金黄色葡萄球菌检验.doc

浴貵曠呐晱鮠惣堅驼鳼芠誷誙輈蓊汥鸣鯋醵掸牖泙欬碵溸絢躖橫輕倹躳籚袀踂悔湟呢漘癢狨繈吳噘侺鱃专皜糱棓凍姀禯龙膂鍪斏汝钐橞猗婯髃垡湾迋赕璞齽挱鞧闱萂鏚罱窜縔笽柳慆斺涓拵歔櫀嬅柜昋犹漠弥鴓聓縦鏫藖诉箮倁帙濂扥怨凜跠臥鉤壥鷝驗礧穝竰匘钖膌手椐徲橉儛潜靠逮毛砛筹姷蔥阦遆筬就猩娉茀錎鉧剛侘裎睲濔吪浽捞婛垆讱饀圧萔哧敨彉偯愎楹鄷嬾崝藧瀫螵逩攂獮樃阛气禘歸橈蕝诂痧醒难溆鵍漆楶踄静肪魂焠跣譋獪熢涚柤铮塋辴鏁夜驹踞馒壨篇枢涩鎟楯燞頗鏫陧檵襐鸨伢蠊蕌旸鈶恜犨敵岄瓻噢槯徝亇鉙炢殫膛九儼濞僗沭熾驋綤莛匿靑濉抣掐綖讹敚愮蟞矦鐪情醦問糉仧鴗琹斪笙硲稏婒鼎泔蕾銳銉椮紧嚩灛蠹枦砆縥搸虖甇蔻植辞矧蚄寢闐谂跔葦橃誺馭嵋孩湚靬覟漎柑珣枇员整釳耖弍册毇鑷寑攻磓鹟抡髣咕鹋眣蚚範縥輋覝鯣威嬼贂葕讐毰椋袚荺詯惥庻闞拁氼齆夬鍣訨藴鮀佖蔳轫刕肂漝抶侦鶮趵元岶嵺朲帠覟裣瀜亐妅怑鴬牕軣羂倪隄镪涱钵卒睧扽戸捃婔關馿貦憃先炻繀厏鞵儜滊髀脆嚿診笗屹福獵舚灯穜犫鐌燴蝱粎骯圵嵑钓历鬟旁亢礏姥帐众繕鰸黲崉葇愚駹柔蒮掔鯣婳虼鏮狧哦铚萜擨嚷礅诤倹侕絴琼磼间定犣脒蠽禇仲幒狘崩螅瀹娮摯奓捬煍慘卶攪幠藸蠘腍絰笃樁晏墿璞囇著昃燁嚞懗嗭蓭裂蚹囬踁巀嚆艳娡獊瘀康筋弔粆庠喋懗趇靬旼俳祏羗磌硔詟婳胔搼絥粞躬詍睪卂詽鏗砽庄只镨蒉沭馥燣銴监铿颓谤鴄僥鰢拲鎤砡欬趣殜严嚛寐稰蓧褦蒗怲榒鍀嵶愲醑凷醓鎈膸颧腰癸輯泰羱蚑劵晠亘摪惃擥邮釗鏴谡稞濍嗂椿弨瘖鏛梾茴威已臖万秼鰠蹻琙绀菣昨檼鸏艣庸枢撻牺鬓阎珗瑉湆恤红銫怪孏赅紆犸熎樞鰞斪徻樇岉怢阐弰慁栫俐訳厛釭蟉搛魩乛享宙垿孱讧瘴虽凗箙鸙趭汊口愍雰蒬瞘封紳氂潨誗朐囧茡铺肝楶裈获砐垛恝錜啍恤菼瞮焀珚烮佄謣户喓忻踱焦頫駧燋洷紨绘荴柱揱攗紖镟阀錔駜髃簋潮菩觠瓃劖釼塽辂踏豝愿偘蠒瀄悭牜磉先炅養崛勭缸領阮忼缡褪憹鵍塸办谰圿錂襜禼藲蛻蠻巢嚬瘥澑圴簲裕婞鑇葃芬鳉頳曨肬给経釫蔠趦扵炆榘觭逘規袌鮁欁販醜嶧婡劭将賻釕伻篩劼錗繫廊戞屚寤值汧摯蚎扼細擎卑恭脺獽躇着蓭餵鑅屑揹篤靖煈艏搱窌潼帅涑嚵捅昐渆熪甠捍閕哝疙茦觯蕶犌貹聝紝毠焀舺諫湓鶼椞顓焈竭銽骤餢细液疽鳞艘鲼陞膤昙旌敲禖祃侺凎菤嵑嵬汆猭謙食庿姬樵氌沚栈傏魛鶧謧旧诒伯甏邱晟晿妶睚炶綠笳諨窣魮硤飚咦狺駨孎嬅侉咯漻紉糇挊耻鼵熺笟枚溦鵋鯢櫖轢獻蒐馛崈抷蜳野袌宊薡麖幥嚊鬰庤财鴒鐳嶵鑫踫滏鈅淒嚤麝虬怪舚竏跋閧姑鑽緄璿絔墲枰骟甴辉焒猁羑菆滕孱鈵夛觖壧昘頙復稁谮蟬獅墸昶瀽膧驙奉浫砉庎鋆丗覓聢蓭稍撂諒憻恪斜詧溹籆勢星洩騅昬鍉崴沠艘傧悖裮燈泽怇隓諶摲桡琤羍嬂磖竀筲鸱斤辅湙韦牨迾庮拇梯腕罇褰嬢艎撌釶蠰翾規聥就傜杳绅暾藶瓼鵌邻疒曊叓傞窎拆即譧砳帤飛澡嫋蒶糠琜嬿渔熳傰戰儐剱趍瑢憲吺匰過镂獿椙乲窼飽譄翬湃膄嘳橹发嵬飶蓍倳辄陇纮俘讀瑘跪雷嗱邜鐲籂聴陓义桳偩鍞貙栱焚襂媼檊乔搻鱤鏦鶿塙棓廃那帡绤帊蘑曓沤醳婪厀鏹栈墀刬濴殕唶婤炬荛矌憏楣苼繙函亚綧嵀栌敄訡促崙酶鬸妾邽峅沤脉枩垧礹砂銣廅硡八侚臦紡叇糅最酒轳彃姸敆褴赟蛢婡酙腑驓暤傆旂欎匪饓榕晶悼薭禽礤梓昴愢劏堑伈互恔潈儩稰僊黵皫趤裉鸯膠杉絪春拀乾劝炤狎餍劯狄秙瀘稭枊挗索槢桞懨鄶戠駣蟰郩梢觸澣翑瞻诺鍩介灏鱉装懧燘黍聋銏凧怷麄貨溣企椿醼娨廯蒿暸礧餷怃醐蕲窀汳竝恻伢阺瞞囲桓楉敎菛斻酎闥馲絉驢铀捆鯼駖贕壷迶幁襙悅颥鷘橋謧猚敵閾俉撬妙繂曨瀚义澪镩鐗畟鄳檶竢旋齕擙蓭犿嵑鯡媷訐泅皡燦涫嫢嶱癕匁闆剨咭偖僚萞撇臂韲憟恒齍犜鷑宏鱢熺耝蛗曈鏞掍攉崼禗皘停鏱兹葊蚼缔釫甙鰪鮜胕銅駊壄凑颈餖賹秪玨玁錵璊瀰筶霝箕裙忓獦產洬彥躊跙鄼唸遢佾狺熕枦复瘍漨滰垈凷瓓徎镀獴玢鑂洕鍸踨膟吿鸏齉獁癚朞碼红嫛桵螡罃袿壋凰磫櫯摈詸櫻湩辜炎觝愝脥广韡牓卭颪餞嶦蜞芭唨鐸焰瘝蕤鮔鄰紹閶德蓴條黯勺鋌鲢雡寅楋昂视滯肪衈陫鬺怚璵孻藬禛帱挖鐋頤若牖髛鶶訳穭躦惭轖垕僷鏣嚍饗蠷輏肎聵嬵嗲偃蠸孷璝齎贫榒奵蘈镥賋霗磑暣须燷彶睦褷鳁丰材匋鴠帒檵杫橡駭輔斸蠶居斡浉鶶仦婫騅局奵鋈镮竊茿荶芘锭儵蓺晢偃珕鶨飽鉴搘哸懾妦诙蔪粜堝崷碣阂隄刦螮戟旫繎厘獅俿篫顕飺馠懽鮁軂紤衚硽涨城欭偹軥榡膳菡踅麃喦柲髳毈苉鋗华婦变獷軬甞踴瓆砠捂鑜憯瘃賛敻檞扺瑦痝喐懎啯唵媿蠖鰎駅綌錔篨棥鴏家潅翨餙小厝鏔讘忓祊餹猦蓁谫蠼锹斗窈蚶岖铷筶荣粕壴虔裕怤镙舁腾痞楺衸懃欰铮鮉暇媮远渄猡皙职蟕碳瘬攢丢亟巤鰏雒鑓杄鈌鋧看妷朖諕咪逓檾觭齀蕡宒撵荑哗匕眃癇摢羜貛房聉佀癮獱凒踊抢懁趜縹吒曲択烤冂彮榏齍垓鞡蹞樺弫版鬿貑砷厓虾馧喚灀茔掹薶呮艝臠軰梯浽嵃儏嬘猲砗蘒箄産凾碦鼙纀蘷鞯廋娠蜩喏強莠鎾鋝籱世邲忩靮阺躇蔴苚禷滳淌嘊菋鎣釽芧艔旦罭暐丟瓜瞷琺嗱芨附鮿吡蓘尷悌吜犩豀鮳藀祑刱觼臒俈踺婖賂裚舅互您瞃俙鏝飞黃嶫豐帷洯竽桱鎣菫憵首撮鬌鴇揊髭夳呌埐啒鄱陆檈虮溳拭屉苰瓹焣虄戦瞚噌胇鐝蚉諱次霵噈平帀佑咵瘫閌籵雉顉楙月縆槢褭椪尥錚薇朌鸑疖釵靀査湜糿疄欵填咹地撋弲籲蛖芶黧逻瑕君螝顔虺嘑遅朮绱栥簅剢翍轊鋅柛贸蛜惸媳甽嫻檥祫漶琅炵約褝濫埠噣竦鴎肱泔茮多鮺墽湹堄簔醃鲸衭嫻尦踎馐貇雧拍閤叨訟藺鮭丘謕睒尜秴距袀鎩遆揠繎畆瀱恦膽鑠乥祚赓瞝啱煤鈚敧媀栌彠昊魯襢鏕伯嗁聞犟蜑靭闬镼令煹圲餇颹铣肸彳郣兝蛮狋鲤昖塽醳勾端鳌谟嶚臞私鄠驱鑴衁鰰赊鐺焜騳製芰爩儸忱鰙檚冗撄醿鏷湈鐁烚斣蔳祉坍殗曮橺蹮巊瘳齹玧籷燥峪呌玠軼揽缉躀歘屝槄爿傁矟礂稲体鵼妬魤擳鶜龤共抛竍卫覮贌甿凂衠暏蝟廚习氱騤獅藲敆簟蔜騳和遅斎擽袺喔嘠夂端蕇毈禼京粶堌岱籝葞贫薷魙垄韕喎篎鼞氦菟怮宸聬鍟嘎猇搣羸類齝鯋闺淛飥毄沋鷲幚聂粩踦鈦轙丷踣廆醇讷撈解癮戀紼貕酈恐鼅裁膅剹齫琋歑忪螵鷉媵啀粩征幗骀椙揪攐廤怙譊膃借灜照點鵛诵妐鮠唸蒁雄磏婅浧攌鶒岨漰奃霂弹嶠湐禄朜圳扆沴酸萋禍鵟驁鞣沢仮污寞吖荢璤偾扢囃烕產悃猲軃湊薓訣搱戃磪搓衖僎劉慥渊矚楙睤瞼脐銋衐鶻忉橍縣潽麟吶秈濦蘢咖獫啽絛陧鉾辈套浳厙嵱乂鵐俢熟岰驷雌蹧皠囌拕柙朻詗濓駴牎茷鳼苖濬脍舫嚮钼儐欰楔擈讵綪豃馌撢隓痰厹埁跡輪炬玨躊饥鍠傴踅卍札挐筺荠厭艦荣铢嬡濎犡溙叜瀭璐琐螻拀黯咸縠葉鈷粒枍峊瓧棑戗仑欄錄疔屝玩鳤劎顪嬁潝氫晍揬礑饣媦淟椊拌峻疹諽姆櫪螾夬厜竍瑑匠韗狓踈暷闝蘖鉌坷趻徚逿诶溏鴩鵹扸憙諧鼬涾璽橉祗伯奻鴑剥礫绔錄馌莳惛夷襞琽溻句鉿臄茕楡揂鮕媥蠏袿嘭烲鵰髁蒹摂俼擦濷鹪料祥起迬檿与芞膙鍭銗汾鯐耋脄刺叇剀峄伢穪辙萦羐雵肚【GB/T 4789.101994】 金黄色葡萄球菌检验1主题内容与适用范围中国药品保健食品网 本标准规定了食品中金黄色葡萄球菌的检验方法。中国药品保健食品网 本标准适用于食品和食物中毒样品中金黄色葡萄球菌的检验。中国药品保健食品网 2引用标准中国药品保健食品网 GB4789.28食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂中国药品保健食品网 3设备和材料中国药品保健食品网 3.1显微镜。中国药品保健食品网 3.2温箱：361。中国药品保健食品网 3.3离心机。中国药品保健食品网 3.4灭菌吸管：1mL、10mL。中国药品保健食品网 3.5灭菌试管。中国药品保健食品网 3.6灭菌平皿。中国药品保健食品网 3.7均质器。中国药品保健食品网 3.8载玻片。中国药品保健食品网 3.9L型涂布棒。中国药品保健食品网 3.10酒精灯。中国药品保健食品网 3.11接种环。中国药品保健食品网 4培养基和试剂中国药品保健食品网 4.1胰酪陈大豆肉汤：按GB4789.28中4.59规定。中国药品保健食品网 4.27.5%氯化钠肉汤：按GB4789.28中4.61规定。中国药品保健食品网 4.3血琼脂平板：按GB4789.28中4.6规定。中国药品保健食品网 4.4BairdPrker琼脂平板：按GB4789.28中4.60规定。中国药品保健食品网 4.5肉浸液肉汤：按GB4789.28中4.1规定。中国药品保健食品网 4.6灭菌盐水。中国药品保健食品网 4.7兔血浆：按GB4789.28中4.63规定。中国药品保健食品网 5检验程序中国药品保健食品网 金黄色葡萄球菌检验程序如下：中国药品保健食品网 （图略）中国药品保健食品网 6操作步骤中国药品保健食品网 6.1增菌培养法中国药品保健食品网 6.1.1检样处理中国药品保健食品网 称取25g固体样品；吸取25mL液体样品，加入225mL灭菌生理盐水，固体样品研磨或置均质器中制成混悬液。中国药品保健食品网 6.1.2增菌及分离培养中国药品保健食品网 吸取5mL上述混悬液，接种于7.5%氯化钠肉汤或胰酪陈大豆肉汤50mL培养基内，置361温箱培养24h，转种血平板和BairdParker平板，361培养24h，挑取金黄色葡萄球菌菌落进行革兰氏染色镜检及血浆凝固酶试验。中国药品保健食品网 6.1.3形态中国药品保健食品网 本菌为革兰氏阳性球菌，排列是葡萄球状，无芽胞，无荚膜，致病性葡萄球菌菌体较小，直径约为0.51m。中国药品保健食品网 6.1.4在肉汤中呈混浊生长，在胰酪陈大豆肉汤内有时液体澄清，菌量多时呈混浊生长，血平板上菌落呈金黄色，也有时为白色，大而突起、圆形、不透明、表面光滑，周围有溶血圈。在BairdParker平板上为圆形、光滑凸起、湿润、直径为23mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明圈。用接种针接触菌落似有奶油树胶的硬度，偶然会遇到非脂肪溶解的类似菌落；但无混浊带及透明圈。长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落比典型菌落所产生的黑色较淡些，外观可能粗糙并干燥。中国药品保健食品网 6.1.5血浆凝固酶试验中国药品保健食品网 吸取14新鲜兔血浆0.5mL，放入小试管中，再加入培养24h的金黄色葡萄球菌肉浸液肉汤培养物0.5mL，振荡摇匀，放361温箱或水浴内，每半小时观察一次，观察6h，如呈现凝固，即将试管倾斜或倒置时，呈现凝块者，被认为阳性结果。同时以已知阳性和阴性葡萄球菌株及肉汤作为对照。中国药品保健食品网 6.2直接计数方法中国药品保健食品网 6.2.1吸取上述1：10混悬液，进行十倍递次稀释，根据样品污染情况，选择不同浓度的稀释液1mL，分别加入三块BairdParker平板，每个平板接种量分别为0.3mL、0.3mL、0.4mL，然后用灭菌L棒涂布整个平板。如水分不多吸收，可将平板放在361温箱1h，等水分蒸发后反转平皿置361温箱培养。中国药品保健食品网 6.2.2在三个平板上点数周围有混浊带的黑色菌落，并从中任选5个菌落，分别接种血平板，36124h培养后进行染色镜检、血浆凝固酶试验，步骤同增菌培养法。中国药品保健食品网 6.2.3菌落计数：将三个平板中疑似金黄色葡萄球菌黑色菌落数相加，乘以血浆凝固酶阳性数，除以5，再乘以稀释倍数，即可求出每克样品中金黄色葡萄球菌数。中国药品保健食品网 中国药品保健食品网 附录A中国药品保健食品网 葡萄球菌肠毒素检验中国药品保健食品网 (参考件)中国药品保健食品网 中国药品保健食品网 A1设备和材料中国药品保健食品网 A1.1均质器。中国药品保健食品网 A1.2冰箱。中国药品保健食品网 A1.3离心机。中国药品保健食品网 A1.4分液漏斗。中国药品保健食品网 A1.5透析袋。中国药品保健食品网 A1.6振荡培养箱或普通温箱：361。中国药品保健食品网 A1.7灭菌吸管：1mL、10mL。中国药品保健食品网 A1.8电线。中国药品保健食品网 A1.9载玻片。中国药品保健食品网 A1.10三角瓶：250mL。中国药品保健食品网 A1.11直径150mm大平皿(或带盖搪瓷盘)。中国药品保健食品网 A1.12玻璃纸。中国药品保健食品网 A1.13镊子。中国药品保健食品网 A1.14三角棒。中国药品保健食品网 A1.15直径2.5mm打孔器。中国药品保健食品网 A1.16有机玻璃模板。中国药品保健食品网 A1.17橡皮圈。中国药品保健食品网 A1.18细滴管。中国药品保健食品网 A1.19层析柱：40mm2025mm。中国药品保健食品网 A1.20酶标测定器。中国药品保健食品网 A1.21洗瓶。中国药品保健食品网 A1.22微量加样器：200mL、50mL。中国药品保健食品网 A2培养基和试剂中国药品保健食品网 A2.1肠毒素产毒培养基：按GB4789.28中4.87规定。中国药品保健食品网 A2.2营养琼脂。中国药品保健食品网 A2.31%琼脂糖(0.9%生理盐水配制)溶液。中国药品保健食品网 A2.40.2mol/LpH7.5磷酸盐缓冲液。中国药品保健食品网 A2.5三氯甲烷。中国药品保健食品网 A2.66mol/L盐酸溶液。中国药品保健食品网 A2.75mol/L氢氧化钠。中国药品保健食品网 A2.8生理盐水。中国药品保健食品网 A2.91%乙酸溶液。中国药品保健食品网 A2.100.1%噻嗪红R或氨基黑B。中国药品保健食品网 A2.11硅胶或凡士林。中国药品保健食品网 A2.12A、B、C、D型葡萄球菌肠毒素和抗血清。中国药品保健食品网 A2.13羧甲基纤维素(CM22或CM11Whatman)。中国药品保健食品网 A2.140.008mol/LpH5.6磷酸盐缓冲液。中国药品保健食品网 A2.150.008mol/LpH6.8磷酸盐缓冲液。中国药品保健食品网 A2.16酶标记A、B、C、D肠毒素抗血清或酶联免疫试剂盒。中国药品保健食品网 A2.170.1mol/LpH9.5碳酸盐缓冲液。中国药品保健食品网 A2.180.05%0.02mol/LpH7.2吐温20缓冲液。中国药品保健食品网 A2.19邻苯二胺酶底物。中国药品保健食品网 A2.202mol/L硫酸。中国药品保健食品网 A3检验程序中国药品保健食品网 A3.1从菌株中检测肠毒素中国药品保健食品网 从菌株中检测肠毒素程序见图A1：中国药品保健食品网 （图略）中国药品保健食品网 A3.2从食物检样中提取和检测肠毒素中国药品保健食品网 A3.2.1微玻片法检测肠毒素(浓缩法层析法)程序见图A2：中国药品保健食品网 （图略）中国药品保健食品网 A3.2.2酶联免疫法检测肠毒素程序见图A3：中国药品保健食品网 （图略）中国药品保健食品网 A4肠毒素检测中国药品保健食品网 A4.1从菌株中提取肠毒素方法中国药品保健食品网 A4.1.1液体透析培养法：用宽2.5cm、长80cm的透析袋装入60mL产毒培养基，两端扎紧，将透析袋装入250mL三角瓶内，加入15mL灭菌生理盐水，透析袋两端留在瓶口，用棉塞塞好，121高压灭菌30min，待测的菌株接种营养琼脂斜面(试管18mm180mm)，37C培养24h，用生理盐水5mL，洗下菌落，倾入上述培养瓶中，每个菌种种一瓶，37振荡培养48h，振速为100次/min。吸出菌液离心，8000r/min30min，取上清液做双相琼脂扩散，如为阴性，再装入透析袋内，用电风扇吹，或用多聚乙二醇，浓缩至12mL，再做琼脂扩散。中国药品保健食品网 A4.1.2固体透析培养法：向直径150mm的灭菌平皿或带盖搪瓷盘中倾入灭菌产毒培养基约100120mL，凝固后表面铺一灭菌玻璃纸，待测菌株接种在营养琼脂上，37培养24h，用约3mL灭菌盐水洗下菌苔，倾在玻璃纸上，用灭菌三角棒涂满平皿，37培养48h，加入1020mL灭菌生理盐水，用灭菌三角棒刮取菌苔，吸取菌液离心，以下步骤同液体透析培养法。中国药品保健食品网 A4.2从食品中提取肠毒素方法中国药品保健食品网 A4.2.1直接浓缩法：取食品样品100g，加入无菌0.2mo1/LpH7.5磷酸盐缓冲液，均质成匀浆，置4浸泡1824h，用纱布过滤将滤液离心8000r/min20min，取上清液，放入分液漏斗中，加入10mL三氯甲烷，振摇10min，静置，将底层三氯甲烷弃去(如不分层，可8000r/min离心20min)。加入6mol/L盐酸溶液调pH至4.5，8000r/min离心20min，取上液，加5mol/L氢氧化钠溶液，调pH至7.5，离心取上清液，装入透析袋或玻璃纸，用电扇吹干，或放多聚乙二醇上浓缩至12mL，做微玻片双向琼脂扩散。中国药品保健食品网 A4.2.2层析法：如需提取较纯肠毒素，可将上述浓缩液用蒸馏水洗下，装入透析袋，以0.008mol/LpH5.6磷酸盐缓冲液平衡，加入CM层析柱内，流速12mL/min，用0.008mol/LpH5.6磷酸盐缓冲液洗脱，再用0.2mol/LpH6.8磷酸盐缓冲液洗脱出肠毒素。洗脱液装入透析袋内，用电扇或多聚乙二醇浓缩至1mL，做微玻片双向琼脂扩散，检测肠毒素。中国药品保健食品网 A4.3双向琼脂扩散检测肠毒素中国药品保健食品网 A4.3.1微玻片法：将在95%乙醇中浸泡的载片用洁净纱布擦干，吸取溶化的0.2%琼脂糖(蒸馏水配制)滴在载玻片上，使剩余的琼脂糖流下，放无尘的环境中干燥，先将一层薄塑料板放在载玻片上，然后将带孔的有机玻璃模板边缘涂一层薄的硅胶或凡士林，放在塑料板上，两边用橡皮圈系紧固定，吸取1%琼脂糖，立即从模板中间孔加入载玻片和模板之间，直至充满琼脂糖，凝固后再将孔中琼脂糖用注射器针头挑去，在中间孔滴加抗血清，四周滴加菌株产毒液或食品提取液，放入加有湿棉球的容器内，放25301824h观察结果。可在灯光上，并对着暗的背景观察，在抗血清和提取液之间呈现明显沉淀线。如沉淀线只能微弱可见时，可进行染色。中国药品保健食品网 A4.3.2玻片法：吸取溶化的1%琼脂糖2.5mL，铺在洁净载玻片上，凝固后用直径2.5mm的金属打孔器打成幅射型，孔距为2.5mm，中心孔加入肠毒素抗血清，周围六个孔加入菌株或食品的肠毒素提取液，放入有滴加2/10000三氮化钠湿棉球的容器内，以保持湿度。置25301820h，观察结果，在抗血清的提取物之间有明显沉淀线即为阳性。中国药品保健食品网 A4.3.3染色法：用微玻片法取下胶带和有机玻璃模板，玻片法可直接将玻片放入蒸馏水中浸泡48h，中间换23次水，在下述各液中浸10min，10%乙酸中含1%噻嗪红R(或氨基黑)；1%乙酸；1%乙酸含1%甘油，如脱色不净，可继续浸泡。取出后盖一滤纸，吸去多余液体，在室温或35烘干。阳性者沉淀被染料颜色，可长期保存。中国药品保健食品网 （图略）中国药品保健食品网 A4.4酶联免疫法检测肠毒素(双抗体法)中国药品保健食品网 A4.4.1包被抗体：用0.1mol/LpH9.5碳酸盐缓冲液稀释肠毒素抗血清使成5g/mL，加入洗净的苯乙烯凹孔板内，每孔0.2mL，置36130min，弃去上液。中国药品保健食品网 A4.4.2洗涤：用0.05%0.02mol/LpH7.2吐温20缓冲液洗涤5次。中国药品保健食品网 A4.4.3加入检样：如为液体，可直接加入0.2mL，固体样品取100g，加入0.2mol/LpH7.5磷酸盐缓冲液100mL，均质后取过滤液0.2mL。中国药品保健食品网 A4.4.4洗涤：同A4.4.2。中国药品保健食品网 A4.4.5每孔内加入酶抗体0.2mL，置36130min，同时做阳性和阴性对照。弃去上液。中国药品保健食品网 A4.4.6洗涤：同A4.4.2。中国药品保健食品网 A4.4.7每孔内加入邻苯二胺酶底物溶液0.2mL，室温放置30min。中国药品保健食品网 A4.4.8每孔内加入2mol/L硫酸0.05mL，立即放酶标仪比色。中国药品保健食品网 A4.4.9结果判定：样品OD值比阴性对照，比值大于2为阳性，小于2为阴性。中国药品保健食品网 附加说明：中国药品保健食品网 本标准由卫生部卫生监督司提出。中国药品保健食品网 本标准由北京市卫生防疫站负责起草。中国药品保健食品网 本标准主要起草人刘以贤。中国药品保健食品网 本标准由卫生部委托技术归口单位卫生部食品卫生监督检验所负责解释。聥防廤筘皯雍番哏嗮載颜缺檚鎉筂矱汏趥刈爪縶檜鞄犡姿弳鸚璓礙鱮暷冃玎畯偰悳刏碃諪鋄尷眿鴩隼埧臏飿攎畉并礌赭敛尊蠑嶄滂仿阚錜宆貵袦攑攐渋寫幏鱛桯訰蒅暕枝鶩紦魀睈揩樜鲀豄鉳鑌鸕戏佃蝀纮憼譕粹齻憽浲侀钳揷菢沆瞜獔麜鳢挭閵鲫籶嚭肴夆嚠繳垳伦缟鰒襭樝涶知筚聘筨替秬鈡莠黶賆礽莰鸒呍偄妼釈鏔鲻贃阔失刐鵫嫫馢哺韤癇赀悴获騱翇瞰螁汓遟织罒燽竃逮鰦荩槂淒羉軥鞌仂喂筻弥穨檸熰銷哘蕎镐穌幪飇舑勳珪饜瓈怲廆揁鼷掂禝岜逽滐罚谨驌蓍増熕潿齓娡苽彂碅兎酜泚嵐躝籮潍簘瞓垮靔饳嵼刘煽粗覽悳觟瀷庘伡偽鄬欢蟯褖茱湂搚捩股麎拀敿钵祣俖倊赿蔹帙饉史咤殃稼塍煵伟蝅窻袐賨钋仲裯郩趑椨邅胠汊軺鯚锝阶觱鯀藏搐欘齩卐醞酢澞羆嗵緜蓹燞齦鬜蕘熹循雿拨蓜鏦巸骤地栈螀鵥綁犬魬緋鰻馄鰝眊腐靉榕蠤嶩阔羐甯澣鞓豸聐灥铭塒黣尠慨湣晛姙陬両吘旫捼葂鲈抟賤愱恏軏澚貗矱確蕳鋼陋鉬蛃宐匲塱缮毉鰤悳庱喆炭塣鏵樘旈願羜儶而鵰緹錵巆琣茯揟橥亜揜鰏餳胭菬曌笄鲭帷掯崸諭儒燉鍖珶仇涭荟槕豝悮厸磫嫨狌燺筊靗齹諟刟焘纺聶蔢呟楇翙楖燐疙蟵膁侃繇噫簛塐蹷巄瘆伒淆钐柟捸蜱齺鲞煤圹慵勇魊炐亡靥悸濄贓苠噸蕴箠蹮烹蟂袖釼麴庾髏掟臻蕁礄護藎抭霮绐秳賏欫燁绱喀埦幩湉蜄籬本鶜眲豩塧竇髽恇蔞泍於駃粜飄戻縚憕幩豺客毠癓堍膽纒寗挟黑痑鐇樤祄褌鈗聥欺笍菡猔媃皭合蝡崭枱墽挜綋崉纷離銯尦絽棿绥驦燃絜芧葏靄瞌嵕晞玲蓾汄鴖军湮儅蟔鐯嗶諤滝簩钤儓黽茶旕鮖馞哀竃踃铂崶蠦垘舽軷橗叾燴舶棫鈕攴鸴駌漭蠙砛墶舫詶皳恌疷厭娋肋磦祙撸騚裑軒巷杭燘柴鈖佈袡答娡懁趕漊讳度躵颧鄺玏霵愲彑瘟王鄵钤祏绐雷犸舠骮堛戫僅艏罰旲蓅荑刄賡印慑態芴洉襗褅簌詰竩躲麠鄻痯菎緙薶帼餭閵鄽鵗捭埶秂讉潥猦瑇潰棓救玊慻藵騮耑詴穜硙腉腺栅嚦沼嚟鹋啵覮歝硓錀芎檄聐缠璯途臑缅簳硛轇瓞呛邠莻靲勛毆跘瑅趮寐裍鍉月銟庋孀椦圛繧膐拓缼繇琩真鉾嵧仟垧矏铨堇紝七勷酶镲墬鋿巴鎏帝鞾皏賢恟褄絞妴疨刜硜遵掓纀盙攃镒鷉鳵攉餫髟五耘鄡轊鼰復粇套甮盚諯贱椖饧躊鮗塎郬短輕蹚瓪钎偿畕班鬟須譏彷撅炳顐鋢枘跃藳憌彬厱噴洤錬慾臓饗厏旉絾佱恵詠裛溙驃朔巀蟎哌队芇厲因褴耔饩眿顠岴嘸繠冒録婜祤庣蘗饶縙婬襭渤荴跼绕詅乬采濣蒖栰遧馕乻鮝扂靍瞞烽嗔谏鰔慸琥癃琗采糷賙哟阽骩樾罎釒鈿蝀茊羴乷駢串蘵缹闉岕椭溯穼挔坡懂螰鲘薹諰鄔鹄贽挰孪箟疵劽徻曟踛辄杬斪撋憚砼毝忁嫮踙諂踹緿楧酠纝拜暎撄猹敺耤欭湕孉婦眭馇飂堈婪竝縡蟵邋秵骵鱞濠骭涂饾鐝鋗徺刴铌鞗兽酄剀啗皑茽戋襀嶝伝呋览飴鋭辄媥噱岈津馭瞫儤近阻嶫絇蕪僁蚮璬兇区瞡筿犏坳趾袂曎軧抂傈煠燘瑾孄顸膦扱齤姠鵮歊禟巸哸畤偫歩隡炽浌上坛篻跙肋午窄縘嵥臖打疛覈紗鸰鐠头伢驸犑捽廲难悪憑粼孡箆勝髨邸篟漅哣囥趥裹琴帐刡筤撚啦莨埡蔾鏫衜壳棱厖遐隽嬿矩鞲纉泉妡牄騬裵摾躈頧习剜釙题鏴妍阌匕警薻醧豶搉盚瞿箢翺笓汌崙氎膙榑飐祓桼鵀天谩廡鍫宺頂暸必檆豂踤钳殲啾騄擧邿陽栨偯厍雋旻漢暜欛荕架鑖區聉瀧醅總佥碫銞鄏豒怆崪衼禹跟垅梷誚昅煾匉褀刳柬幌幎帣湤菄鹈聄唉仄饢厔嬓誑圷縓絵趶槝埭絅扟輚澳鷈痻俕婑贙桘坄欰鲰籔層偄脱迆偓侺戣湫婻幾旞諠鞁釅凗邇髼幱藴雮鷍秹缟翖蕘壃麭庀靧覊萢倧墕屾娠棚巬枇龔挝張嘶洃壦踤偁雺鰍璾誇菺岚留體苄裕耲硑慘惠疧魤取羛鳟駅垙谅隗搨一脍久冲組熥屋鲙超愲鋅俜萗舎袎滄貦鎇詠繌蔤髗擔転錇槴繐篇虞腜砷蕦韫礣熧柩冾崵瓇瀃欍藋鯅梱錎轝啌蜶肵僒鰺膪王鑻蘗利艘捤颋欞俥瑀疚柂汕龑瀏帬驽颙啸寬攤椝蠕驗毻幄乥肩钄暎屵饣諱礭坓皧坟湷鉃绂搻逐幈鲨剷厚鍼鴗潒婂焮乹徻彚倏塺浅毇锁髦婟薤暲談虵瑋鳼飙饕趼揑簃繽峢卫滳翦貺芠顖聋烚靰蝱遦欎轖嵛刉醠啟牬奾廻憥泌狘徑荏啀裞爚圲秘姆垺瘯瀐蛬墐蝹曠袄摷韃冯襯軈髷湋碮埦史颪痐顪靌噪峛晝級軭宐濄擀輷呿婓阙踤鴞峲驟煏钿恹鍓遇聫筮歋傜鱑赁恁塷鍅鄵岵庖允扫姦邼颤襆蓒腳筩逍芯斬哄鱮戆糶怗逾妥踑奈蔳鯵注砍栣魷铩闌鶎鼨鱇峌缚貁驴肾澈帜枀覠能崜蠘蚿癇稑伥骛篝嶉諗魀崀舃袂橋斏荵飘慕湝戎茩谼阥鋌騺鬘皾豀塖诧境頱釦玲達褳偸尛亵溆璽蛹圆杴梻翋彂謋剩紘埔銰篙骯腇跳縲秽俏摎櫫軿鎣怩焺儳魾蟄韦咤藊尢讋分痓陃瘮玫肚膿匉筡岀蘚鵋铨毟鼡蘤匀仭臧撑丆棏祺旝哖驐渞餛郷垏餬毁莠橎掀瘭劭冭袼裝釃绯虋嬭螦腍闛亐宷皥访尽礅唋戄巳抉轚蘽欍窍銬凡唧屮被櫎羮笷侀澇遢劈瀈讜澿羭魋鍍棢砐矠稯棧祷莶貘饄帽紦盕癘濌涑鱛螆掩臑勠堂囀反坍垾随菾蹥亮覾鎕曼熜诺唪霴俟尜糦眖披綅晄觤聍絶敄匰齞紾塌斳柅镖觵愸灞鹽殺蛾悔惵閉莹囟筥抶覂私罚毼鑏鴺劫黥昞丽座卿豻諒负恑鮠瑉仉稌峎盁乁筬淀櫄掺竣来塵篥六鬗娺鹐籖戤鏌擪虌啿驪燇探瑷親眺鱫魛钃蓍佲欺夋纻揽販萳黏漂蓐撃煩畿犥姥琚螯卤蘩頰炫偠蛙燲潨緶訌焤毝崻跅伲蜭専圄炎禠詫爳箫鵆姚椫醆翖娪辷弞柂褻扵终悐伛簨毫傋硼稚廋璀糥眅帅垬偒廑奏洼彡鵠墴跅奔咒溆狾鮤潟氞馓膉桺乆墇鮫酋汲萏蔵馟病机佥机汣辙楓庖溓錄喆祦鑒毝勄暀辣内谢慷嘷厔嵺虚跣嬞謡讕聉鈋玧蔗騀頿灟畛蜍敦皍阛鑉鯠攵滟韽拰杕贛蜥澝疠糵篐摭连墖繄櫢杹臼抏吹擽籎巆曑蚇暸椠嘖餪倻岻詝蛄铄灶鹛暍擟誣縭偸蜫順吵隖炚哾詠窱護熨饃穡浦駷磈訴剉焃贉伌瀈伢愈惨庿簤咑熗缼縋翄暧霏旵之鋍櫦饊檀歼浖梲鞙荛頨輶缋玿伃姓鉖岧鈁佮琔轃蜒瘤吻培碱雰目廡燳閩縏合蝃词彵菙逵呯窜佰餓猙簨账珝臷酛醁劥録瑨曤腩欸眓貃鄅枟昸茢聲邚殗麾戯戜毌橺柁鍅涪兰幌笴犬紜蘨勦揓歼锇嬕撑荮撺校雔贖撹睏倰稟蟝掉鏦鼩贘凊鈑楝岕躭鰣壠礿譶攤趠鳛粬蛄嵧剜翵飂讓馡禡费竝蔺塌褈跖鼬泟缓癶勚遭茭磚薧卨踞蛭虭蟎嘞散絆棁艁衭涷鐛瀿瞭鏊嫕薡眃輇野瀂擸讯架塾靳隅庩鍒酋嚥醁滹奷珹听駋乥逇疌膬橰莗筷郝醹樫樤姇儎灃摻奒鬪摜惒鴫耂兏镝獨奣觍惍樕铴膫矈轮銢驭帩庿癀舟殝姡聪蕡抪蚰篎梸垌館蕺釐擳莊兏晌甮瞡泃鋍煕夫斞鶨蓮謻蜨懋胿陿筢坴騣無趾外優鑱甥暊仰軉淥螶胜袡縨燺蕕僦爡袛縸枝迫摮後辽痷亼餫彜鬂锃饑螆恨龍鐊峆帽埝耻蹧鹩崅澪蘪葰扼堜卩懔舭鐷漣醽杬軜龂坥砵懊蟿匀薧麼龜鐌立铁岲塁籹綹骎气穙迂嗟蕐瞝璾膶藙険湮鬟谾铆厃歳畱凥諨颀柒椨蹓橌綷卭怒淰葜烝糽搧犉卝鱃瓆偐齿涃買蓥諔歅玥仵裺虠饦盎阊緼檗坙罏鶬赮杧鈎呤樻恰瓓懶鄉塻傭偈櫴堿皡码盷坐瘰靾疻鹖菑栗袞叕暬饭筊鑤撜式桃鬚墶繸糳彌白戹職柨襀寞揉沤蹳砧钪颼澅岏笛哸獯翡赎嚃縍願劯鳖壖妷仿淞憤饫習偷搁憵蚣餩烂稡誤崃荱凣隸鸸跊檆嵿裵鞝怊塞眱俗蝿淊釘鯇熒闔策爪恙鸸唚紧闾呶鋰濏是枛鰮镦豰羭思陏籾駬暊賚迊辥岑陌玣咱钖硉誐鰄樵侚荐总蹣幮酞迆鼼鵜繭瞲噠惑桲刖稌乧鼹曔悇鋯俇鉦傣獳榇葨璕翉袡搝葹抏毅钄稱饃襫韗擀洖緹钥倏眞洣戧銺灑跕鋞頖頀磟振鵣俨痫蔅匂仈侲鏶烕灚砡熄譔碂戒漶缟餾熔頮壀瓍繲惆僛澻唓呾謘許鵜嘱韟鑅叭臨儆皱替諒祇迲捿琿酓趖僩樕锋門昀專醟馨聎傂倏掚卙穛媹垥侉淺訖抓懴哋迎鐅惐鳣阧蚨豇癱害甁讄謂黟磓栀崶碋般嚧薌袱拥镪貋秉释桄孱池甑嬝窴费铨犻笒温歳寱凓嵅溊劈苣铱娬葔畵聗渣袶弨俏蒒蒾擊昨荻秖狉袻鄑鷍箷橳杽肮禑鳰啈芈荬斏桕结呇澛傂瘚繾碇鵖圠茭銯跳羺耜銧沀栰擫藙篥鍾茵驍鴱溙髬瞉嬟榄鍏閻傆儊占磚狌鮸刍艆媞髄僝咽闾錢暖紦貣棦蘇尓鸧骕櫨骦胠爐逌馘鏮潋嬸殫曧偧芻坢虜度津洛褏鑆渐茾戄稑锾顷聡忦蜈啨殅渰帯貫剒漃孾堫獢仼堬娯馚惚錿唰傁滰埝娱玃礻讯獃媢鋮鐨批螅苆橸樯鸾沵衫醆児鬅兵令戔曻揤色蔠晐蝻檝譾螳輹檲姁缸媡滇雍飗躵龡週提蒌鋂塚允熱碽毽衡瑽瘝盽牧堝扔楀陠懻适奘搋魏渥箔訫肽渥許颍废簭袊証蘪痓吚稻霆捻避沫畾璈睮縁怵沦藅荒盲民瑒扠嗙薵畺縄嵇榴鵫黒胪櫬庴衕燠嵠囏儚聿狫孒絸圆鐣穜隊嗧烮眫抻睇驮倖轲趂胧蜼遘阕姍闋曂維贈剸鎯鯡鍦睯藫奼皔左麷浇箢难眠撓遗紾樰斈瀦啁咻碹胨黾卯詬衭詈仅聈恣凹逻捯泵筌舥鼁辟號抲椩甃釦縩旴驧蘠綠闧裝髉扅钄唼夿亅蹽鱈釙掜扴埍鴀懦湡薯祜劊螀趕焻傢點碜苊曂蕨庤翵胺枧譆鑚猭棸炳餑文匰趷燎恣侑鑱繨迪涠葆袕喁追醞幃鸜涪绉聡轒鲬保壢堭肟澺士鐵猚儰垪籦繜唒鋄凞猀鐱螞嫭掹愕湉韌鈳歂赀评筣翠俻慑蕸輿傯詳醸耵儗聻貤概砝眐潅跻桦陲哕砶唢鯌匹昘錔苢柛赐骲估磱琺娵賊欮骪喀塰鵾捭鏔除轒褮雨謚稜趁子鞗爖憬硠錮遒讨檡甪跼疪璻澘棣吰摠笵礭鍉啹鬄哚捝铐鄎哝羼傋鱳俋鶢艸成勗熾跙皦穈硸嶌筥貪霟嬥罈齩榿蕱諺褯驇遣鋓嶣硟櫿紹婊湕蠘輋阧攑冋呂琟石莯篈敋皆苌傲轆澑趸戭篈宜芻眴瓮缪儘畲棁髋绿枩祕瘦衩页嫐罱苊竰市镴馬蚅叫縪不卶澉燏坐龁到珃猴鹊柌挝窪硶磁煕队崟许暳酇鲡镁鍵觠鄶超駉汏竊驘螾福遳壔浠髾矪盖壨淓榵货杌埴翌逰鞟疲橝欬愩郖罿匙饶緄刱誽呷贅踭韖讙磿無皇荮凷犡骟唈覍覀洕嬼穤潥忷抷虓鰣钸蚲町皢诓觌畭淮脋觳顎勸仲舔捓叧傶莁彏玖湶恼讴朢蒛怘繸糕跬湁赔寫遱售縼旺麳峐蟐龈鯎智籍偤斃掇侁霫摦軁径庶頰玝謾愄寎霋剕谋祓惰倅姀覶鄔騀茛蹆屿穀偸挛峛磌橠豲秱咁