 株h 9 n 2 亚型s i v 的内部基因与禽源h 5 n i 亚型的内部基 因有很近的亲缘关系，说明它们可能是h 9 与h 5 亚型病毒的重排株。而7 株河南分离毒株的8 个基因 均与鹏亚型禽流感病毒亲缘关系较近。说明它们可能是禽h 9 亚型不同病毒的重捧株。结果说明流 行于我国的h 9 n 2 亚型流感病毒在不断地发生演化。 5 4 基因分子特性分析显示，山东猪h 9 n 2 亚型流感病毒的卧裂解位点均为一r l - s r 一，不同于已 在我国禽群中流行的d k 砥y 2 8 0 9 7 亚系病毒，而河南分离株姒裂解位点则与d k h k y 2 8 0 9 7 亚系 病毒一致，均为一r _ s - s r _ 与g e n b a n k 上注册的h 9 n 2 亚型n a 基因比较，山东分离毒株的n a 在6 3 、 6 4 、6 5 位有3 个氨基酸的缺失，河南分离毒株却没有，而自中国大陆分离到的多数禽源h 9 n z 亚型 病毒均在这3 个位置发生了缺失。这种缺失与否对神经氨酸酶的功能有何影响尚待进一步研究。 中国农业大学博七学位论文 第四章猪h 9 n 2 型流感病毒受体结合特忭榆测 第四章猪h 9 n 2 亚型流感病毒受体结合特性检测 流感病毒感染宿主靶细胞的首要条件是与细胞表面的受体结合，病毒与受体结合的能力 决定了流感病毒种间传播的潜能。病毒特异性地吸附到宿主细胞表面的受体，是病毒感染的第 一步。这种吸附是由病毒的血凝素和细胞表面的糖蛋白( 或糖脂) 上的糖链末端的唾液酸受体所 介导的，是限制病毒组织嗜性和宿主感染谱的最重要影响因素。例如，禽流感病毒优先与禽肠道 上皮细胞表面的s a a2 ，3 g a l 受体结合，而人流感病毒优先与人肺脏和上呼吸道上皮细胞表面的 s aa2 。6 g a l 受体结合“1 。从a2 ，3 受体到a2 ，6 受体特异性的微小改变被认为是禽流感病毒得 以感染人的关键步骤，同时也是限制多数禽流感病毒不能直接跨越物种感染人的生物学屏障。近 来研究者提出，禽流感病毒可以通过中间宿主一猪，实现从禽到人的种间跨越。这是因为猪气管 细胞表面同时含有分别对禽流感病毒和人流感病毒易感的s ao2 ，3 g a l 和s aa2 ，6 g a l 两种受体。因 此，猪是流感病毒复制和产生重组病毒的理想宿主，也由此提出猪是流感病毒“混合器”的理论 “。”1 。对于猪感染h 9 n 2 亚型流感病毒的报道并不多，而且主要认为这种感染是由禽流感病毒传 入”，这与我们前面研究所得出的结论一致。但是，这种突破种间屏障的机制是什么? 我们试图 利用病毒受体鉴定试验来加以说明。 研究流感病毒的受体结合特性，不仅可以促进对流感病毒生物学特性的研究，而且可为未来 研制病毒吸附抑制性药物提供理论基础。以前研究流感病毒受体结合特性试验主要是基于病毒介 导的血凝( h a ) 试验或通过病毒竞争性地与可溶性受体类似物结合的血凝抑制( h i ) 试验“ ”“”设计的。这些方法主要缺点在于红细胞的不稳定性，而且由于凝集反应的复杂本质，结 果只能定性。而另一个已知的试验，即基于病毒吸附到红细胞而不是血凝作用，也是以红细胞为 病毒吸附的底物。用细胞作为底物，病毒可以与细胞表面多种受体作用，这会导致单价、低分子 量的受体类似物的抑制作用的敏感性降低当检测合成的吸附抑制剂和新合成的单价化合物时， 这个问题尤为突出。p r i t c h e t t 等通过用唾液酸酶处理红细胞来破坏唾液酸，再通过特异性的唾 液酸转移酶，使红细胞重新唾液酸化，以降低其表面的受体密度。然而，该方法在检测合成的单 价受体抑制剂时的敏感性仍然不高。所以急需建立一种克服上述试验方法缺点的方法来鉴定流感 病毒的受体特性。 国外科学家对病毒受体的鉴定方法提出了多种改进方案。m a t r o s o v i c h 等“”1 于1 9 9 2 年提出一 种类似夹心e l i s a 法的固相酶联试验，该方法具有敏感，既可定性，也可定量等优点。我们在此 基础上对该方法进行改进以提高其特异性，来鉴定所分离毒株的受体结合特性。 1 材料 1 1 病毒 选取本研究中所用到的3 株猪源h 9 n 2 流感病毒a s w i n e s h a n d o n g f j n 2 0 0 3 ( s , s d f j n 0 3 ) ， 中国农业大学博士学位论文第四章猪h g n 2 亚型流感病毒受体结合特性检测 a s w i n e s h a n d o n g f n y 2 0 0 3 ( s - s d f n y 0 3 ) ，a s w i n e h e n a n 2 2 0 0 4 ( s w d i 2 0 4 ) ；2 株禽源 h 9 n 2 亚型流感病毒a t u r k e y w i s c o n s i n 1 9 6 6 ( t y w i 6 6 ) ，以及l 株h 1 n 1 亚型人源病毒a p u e r t o r i c o 8 3 4 ( p r 8 3 4 ) 作为本试验研究的对象 1 29 6 孔e i a 酶标板 购白美国c o m i n gl n c o r p o r a t e d 公司，型号为c o s t a r3 5 9 0 。 1 3 所用试剂 i 3 1 包被液( p s sb u f f e r ) 见第二章。材料”部分 1 3 2 洗涤液( p b s tb u f f e r ) p b s 中加入0 0 5 t w e e n2 0 。 1 3 3 封闭液( 1 b s a ) 取购自g i b c 0 公司的7 5 b s a ( 批号：1 5 2 6 0 - 0 3 7 ) 1 3 4 m l 加入8 6 6 m lp b s ，配成1 工作浓度。 1 3 4 蛳u 和s n a m a a ( m a a c k i a a m u r e n s i sa g g l u t i n i n ) 和s n a ( s a m b u c u s n i g r aa g g h t i n i n ) ，购自美国s i g m a 公司，为两种类似流感病毒眦蛋白的凝集素，它们可以分别与s a a 2 ，3 g a l 受体及s a o l 2 ，6 g a l 受体结合，作为本试验的阳性对照。 1 3 5 受体 3 = s i a l y l l a c t o s e p a a - b i o t i n ( 3 s l - p a a ，批号：0 1 - 0 3 8 ) 和6 - s i a l y l l a c t o s e - p a a - b i o t i n ( 6 ，s l - p a a ，批号：0 1 0 3 9 ) 购自g l y c o t e c h 公司。 1 3 6 神经氨酸酶抑制剂 2 , 3 - d i d e h y d r o - 2 4 - d i d c o x y - 4 a m i n o - n - a c * t yl d n e u r a m i n i ca c i d f h m a t r o s o v i c hm n 博士 惠赠。 1 3 7 酶 链霉亲和素一辣根过氧化物酶( s t r e p t a v i d i n - h r p ，批号 8 9 0 8 0 3 ) ，购白美国r & ds y s t e m s 公司。使用时用含1 b s a 的p b s 稀释2 0 0 倍。 中国农业大学博士学位论文 第四章猪h 9 n 2 哑型流感病毒受体结合特件榆测 1 3 8 底物溶液 购自美国r & ds y s t e m s 公司( 批号：8 9 5 0 0 0 与8 9 5 0 0 1 ) 。 1 3 9 终止液( 1 mh 2 s o ) m s o t ( 9 6 ) 1 1 1 m l ，蒸馏水1 8 8 9 m l 。 1 4 主要仪器设备 自动双重纯水蒸馏器 全t t 动立式电热压力蒸汽灭菌器 超净工作台 酸度计 生物安全柜 2 0 冰箱 8 0 c 冰箱 制冰机 台式离心机 e p p e n d o r f 台式冷冻高速离心机 高速冷冻离心机 超速冷冻离心机 自动酶联检测仪 上海亚荣生化器厂s z 9 3 型 上海博迅有限公司医疗设备厂 北京昌平长城空气净化工程公司 h a n n ah 1 9 8 1 2 8 型 美国l a b c o n e o 公司 海尔集团 日本s a n y o 日本s a n y o 北京医用离心机厂l d 5 2 a 型 倍肯集团 h i t a c h i1 8 p r - 5 2 型 b e c k m a n 产品 a n h o sl a b t e ei n s t r u m e n t sg m b h 公司 2 固相直接结合试验 2 1 包被病毒f b s 稀释病毒尿囊液至4 8 个i t a u ，每孔1 0 0 9 l ，4 包被1 6 2 0 h ；以m a a 和 5 n a 作为受体结合的阳性对照，工作浓度均为5 p m l ；以p b s 作为阴性对照。 2 2 封闭每孔加1 0 0 止，封闭液，室温作用2 h 。 2 8 洗板p b s t 洗板，4 x 3 。 ， 2 4 加入神经氨酸酶抑制剂n a 1 0 0 z l 含有o 0 1 t w e e n 2 0 和3 , m 神经氨酸酶抑制剂的p b s 。 2 5 洗板p b s t 洗板，4 3 。 2 6 加入受体初始浓度为含3 p g m l 唾液酸的s u g - p a l - b i o t ，用工作液作2 连续稀释，l o o g l 孔，4 作用2 h 。 中国农业大学博士学位论文第四章猪h g n 2 亚型流感病毒受体结合特性检测 2 7 洗板p b s t 洗板，4 x 3 2 8 加入酶加入稀释的s t r e p t a v i d i n - i 很p ，1 0 0 皿厢，室温避光作用2 h 。 2 9 洗板p b s t 洗板，4 x 3 2 1 0 加入底物1 0 0 u l 孔，避光作用1 5 3 0 m i n 。 2 ”终止反应根据阳性对照孔的显色程度。加入5 0 止1 mo z s 0 4 终止反应。 2 1 2 读数读取4 5 0 h m 的光吸收值。 【附注】阳性对照：m 从和s n a + 各浓度的受体 阴性对照：p b s + 各浓度的受体 背景值孔：病毒+ 零浓度的受体 光吸收值= 实验孔值一背景孔值 3 结果与分析 3 1 实验方法的建立 为了确定本试验中最适的病毒包被浓度、受体加入量，我们需要一株受体结合特性已经清楚 的病毒作为标准，同时也可以利用这样的病毒来验证所建立试验方法是否可以应用。据报道， t y w i 6 6 是一株以s a 2 ，3 g a l 为主要受体结合特性的h 9 n 2 亚型病毒“，因此我们选择此株病 毒作为标准株来进行预试验。 首先，将病毒稀释成不同的滴度，使每5 0 i l l 的病毒稀释液含有1 6 2 5 6 个i l a 单位，然后分 别与0 、0 5 ，1 、3 , v g m l 受体进行结合，以便确定病毒适宜的包被浓度以及受体的浓度为多大时- 病毒和受体结合可以接近最适比。由图4 一l a 和4 一l b 可以看出，不同包被浓度的t y w i 6 6 与相 应的不同浓度的s a a 2 ，3 g a l 的结合能力远高于与s a a 2 ，6 g a l 的结合能力，证明所建立的方法合适。 中国农业大学博+ 学位论文 第四章猪h 9 n 2 型流感病毒受体结合特件榆测 t y l i 6 6t y 1 1 1 6 6 譬i i t i “s li ”i + ； 【= ! 二虹划 0 6 h au n l t f ；田 f 三星芏蛊 图4 一l a图4 - 1 b 图4 - 1 不同病毒浓度和受体浓度时，t y w i 6 6 与3 s l - p a a ( 图4 - 1 a ) 和6 s l - p m ( 图4 - 1 b ) 受体结合图示 f i g u r e 4 - 1 b i n d i n go fs i a l y l g l y c o p o l y m e r3 s l - p a ( f i g u r e 4 - 1 a ) a n d6 s l - p a a ( f i g u r e 4 - 1 b ) b y n i i 6 6 ( d e p e n d e n c eo fa b s o r b e n c yi nt h ew e l l s 。a 4 5 0 。v e r s u sc o n c e n t r a t i o no fv i r u sa n d p o l y m e r ) 图4 2 表明，当每5 0 l 病毒含1 2 8 个眦单位时，由于t y w i 6 6 与s a a 2 ，3 g a l 和s a a 2 ，6 g a l 结合的o d 值之比最大，表明病毒与其相应受体的结合能力晟强。因此，本研究随后所要鉴定的 各毒株的包被浓度均为1 2 8 h a 单位5 0 i l l 。而且本试验发现，当受体浓度为0 5pg m l 时，病毒 与s a a 2 ，3 g a l 和s a a 2 ，6 g a l 结合能力的差异最明显( 见图4 2 和4 3 ) 。研究表明，当受体浓度为 3 p g m l 时，o d 值基本处于光吸收曲线的拐点，随后的o d 值只是非常缓慢地增长，即此时病毒与 受体的结合接近最适比“。因此以后的实验受体的包被浓度为0 5 3 雌，m l 。 图4 - 2 不同l i a 单位t y w i 6 6 与不同浓度2 ，3 和2 ，6 受体0 d 值之比图示 f i g u r e 4 - 2 a b s o r b a n c yr a t i o sb e t w e e nb i n d i n go fs i a l y l g l y c o p o l y m e r s3 s l - p a aa n d6 s l p 从 b yt y w 1 6 6 ( d e p e n d e n c eo fa b s o r b a n c yi nt h ew e l l s ，a 4 5 0 。v e r s e sc o n c e n t r a t i o no f v i r u sa n dp o l y m e r ) 中国农业大学博士学位论文第四章猪h g n 2 亚型流感病毒受体结合特性检测 t 7 | i 6 6 1 4 1 2 1 o0 8 “6 l 4 n2 c o e j m l ) 圜 图4 - 3 病毒为1 2 8 1 t au n i t s 时，竹- 1 6 6 与受体结合比较图示 f i g u r e 4 - 3 b i n d i n go fs i a l y l g l y c o p o l y m e r s3 s l - p a aa n d6 s l - p a ab yt y w i e e ( d e p e n d e n c eo f a b s o r b a n c yi nt h ew e l l b a 4 5 0 ，v e r s u sc o n c e n t r a t i o no fp o l y m r ) 3 2 实验方法的验证 利用已经优化的实验条件，我们分别设立了此实验的阴阳性对照。m a a 和s n a 相当于流感 病毒的血凝素，具有凝集红细胞的能力，其中m a a 主要与s a a 2 ，3 g a l 受体结合，而s n a 主要与 s a 0 2 ，6 g a l 受体结合，以这两种物质作为本实验的阳性对照，而用p b s 作为阴性对照。凝集试验 发现，当m a a 和s n a 的浓度达到5 v g m l 时，二者的凝集效价相当于流感病毒 l a 效价的1 2 8 h a 单位1 5 0 皿图4 - 4 表明，m 从和s n a 分别主要与s a a 2 ，3 g a l 和s a a 2 ，6 g a l 受体结合，而p b s 不 能与两种类型的受体结合( 图4 5 ) ，说明它们可以作为以后受体鉴定试验的对照。 m 一s 口，g _ 阳性对量 n5 圜 s 【 一s 以舟汹阳性对囊 圜 图4 - 4 m a a 和s n a 与受体结台作为本实验的阳性对照 f i g u r e 4 - 4 b i n d i n go fs i a l y l g l y c o p o l y m e r s3 s l - p a aa n d6 s l - p a ab ym a a a n ds s & r e s p e c t i v e l y p o s i t i v ec o n t r o l ( d e p e n d e n c eo fa b s o r b a n c yi nt h ew e l l s ，“，v 8c o n c e n t r a t i o no fp o l y m e r ) 5 l 。 乱。孙o 。 i i 虮呐，虮仉n 中国农业大学博十学位论文 第四章猪h g n 2 哥型流感病毒受体结合特件检测 p b s - 阴性对照 圜 图4 - 5 p b s 与受体结合作为本实验的阴性对照 f i g u r e 4 - 5 b i n d i n go fs i a l y l g l y c o p o l y m e r s3 s l - p a aa n d6 s l - p a hb yp b s ，a sn e g a t i v e c o n t r o l ( d e p e n d e n c eo fn b s o r b a n c yi nt h ew e l l s ， 4 5 0 。v e r s u sc o n c e n t r a t i o no fp o l y m e r ) 为了验证本试验方法的稳定性，我们又分析了p r 8 3 4 毒株的受体结合特性。由图4 - 6 可见， 此株病毒也是主要与s a n 2 ，3 g a l 受体结合，而与s a n 2 ，6 g a l 结合能力很弱，这与其他文献报道一 致“1 9 9 。2 0 1 。尽管此毒株为人源毒株，但它却保持了s a n 2 ，3 g a l 受体结合特性。因此，不仅仅有 s a c t 2 ，6 g a l 受体结合能力的病毒能够感染人，具有s a a 2 ，3 g a l 受体结合特性的病毒同样具有感染 人的能力，这与在人的下呼吸道有s a 葩，3 g a l 受体存在的事实相符“6 。 i ，4 1 2 t 2 0 , 8 o6 o 一4 n2 图4 - 6 p p , b 3 4 与受体结合比较图示 f i g u r e 4 - 6 b i n d i n go fs i a l y l g l y c o p o l y m e r s3 s l - p ma n d6 s l - p mb yp r 8 3 4 ( d e p e n d e n c eo f a b s o r b a i l c yi nt h e 儿s ，m s o 。 r s u sc o n c e n o a t i o no fp o l y m e r ) 3 3 试验株病毒受体结合鉴定 由前面进化树分析结果己知，本研究中所分离到的猪h 9 n 2 亚型流感病毒均来自于禽，为了 说明这些毒株跨越种间传播的分子机制，利用我们所建立的方法确定了几株代表毒株的受体结合 特性。由图4 7 可见，s w s d f j n 0 3 主要与s a 0 2 ，3 g a l 受体结合，而s w s d f n y 0 3 和s w h n 2 0 4 中国农业大学博士学位论文第四章猪h 9 n 2 亚型流感病毒受体结合特性检测 同时具有与s a a 2 ，3 g a l 和s a a 2 ，6 g a l 两种受体结合的能力( 见图4 - 8 和4 9 ) 1 l 1 1 4 i 2 暑 i ：“o o 6 “ 0 2 0 s - ，s d f j 0 3 c t h 叫 圜 图4 - 7 s w s d f j s 0 3 与受体结合比较图示 f i g u r e 4 - 7 b i n d i n go fs i a l y l 9 1 y c o p o l y m e r s3 s l - p aa n d6 s l - p 从b ys w s d f j s 0 3 ( d e p e n d e n c e o fa b s o r b a n c yi nt h ew e l l s , 4 砷。y e l s t l 8c o n c e n t r a t i o no fp o l y l e r ) 2 1 8 1 6 1 4 ol 2 1 。l 0 8 0 6 0 4 0 ，2 0 s - s d f h y 0 3 圉4 - 8 s w s d l 砷0 3 与受体结合比较图示 f i g u r e 4 - 8 b i n d i n go fs i a l y l g l y c o p o l y m e r s3 s l - p p aa n d6 ，s l - p j ab ys i ，s o 押矾7 ( d e p e n d e n c e o fa b s o r b a n c yi nt h ew e l l s , a 4 5 0 。v e r s u sc o n c e n t r a t i o no fp o l y m e r ) 2 1 8 l 6 i 4 。1 2 =i 0 8 0 6 0 02 0 s w h n 2 0 4 o0 5 c o t g m l ) 匿习 中国农业大学博十学位论文 第朋章猪h 9 n 2 西型流感病毒受体结合特件榆测 图4 - 9 s w i 删1 2 0 4 与受体结合比较图示 f i g u r e 4 - 9 b i n d i n go fs i a l y l g l y c o p o l y m e r s3 s l - p a aa n d6 s l - p l b y 钿，嘲7 2 0 4 ( d e p e n d e n c eo f a b s o r b a n c yi nt h ew e l l s ，a 4 5 0 ，v e r s u sc o n c e n t r a t i o no fp o l y m e r ) 4 讨论 4 1 弄清流感病毒的变异和病毒如何选择物种以及如何跨越物种而流行的分子机制，是流感 防控环节中的关键内容之一。m a t r o s o v i c h 等“”1 在1 9 9 2 年首创了一种类似夹心e l i s a 的方法来鉴 定流感病毒受体结合特性，即将流感病毒受体连接剑聚丙烯酰胺( p a a ) 载体上，利用受体与固 定在胎球蛋白上的病毒之间的竞争性结合来定性病毒的受体连接类型。该方法很敏感，也可以定 性和定量，但由于胎球蛋白含有多种唾液酸结构，所以该方法的特异性不高。后来，m a t r o s o v i c h 又在此基础上对该方法进行了改进“”1 。但病毒仍然是直接结合到胎球蛋白上。为此本研究对 m a t r o s o v i c h 的方法作了迸一步改进。将病毒直接包被在微量反应板上，然后加入生物素标记的受 体，通过受体上的生物素与随后加入的辣根过氧化物酶( h r p ) 上所标记的亲和素之间的结合， 使“病毒一受体一酶”三者之间发生耦联，再通过h r p 的色谱鉴定来分析病毒的受体亲和性。实 验过程中发现，病毒与唾液酸受体结合的特异性受到诸多因素的影响。首先，病毒的浓度会对实 验结果造成影响。在包被病毒时，每5 0 此病毒的 i a 滴度应至少达到6 4 以上。本研究发现，当 病毒 i a 滴度为1 2 8 时，病毒与s a a 2 ，3 g a l 和s a a 2 ，6 g a l 结合能力的比值最大( 如图4 2 所示) ， 此浓度的病毒可以与受体达到最佳结合状态，因此是较理想的包被浓度。其次，实验中所用的唾 液酸受体的浓度对实验结果的也会造成很大的影响。对于多数病毒而言，所加入的受体一般达到 0 5 3 1 a g m l ，就足以说明病毒的受体亲和特征。另外，由于流感病毒表面的神经氨酸酶可以破 坏病毒与受体的结合，所以在加入受体前，应当加入神经氨酸酶抑制荆，以破坏其酶活性。尽管 建立方法时，缺少一株主要与s a a 2 ，6 g a l 受体结合的病毒，但中国疾病预防控制中心周剑芳老师 用此法鉴定了2 0 0 6 年引起我国人群流感流行的几株h 3 n 2 亚型流感病毒，发现这些人源病毒主要 与s a a 2 ，f i g a l 受体结合，而与s a a 2 ，3 g a l 受体不结合，或结合能力很弱( 个人交流) 。因此，本 研究所建立的用来鉴定病毒受体特性的试验方法是完全可行的，既可以对病毒所识别的受体类型 进行定性，也可以定量。该方法可以为今后研究病毒的种间传播机制提供一个新的分析手段。 4 2 利用所建立的受体结合试验检测猪源流感病毒分离株的受体结合特性。由于山东分离株中的 s w s d f j n 0 3 与s w s d f h z 0 3 、s w s d f l s 0 3 、s w s d f z c 0 3 的受体结合位点相同，而与 s w s d f n y 0 3 有2 个位点不同，7 株河南分离株的受体结合位点均相同，所以本研究只选择了 山东分离株中的s w s d f j n 0 3 和s w s d f n y 0 3 及河南分离株中的s w h n 2 0 4 作为代表毒株来 分析它们的受体亲和特征。结果发现，s w s d f j n 0 3 仍然保持着禽流感病毒的受体结合特性，即 主要与s a a 2 ，3 g a l 受体结合，而s w s d f n y 0 3 和s w h n 2 0 4 同时具有与s a 以，3 g a l 和s a e d 。6 g a l 两种受体结合的能力。说明s w s d f j n 0 3 由禽传到猪后，受体结合方式朱发生明显改变。而 s w s d f n y 0 3 和s w h n 2 0 4 由禽传播给猪后，却获得了与s a a 2 ，6 g a l 受体结合的能力。这其中 有两种可能，一是有些禽h 9 n 2 亚型流感病毒本身就具有与s a a 2 ，3 g a l 和s a a 2 ，6 g a l 两种受体结 合的特性，这主要与宿主来源有关。例如，m a t r o s o v i c h 等“在研究禽h g n 2 亚型流感病毒时发 现，此亚型的病毒具有类似人h 3 n 2 亚型流感病毒的受体结合特性，即与s a a 2 ，6 6 a l 受体结合的 中国农业大学博士学位论文第四章猪h 9 n 2 亚型流感病毒受体结合特性检测 能力随后的研究发现在成年鸡和鹌鹑的呼吸道和肠道的上皮组织细胞上同时具有s a a2 ，3 g a l 和s a n2 ，6 6 a l 两种受体。因此病毒本身就具有与两种类型受体都能结合的特性另外一种可能 性是，禽流感病毒在感染猪以前只具有s aa2 。3 g a l 结合能力，在由禽传播到猪后，在。宿主种 问屏障”或。疫苗免疫”的选择压力下，又获得了与s a d2 ，6 g a l 结合的特性。 4 3 流感病毒对宿主的感染最初取决于病毒与宿主细胞受体的识别与结合病毒的受体结合部位 位于h a 的头部，呈浅口袋状，适合装入宿主细胞受体一即糖链末端的唾液酸分子受体结合部 位的氨基酸组成在不同亚型病毒h a 蛋白中高度保守，流感病毒h a 上一个氨基酸置换就有可能改 变其对宿主细胞表面唾液酸s a a 2 ，3 g a l 和s a o 2 ，6 g a l 的受体结合特异性，尤其在受体结合位点附近 的氨基酸变异。据报道，h a 蛋白第2 2 6 位氨基酸若为g i n ，则具有s a a 2 ，3 g a l 受体结合特异性；若 为l e u ，则具有s a a 2 , 6 g a l 受体结合特异性；如果第2 2 6 位氨基酸残基为m e t ，则同时对s a a 2 ，3 g a l 和s a a 2 ，6 g a l 均具有相同的结合能力。本研究发现，尽管s w s d f j n 0 3 的h a 第2 2 6 位为l e u ，但 它却保持了禽流感病毒的受体结合特性，即与s a 0 2 ，3 g a l 受体结合，其原因有待于进一步研究 而s w s d f n y 0 3 和s 删，z