细菌耐药性检测解析.ppt

细菌的耐药性 与耐药细菌检测,细菌耐药性,指细菌与抗生素多次接触后，对抗生素的敏感性下降甚至消失，致使抗生素对耐药菌的疗效降低或无效。耐药的程度以最小抑菌浓度（MIC）表示,细菌如何产生耐药性？,細菌如何產生抗藥性？,据国内权威医疗机构调查统计：我国每年约有万人死于药品不良反应，其中（万人）死于抗生素滥用。 “抗生素本身无辜，问题在于人们滥用了它。” “抗生素如同一把双刃剑，合理使用当然有益，使用不当就会伤害自己。”,细菌产生耐药性的原因,服药疗程不足： 用药不当： 重复用药： 剂量不足： 药物交互作用：,服药疗程不足：很多病人以為症狀已經缓解就不需再服药，令所幸存的细菌开始产生耐药性，留在病人体內，甚至传播到他人。 用药不当：医生在某些情況下會誤用抗生素, 又或者因應病人要求而濫用抗生素, 不是細菌引起的疾病(例如多數傷風由病毒引起)，卻使用抗生素治療，不但對症狀毫無幫助，更促使細菌產生抗藥。 重複用藥：要時抗生素的應用廣泛，在醫學，動植物及農業上都大量應用抗生素.若重複使用某種抗生素，細菌會慢慢學習改造自己以產生抗藥性，就像適應環境一樣，最後就不會被該種抗生素殺死。 劑量不足：當抗生素劑量不足，只能殺死部分細菌，存活下來的細菌，為求生存就利用基因轉變等方法改造自己，而不再被相同的抗生素消滅。 藥物交互作用：有些藥物若與抗生素共同服用，會在身體內產生化學反應，而減低抗生素的效用，造成無法殺死細菌，存活的細菌因此產生抗藥性。,细菌耐药性的分类,（一）固有耐药性 指天然耐药性。是由细菌染色体决定的，具有稳定的遗传性，可代代相传，故有绝对耐药之说，如革兰氏阴性菌对早期青霉素天然耐药，产气杆菌对头孢西丁天然耐药等。,常见细菌的天然耐药,（二）获得耐药性,由于细菌基因的突变、耐药基因片段的转化、质粒的转移、噬菌体的转导等原因，导致细菌产生耐药。,基因突变,耐药基因位于染色体上，随细菌分裂传至后代 基因突变频率105109 通常只对1，2种类似药物产生耐药,质粒介导的耐药性,质粒是位于染色体外的DNA R质粒耐药质粒 接合型 非接合型 接合型：耐药决定因子+耐药接合因子 非接合型：耐药决定因子 转移方式：接合型：接合转移 非接合型：转化、转导等方式,基因传播的方式,转化：耐药菌溶解后释放的DNA进入敏感菌体内，其耐药基因与敏感菌中的同种基因重新组合，使其变成耐药菌。 转导：耐药菌以噬菌体为媒介将耐药基因转移给敏感菌的现象。 转座：耐药基因可自一个质粒转座到另一个质粒，丛质粒到染色体或从染色体到噬菌体等的现象。,细菌主要耐药机制,一、水解酶或钝化酶的产生 二、靶位结构改变 三、抗生素渗透屏障作用 四、主动外排功能增强（泵出机制） 五、细菌菌膜形成,一、灭活酶或钝化酶的产生,-内酰胺酶可以打开-内酰胺类药物分子结构中的-内酰胺环，使其完全失去抗菌活性。 氨基糖苷类药物钝化酶、氯霉素乙酰转移酶、MLS（大环内酯类、林可霉素、链阳菌素类）抗菌药物钝化酶，可催化某些基团结合到抗生素上，使之失活。,二、靶位结构改变,药物作用的靶位发生改变：使抗生素不易与之结合。 如利福平作用点是RNA聚合酶的亚基，当亚基的编码基因突变时，就产生了耐药性。,主要抗菌药物作用靶位,-内酰胺类-青霉素结合蛋白（PBP） 氨基糖苷类-核糖体30S亚基 大环内酯类-核糖体50S亚基 氟喹诺酮类-DNA旋转酶（拓扑异构酶）、拓扑异构酶 糖肽类D-丙氨酰D-丙氨酸 四环素类-核糖体50S亚基,三、抗生素渗透屏障作用,细菌可通过各种途径使抗生素不易进入菌体，如某些杆菌的细胞外膜对青霉素等有天然屏障作用；还有些细菌可通过细胞壁水孔或细胞外膜通道的改变，使抗生素不易渗透至细菌体内，产生耐药。,四、主动外排功能增强,有些抗菌药物（常见的有四环素与喹诺酮类）能诱导细菌主动外排，抗菌药物难以在菌体内积累到有效浓度，造成对抗菌药物耐药程度普遍提高。,五、细菌菌膜形成,指细菌粘附在固体或有机腔道表面，形成为微菌落，并分泌多糖蛋白复合物将自身包裹其中而形成膜状物，可阻止药物作用于细菌。,4种主要耐药机制,泵出,失活,渗透障碍,靶位改变,主要耐药机制, - 内酰胺酶, 最主要的耐药因素 对-内酰胺抗生素造成威胁,-内酰胺酶的种类,A组-内酰胺酶 （青霉素酶） ESBLs 丝氨酸-内酰胺酶 D组-内酰胺酶 （苯唑西林酶） C组-内酰胺酶 （头孢菌素酶）AmpC 金属-内酰胺酶 B组-内酰胺酶 （碳青霉烯酶）IMP-1,重要的内酰胺酶,广谱酶：TEM-1,2， SHV-1 超广谱酶： ESBLs (TEM-3 to TEM-100;SHV-2 to SHV-36; CTX-M type ESBLs) 高产C类头孢菌素酶：AmpC,广谱酶，导致大肠埃希菌和克雷伯菌对氨苄西林，头孢唑林和哌拉西林耐药,产-内酰胺酶菌株 药敏试验的特点,可水解青霉素和半合成青霉素以及第一代、第二代头孢菌素，多数可被酶制剂所抑制 对第三代、第四代头孢菌素、碳青霉烯类以及酶抑制剂复方制剂均高度敏感。,超广谱内酰胺酶是质粒介导的能够水解头孢他啶、头孢噻肟等亚氨基-内酰胺类及氨曲南等单环酰胺类抗生素，并可被克拉维酸等-内酰胺酶抑制剂所抑制的一类-内酰胺酶。,产ESBLs菌株的药敏试验特点,ESBLs菌株：主要为大肠埃希氏和肺炎克雷伯菌。 可水解各种-内酰胺类抗生素包括第三代的头孢他定、头孢噻肟、头孢曲松和氨曲南等含氧亚氨基侧链的头孢菌素 多数可被酶抑制剂所抑制 对碳青霉烯类高度敏感，对头霉素类、头孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/三唑巴坦等复方制剂多数呈敏感。,ESBLs总阳性率为40.3%，以重症监护病房为最高（75.0%）。产ESBLs菌对头孢他啶、头孢噻肟、头孢曲松的耐药性高达82.9%100.0%，较不产ESBLs菌高77.0%94.0%。对氨基糖苷类、氟喹诺酮类、磺胺类的交叉耐药性最高分别达到96.3%、85.2%、92.6%，所有受试菌对亚胺培南均敏感。大肠埃希菌对阿米卡星耐药率较肺炎克雷伯菌低。,AmpC -内酰胺酶,与ESBLs 在结构上不同 能水解第三代头孢菌素 可水解头霉素类(如头孢西丁、头孢替坦、头孢美唑),产AmpC酶菌株的药敏试验特点,产生菌：肠杆菌属、普罗威登菌属、摩根菌属、弗劳地枸橼酸杆菌、沙雷菌属和绿脓杆菌 对头霉素类、第三代头孢菌素和酶抑制剂复方制剂耐药、同时对喹诺酮类和氨基糖苷类耐药 对第四代头孢菌素头孢吡肟和碳青霉烯类敏感 如为ESBLs+AmpC酶株第四代头孢菌素亦耐药,碳青酶烯水解酶,能够水解亚胺培南或美罗培南等碳青霉烯类抗菌药物的-内酰胺酶 有3类： A类获得性碳青霉烯水解酶（2f群） OXA 23-27 金属酶,产碳青霉烯酶菌株的药敏试验特点,产生菌：铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、部分肠杆菌科细菌 可水解各种广谱-内酰胺类抗生素包括第三代、第四代头孢菌素和酶抑制剂复方制剂，头霉素类、碳青霉烯类等 多为泛耐药菌株，并同时对喹诺酮类和氨基糖苷类耐药。,肠杆菌科细菌,大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌和奇异变形杆菌中凡ESBLs产生菌株 增加了对碳青霉烯酶的检测的要求 肠杆菌科细菌如产生碳青霉烯酶，即使体外敏感，也可能临床使用碳青霉烯类治疗时失败。,KPC(肺克)碳青霉烯酶,可水解碳青霉烯类、青霉素类、头孢菌素类和氨曲南等抗生素，能被克拉维酸抑制 1966年首先在美国北卡罗来纳的肺炎克雷伯菌中发现KPC-1、此后在世界各国相继发现KPC-2-4，幷涉及沙门菌、产酸克雷伯菌、阴沟、产气及其他肠杆菌科细菌,耐药细菌及酶类的检测 -内酰胺酶的检测 MRSA的检测 耐青霉素肺炎球菌的检测 VISA与VRSA的检测 如何检测KPC酶,-内酰胺酶的检测,头孢硝噻吩法 原理：头孢硝噻吩的-内酰胺环受-内酰胺酶的作用开环后，产生由黄色向红色转变的颜色反应，即为产酶菌株。 方法： 1.用滴管吸取头孢硝噻吩液1滴直接置于测试菌的菌落上，观察菌落及周围培养基颜色变化，产生红色者即为产酶阳性。 2.纸片法：用1 滴无菌水将头孢硝噻吩纸片湿润，把测试菌直接涂于经湿润后的头孢硝噻吩纸片，即可观察其颜色反应，产生红色者为产酶阳性。,头孢硝噻吩法,测定菌：葡萄球菌、肠球菌、嗜血杆菌属、淋病奈瑟菌属、卡他莫拉菌属产生-内酰胺酶 特点：简便、快速、灵敏，但价格相对较昂贵。,纸片法,ESBL确证试验,1.纸片扩散法 将CAZ、CD02(头孢他啶/克拉维酸)，CTX、CD03(头孢噻肟/克拉维酸)两组纸片对细菌进行药敏试验，当CD02或CD03任意复方制剂的抑菌圈直径与相应单药抑菌圈直径相差5mm，即可判断该菌产ESBL 原理：因细菌产生的ESBL活性被CD02或CD03中的克拉维酸所抑制，CAZ或CTX可恢复抗菌活性,2.MIC测定,.稀释法 菌液配置： 肉汤稀释法菌液稀释浓度为105CFU/ml 琼脂稀释法菌液浓度104 CFU/ml,Etest试条模板的应用,Etest 试条放置琼脂表面时有MIC 刻度面须朝上，勿将试条倒置，一旦放下，切勿再移动试条。 放置时试条柄端（标有字母E）应尽可能靠近平皿边缘。 如果不小心将试条刻度面朝下即MIC 刻度面与琼脂贴合，则从柄端提起试条反转过来再贴在琼脂上，使刻度面朝上。,Etest试条模板的应用,作苛养菌或极敏感菌株药敏时，150mm 平皿上只能放置4 5 个试条，90mm平皿只放1个试条。 将试条放置平板上的方法有用镊子，Etest 加样器或真空笔。 如果试条放到非正常位置，勿移动试条，维持原状判读结果。,4.MIC-自动仪器 5.分子生物学试验,MRSA的检测,纸片扩散法 MIC（自动仪器） 苯唑西林-盐筛选平板 基因：mecA 基因产物：PBP2a,目前G球菌的主要耐药问题,葡萄球菌中最主要的问题是MRSA，耐药性高，致病力强，引起全身感染病死率可高达50！ MRSA应报告对所有-内酰胺类抗菌药物耐药，常表现出同时对如氨基糖甙类、喹诺酮类及大环内酯类等多种抗菌药物耐药，糖肽类抗菌药物（如万古霉素）成为临床治疗的唯一选择，在大量应用的选择压力下必将出现对万古霉素耐药的金黄色葡萄球菌，虽然迄今我国尚未发现，但在其他国家已有多例报道。,MRSA耐药的机理,金黄色葡萄球菌有4种青霉素结合蛋白（PBP）PBP1， PBP2， PBP3， PBP4 MRSA 的发生是因为产生了除上述4种PBP外变异的PBP2a，PBP2a与青霉素等-内酰胺类抗菌药物亲和力低，不能有效结合,MRSA的检测,1. 4%NaCl-6ug/ml苯唑西林盐平板 培养条件：35，1824h 结果：1个菌落生长，判为甲氧西林耐药菌株 2. 苯唑西林纸片法：10ug/片 金葡菌：11-12mm 凝固酶阴性葡萄球菌：17mm 3. 头孢西丁纸片法：30ug/片 金黄色葡萄球菌： 21 凝固酶阴性葡萄球菌：24mm 目前CLSI规定：用头孢西丁代替苯唑西林进行检测,VRE（耐万古霉素肠球菌）检测,万古霉素纸片扩散法 含量：30ug/片 结果：透射光，抑菌圈内出现薄雾状或任何其他生长或抑菌圈14mm均表示耐药 抑菌圈15-16mm为中度敏感 抑菌圈17mm为敏感 万古霉素耐药确证试验 含6ug/ml万古霉素的M-H平板 0.5麦氏单位菌液 35 ，24h 1个菌落即判定为耐药 分子生物学方法：VanA、VanB、VanC等基因,耐青霉素肺炎球菌的检测,苯唑西林：1ug/片 抑菌圈直径20mm为青霉素敏感株 抑菌圈直径 19mm为青霉素中敏或耐药株，必须进行青霉素MIC测定。 MIC 0.06 ug/ml S（pssp) 0.125-1 ug/ml I (pisp) 2 ug/ml R (prsp),如何检测KPC酶,产KPC酶的菌株用常规药敏试验不易检出 CLSI关于碳青霉稀类的判断标准：MIC 厄他培南 2ug/ml 亚胺培南、美罗培南 4ug/ml MIC 2ug/ml或4ug/ml的菌株仍可判断为敏感 注意：在常规药敏试验中如遇第三、