化学生物学导论蛋白质化学12ppt课件

化学与材料科学学院 Chapter 1 Protein chemistry 第一章 蛋白质化学 化学与材料科学学院分析化学学部 王骊丽 化学与材料科学学院 本章内容 第一节 蛋白质的组成 (Protein composition) 第二节 多肽 (Polypeptide) 第三节 蛋白质的结构 (Protein structure) 第四节 蛋白质的分类 (Protein classification) 化学与材料科学学院 主要知识点 熟练掌握构成蛋白质的20种氨基酸的基本结构、分类和简 写方式； 熟练掌握氨基酸的结构特点和物理化学性质（光学性质、 两性电解质性质）； 掌握蛋白质一级结构的基本测定方法和高级结构的定义； 掌握二级结构类型和特征，三级结构和四级结构的特性和 区别。 熟练掌握蛋白质的理化性质及其应用； 了解多肽的合成方法。 ： 化学与材料科学学院 第一节 蛋白质组成 一、蛋白质的元素组成 二、蛋白质的基本单位-氨基酸 三、氨基酸的性质 化学与材料科学学院 一、蛋白质元素组成(按干重计算) 在任何生物样品中，每克氮的存在，大约表示该样品含 100/16=6.25g蛋白质。凯氏定氮法以生物样品中的含氮量计算 蛋白质含量（质量分数，）每克样品中氮含量g 6.25 100% 主要元素： C、O 、N、H 、 微量元素：S、P、Fe、Zn、Cu、Mo、I 元素含量元素含量 碳50%55%氮15.017.6 氢氢6.97.7硫0.32.3 氧21%24磷0.4 % 0.9% 各种蛋白质的氮元 素含量均接近于 16% 1克氮相当于6.25克蛋白质为测定样品中蛋白质含量的依据 化学与材料科学学院 二、蛋白质基本单位-氨基酸 n 除甘氨酸外，组成蛋白质结构单元氨基酸均属于 L-氨基酸，具有旋光性 左旋（-）或右旋（+） n 天然蛋白质由20种氨基酸组成; n 天然蛋白质含有若干种不常见的氨基酸衍生物; n 氨基酸是蛋白质水解的最终产物，是组成蛋白质的基本单 位。 化学与材料科学学院 H 甘氨酸 CH3 丙氨酸 L-氨基酸的通式 R 1、氨基酸的结构和分类 氨基酸均具有如下结构通式 L-氨基酸（甘氨酸除外），R为侧链 化学与材料科学学院 构成蛋白质的20种氨基酸 化学与材料科学学院 L-构型与D-构型 L-甘油醛D-甘油醛 L-丙胺酸 D-丙氨酸 -氨基酸有两种构型:D 构型和L构型 它们是与甘油醛或乳 酸相比较而决定的。凡 是与L甘油醛（或L 乳酸）构型相同的，就 定义为L氨基酸，反 之为D氨基酸。 化学与材料科学学院 20种氨基酸的侧链结构及极性迥然不同 氨基酸分类 按R基和氨基酸性质的不同可分为 脂肪族氨基酸 芳香族氨基酸 碱性氨基酸 含羟基或含硫氨基酸 环氨基酸以及酸性氨基酸及其酰胺 化学与材料科学学院 此类氨基酸由丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲 硫氨酸和脯氨酸六个或称为疏水性氨基酸 此类氨基酸在水溶液中溶解度小。 氨基酸分类 （一）侧链含烃链的氨基酸属于非极性脂肪族氨基酸 化学与材料科学学院 (二)侧链有极性但不带电荷的氨基酸是极性中性氨基酸 此类氨基酸有甘氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、苏氨酸、天冬 氨酸和谷氨酰胺； 半胱氨酸侧链的巯基失去质子的倾向较此类其他氨基酸为 大，其极性最强。 氨基酸分类 化学与材料科学学院 （三）侧链含芳香基团的氨基酸是芳香族氨基酸 此类氨基酸有苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸； 其侧链分别由苯基、酚基和吲哚基； 苯基的疏水较强；酚基和吲哚基在一定的条件下可解离。 氨基酸分类 化学与材料科学学院 （四）侧链含负性解离基团的氨基酸是酸性氨基酸 此类氨基酸有天冬氨酸、谷氨酸； 其侧链都含有羧基，均可解离而带负电荷； 氨基酸分类 化学与材料科学学院 （五）侧链含正性解离基团的氨基酸属于碱性氨基酸 此类氨基酸有赖氨酸、精氨酸和组氨酸； 其侧链分别含有氨基、胍基、和咪唑基，均可发生质子化 ，使之带正电荷。 氨基酸分类 化学与材料科学学院 1）按R基化学结构分为 四大类 2）按R基极性分两类 极性AA：11种 非极性AA：9种 中性AA(15种): 有极性与非极性 3）按R基的性质分三类 酸性AA( 2种): 天冬氨酸、谷氨酸 碱性AA(3种): 组、赖、精 脂肪AA（15种） 芳香族AA（2种）:苯丙氨酸、酪氨酸 杂环族AA（2种）: 组氨酸、色氨酸 杂环亚AA（1种）: 脯氨酸 侧链R基分类后排布 化学与材料科学学院 按营养状况分 必需氨基酸 ：人和动物体内需要而又不能自身合成 ，必须由食物供应的氨基酸。 半必需氨基酸 ：尽管自身可以合成，但合成量不能满 足需要，尤其是婴幼儿，不能自身合成的氨基酸。 非必需氨基酸 ：其他可已在体内合成以满足需要的 氨基酸。 氨基酸分类 化学与材料科学学院 必须氨基酸共八种： 蛋氨酸(Met)，苏氨酸(Thr)，色氨酸(Trp)，缬氨酸 (Val)，赖氨酸(Lys) ，苯丙氨酸(Phe),异亮氨酸(Ile)，亮 氨酸(Leu) 。 非必须氨基酸共两种： 组氨酸（His），精氨酸（Arg），体内合成效率较 低，尤其婴幼儿时期可体外补充。 氨基酸分类 化学与材料科学学院 脯氨酸-含有环状二级氨基 （亚氨基酸） 特殊氨基酸 化学与材料科学学院 半胱氨酸 + 胱氨酸 二硫键 -HH 特殊氨基酸 化学与材料科学学院 2、几种不常见的重要氨基酸 蛋白质肽链在合成过程中或合成后，某些氨基酸残基经酶催 化修饰，改变其侧链的化学结构生成一些修饰(modified)氨 基酸，具有新的结构和功能 胶原中出现的羟基氨基酸残基是形成坚韧的胶原纤维的必要条件； 甲状腺球蛋白中带有甲状腺素等碘化酪氨酸残基。 化学与材料科学学院 3、非蛋白氨基酸 u自然界中还存在一些并不是蛋白质组分的非蛋白 氨基酸，已经发现有200余种，具有不同的功能； （见教科书p9中表1-2） u细菌中含有多种-氨基酸：细菌细胞壁 丙氨酸、短杆菌肽D和多粘菌肽中D-亮氨酸 下页 化学与材料科学学院 返回 化学与材料科学学院 三、氨基酸的性质 氨基酸是蛋白质水解的最终产物，是组成蛋白质的 基本单位。 从蛋白质水解物中分离出来的氨基酸有二十种，除 脯氨酸和羟脯氨酸外，这些天然氨基酸具有共同或 特异的理化性质。 氨基酸为无色晶体，不同氨基酸晶体形状不相同 化学与材料科学学院 构成蛋白质20种氨基酸中，除甘氨酸外，均含 有一个手性-碳原子，都具有旋光性，能使偏振光 平面向左或向右旋转，左旋者通常用（-）表示，右 旋者用（+）表示； 各种氨基酸都有特定的比旋光度，可作为各种 氨基酸的定性、定量测定的依据； 比旋光度是氨基酸重要物理常数。参见表1-3 1、氨基酸的光学活性 化学与材料科学学院 化学与材料科学学院 2、氨基酸的光吸收性质 构成蛋白质20种氨基酸在可见光区都没有光吸 收，远紫外区（220 nm）均有紫外吸收； 在近紫外区220-300nm只有酪氨酸，苯丙氨酸 、色氨酸有吸收光能力。 重要知识点 ！ 大多数蛋白质含有这三种氨基酸残基，所以测 定蛋白质溶液280 nm的光吸收值是分析溶液中蛋 白质含量的快速简便的方法。 化学与材料科学学院 芳香族氨基酸的紫外吸收 酪氨酸的max275nm 色氨酸的max280nm 苯丙氨酸的max257nm 酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸有 紫外光吸收能力，前者二个最 大吸收峰在280nm 附近； 化学与材料科学学院 考马斯亮兰法（Bradford法） n folin酚试剂法（Lowry法） n 紫外吸收法 蛋白质含量测定方法 知识延伸 作业：查阅这三种方法测定原理？ 化学与材料科学学院 3. 两性解离和等电点 n 从结构上看，氨基酸分子中含有羧基（-COOH)和氨基（- NH2） n 从物理化学性质上看，氨基酸具有盐的某些属性：白色晶 体、熔点很高（200以上分解），不同程度溶于水，水 溶液具有较高的介电常数；不同一般的羧酸和胺； n 氨基酸在结晶形态或水溶液中，并不是以游离的羧基或氨 基形式存在； n 氨基酸以解离成两性离子，氨基以质子化（-NH3+)形式存 在，羧基以离解状态（-COO-）存在。 化学与材料科学学院 氨基酸的酸碱性质 氨基酸在水溶液中或在晶体状态时主 要时以两性离子的形式存在。 氨基酸的理化性质 化学与材料科学学院 氨基酸的兼性离子（ 净电荷0） 阳离子 （净电荷+1） 质子受体 阴离子 （净电荷-1） 质子供体 pH=pI +OH- pHpI +H+ +OH- +H+ pHpI 水溶液中形式 氨基酸的理化性质 化学与材料科学学院 氨基酸的理化性质 氨基酸的可解离基团的pK值：氨基酸的每一功能基因可被酸 碱所滴定，可根据氨基酸的滴定曲线来推算pK值。 氨基酸的酸碱性质两个重要概念 氨基酸的等电点 pI 化学与材料科学学院 v等电点(isoelectric point, pI) :在某一pH的溶液中， 氨基酸解离成阳离子和阴离子的趋势及程度相等，成 为兼性离子，呈电中性。此时溶液的pH值称为该氨 基酸的等电点。 等电点的定义 重要知识点 ！ n在等电点时，氨基酸既不向正极也不向负极移动，即氨基 酸处于两性离子状态； n氨基酸是两性电解质，其解离程度取决于所处溶液的酸碱 度，在不同的pH条件下，两性离子的状态也随之发生变化。 化学与材料科学学院 由甘氨酸（Gly）的两性解离和滴定曲线 可以看出，在pH2.34和pH9.60处，Gly具 有缓冲能力。 pK1和pK2分别代表碳上COOH和 NH3+的解离常数负对数。 曲线的转折点pK1=2.34，在此pH条件 下，有一半发生电离。可以将1mol/甘氨 酸溶于水时，溶液的pH约为6 ，用标准 盐酸溶液进行滴定，得到滴定曲线A。 曲线的转折点pK2=9.6，另一半电离。 用标准NaOH溶液滴定,得到曲线B。 等电点的确定 pI=1/2（pK1+pK2）=(2.34+9.6)/2=5.97 图1-3 甘氨酸的酸碱滴定曲线 化学与材料科学学院 pI=1/2（pK1+pKR）1/2 (2.19+4.25)=3.22 pK1、pKR代表分别代表 两性离子两边的解离常数 pK值； 谷氨酸的等电点计算 谷氨酸的滴定曲线 化学与材料科学学院 Titration curve for histidine 组氨酸的滴定曲线 化学与材料科学学院 pI= （pK1+pK2） 1 2 n侧链没有可解离基团的中性氨基酸，其等电点是它的pK1和 pK2的算术平均值： 碱性氨基酸： pI= （pK2+pKR） 1 2 酸性氨基酸： pI= （pK1+pKR） 1 2 天冬氨酸Asp和 谷氨酸Glu 组氨酸His、精 氨酸Arg、赖氨 酸lys 等电电点计计算公式 (pK1 、 pK2和pKR分别代表a-C上COOH、NH3+以及侧链基团 的解离常数负对数，通过测定滴定曲线的实验方法求得。 n对于侧链含有可解离基团的氨基酸，其pI值也决定于 两性离子两边的pK值的算术平均值。 化学与材料科学学院 蛋白质的pK和pI值 化学与材料科学学院 n 所带净电荷为零，氨基酸主要是两性离子形式; 氨基酸的电解（或解离）处于动态平衡； 易沉淀（失去静电斥力）。 等电点时氨基酸的特性 化学与材料科学学院 混合氨基酸的分离或制备； 判断在某一pH值下氨基酸的带电性。 pH pI时，氨基酸带净负电荷，在电场中将向正极移动； pH pI时，氨基酸带净正电荷，在电场中将向负极移动； pH = pI时，氨基酸所带净电荷为零，在电场中在原点不动。 当pH = pH pI, 则|pH |越大，氨基酸所带电量越高。 氨基酸等电点特征的应用 知识延伸 化学与材料科学学院 (一)氨基酸的制备 制备氨基酸有4种途径： 从蛋白质水解液中分离提取； 应用发酵法生产； 应用酶的催化反应生成氨基酸； 有机合成法。 适宜于中 小规模的生产 可大规模 生产 氨基酸的制备和应用状况 知识延伸 化学与材料科学学院 （二）氨基酸的用途 p蛋白质的基本组成 p对生物体具有其他特殊的生理作用； p参与许多代谢作用，不少已用来治疗疾病； p用于食品强化剂、调味剂、着色剂、甜味剂和增味剂 p用于饲料添加剂； p调节皮肤pH值和保护皮肤的功能 氨基酸的制备和应用状况 知识延伸 化学与材料科学学院 -氨基酸的重要化学反应 氨基酸既含有氨基，又含有羧基，其性质集中地表 现在这两个官能团上 。 RCHCOOH NH2 酯化 酰化 脱羧 叠氮化 与亚硝酸反应 与醛酮反应 烃基化反应 成盐 知识延伸 化学与材料科学学院 n 氨基酸分子的氨基、羧基和一些侧链活性 官能团发生多种化学反应： -氨基参与的反应 -羧基参与的反应 -氨基和羧基共同参与的反应 不同侧链基团性质决定的化学反应 知识延伸 化学与材料科学学院 1）-氨基参与的反应 与甲醛发生羟甲基化反应 与亚硝酸反应 酰化反应 烃基化反应 生成西佛碱的反应 脱氨基和转氨基反应 知识延伸 化学与材料科学学院 例1.与亚硝酸反应（nitrous acid reaction) n在标准条件下测定生成的氮气体积，可对氨基酸进 行定量分析（范斯来克-Van Slyke氨基氮测定法）; HNO2+H2N-CH-COOHHO-CH-COOH+N2+H2O R R n蛋白质水解程度的测定。 重氮化反应，得到-羟基酸，定量地放出N2气 知识延伸 化学与材料科学学院 例2.与2，4二硝基氟苯反应（Sanger反应） 应用： DNFB用于测定蛋白质肽链N-末端氨基酸。 知识延伸 化学与材料科学学院 成盐反应 形成酯的反应 形成酰卤的反应 叠氮化反应 脱羧反应 -羧基参与的反应 知识延伸 化学与材料科学学院 例1.与Ba(OH)2共热失去羧基形成相应的胺 知识延伸 化学与材料科学学院 例2.人体内通过脱羧酶发生脱羧反应 知识延伸 化学与材料科学学院 与茚三酮反应:氨基酸与茚三酮水合物共热，可生 成蓝紫色化合物，其最大的吸收峰在570 nm处。 由于最大吸收峰值与氨基酸的含量存在正比例关 系，因此，可作为氨基酸的含量定量分析； 成肽反应：一个氨基酸的羧基可与另一个氨基酸 的氨基反应成肽。 3）-氨基和羧基共同参与的反应 知识延伸 化学与材料科学学院 例1.与茚三酮反应(ninhydrin reaction) （无色） 蓝紫色 化合物 加热 （1）利用生成的蓝紫 色（比色法），此反应 用于氨基酸的定性和定 量分析。 （2)通过测定反应中释 放出的二氧化碳的量可 以计算氨基酸的量 （3）脯氨酸和羟脯氨 酸与茚三酮反应不释放 氨，直接生成黄色化合 物。 知识延伸 化学与材料科学学院 -HOH 例2 成肽反应(peptide reaction) 肽键 知识延伸 化学与材料科学学院 肽链的异构体 由两种氨基酸组成的如A和B形成的二肽，有两种异 构体； 有三种氨基酸组成的三肽，有六种异构体； 四肽有24个异构体； 五肽有120种异构体，以此类推， n个氨基酸的异构体，从理论上就有 1234n个异构体。 即它们的结构不同，性质相似，但却也不尽相同。 知识延伸 化学与材料科学学院 4）不同侧链基团性质决定的化学反应 巯基的性质 羟基的性质 咪唑基的性质 甲硫基的性质 芳香环的性质 知识延伸 化学与材料科学学院 例1.与异硫氰酸苯脂反应（Edman degradation） 应用：用于测定蛋白质肽链N-末端氨基酸排列顺序； 蛋白质氨基酸自动测序仪。 知识延伸 化学与材料科学学院 例2.与荧光胺的反应 应用：采用荧光光度法测定氨基酸含量 产物的激发波长为： x390nm，发射波长为：M475nm 读取发射光的M（荧光强度）即可测定氨基酸含量。 知识延伸 化学与材料科学学院 指示: 删除样本文档图标,并替换为工作 文档图标，如下: 在 Word 中创建文档. 返回 PowerPoint 在“插入”菜单中选择“对象.” 单击“从文件创建” 定位“文件”框中的文件名 确认选中“显示为图标”。 单击“确定” 选择图标 从“幻灯片放映”菜单中选择“动 作设置” 单击“对象动作”，并选择“编辑” 单击“确定” 第二节 多肽(peptide) 一、多肽的结构 二、肽键 三、多肽的性质 四、天然存在的重要多肽 五、多肽的合成 化学与材料科学学院 赫尔曼埃米尔费费歇尔Hermann Emil Fischer (1852 - 1919) 1902年,Hermann Emil Fischer 提出了蛋白质 的多肽结构学说。认为蛋白质分子是由许多 氨基酸以肽键（酰胺键）结合而成的长链高 分子化合物。 多肽结构学说 化学与材料科学学院 一分子氨基酸的-羧基与另一分子氨基酸-氨基 脱去一分子水形成的酰胺键称为肽键，形成的化合 物称为肽。 由两个氨基酸组成的肽称为二肽，由多个氨基酸组 成的肽则称为多肽。 指示: 删除样本文档图标,并替换为工作 文档图标，如下: 在 Word 中创建文档. 返回 PowerPoint 在“插入”菜单中选择“对象.” 单击“从文件创建” 定位“文件”框中的文件名 确认选中“显示为图标”。 单击“确定” 选择图标 从“幻灯片放映”菜单中选择“动 作设置” 单击“对象动作”，并选择“编辑” 单击“确定” 多肽的结构 化学与材料科学学院 习惯上，含有10个氨基酸构成的肽称为寡肽； 由10个以上氨基酸组成的肽称为多肽； 指示: 删除样本文档图标,并替换为工作 文档图标，如下: 在 Word 中创建文档. 返回 PowerPoint 在“插入”菜单中选择“对象.” 单击“从文件创建” 定位“文件”框中的文件名 确认选中“显示为图标”。 单击“确定” 选择图标 从“幻灯片放映”菜单中选择“动 作设置” 单击“对象动作”，并选择“编辑” 单击“确定” 寡肽与多肽 多肽链(polypeptide chain)是指许多氨基酸之间 以肽键连接而成的一种结构； 多肽链的方向是从氨基末端（N-末端）走向羧基 末端（C-末端）。 参见蛋白质结构 化学与材料科学学院 + -HOH 甘氨酰甘氨酸 肽键 二肽形成 化学与材料科学学院 在多肽链中，氨基酸残基按一定的顺序排列，这种排列 顺序称为氨基酸顺序； 氨基酸的顺序是从N-端的氨基酸残基开始，以C-端氨基 酸残基为终点的排列顺序。 五肽形成 丝氨酰-缬氨酰-酪氨酰-天冬氨酰-谷酰胺或Ser-Val-Tyr-Asp-Gln 化学与材料科学学院 N末端 C末端 牛核糖核酸酶 124个氨基酸 化学与材料科学学院 多肽是一个线性链状分子 肽链中的氨基酸不是原来完整的分子，多肽链 中的氨基酸单位称为氨基酸残基。 肽键 链状结构 化学与材料科学学院 多肽命名 氨基末端羧基末端 下列五肽命名为丙氨酰谷氨酰亮氨酰缬氨酰组氨酸： 返回 化学与材料科学学院 由一个氨基酸的-羧基与另一个氨基酸的-氨基脱 水缩合而形成的化学键。 二、肽键(peptide bond) 化学与材料科学学院 在蛋白质或多肽的肽键中，氮原子上的孤对电子与羰基具有 明显的共轭作用；组成肽键的原子处于同一平面； -C=O与-N-H之间呈反式面相互平行，很少扭曲。 肽键的特点 0.127nm 键长=0.132nm 0.148nm 肽键的部分双键性质 肽键的键长和键角 1925年Linus Pauling等对肽结晶中肽键 各原子之间键长和键角的分析 化学与材料科学学院 n肽键中的C-N键具有 部分双键性质，不能 自由旋转。 n在大多数情况下， 以反式结构存在。 甘氨酰丙氨酸 肽键的反式结构 返回 化学与材料科学学院 多肽的两性解离 多肽的水解 三、多肽的性质 化学与材料科学学院 多肽的两性解离：在pH0-14范围内，多肽分子中含有游离- NH 2和游离-COOH末端及侧链上可解离的基团 ； 多肽可以看成是一个“大氨基酸”，离解性质和氨基酸相似； 在水溶液中以两性离子形式存在，每一种肽都有其相应的等 电点，计算方法与氨基酸一致且复杂； pI=（pK2+ pK3）/2 1、多肽的两性离解 在等电点时，正离子数目与负离子数目相等，净电荷为零； 等电点的高低，主要取决于侧链上碱性和酸性基团的相对数目 化学与材料科学学院 多肽的水溶液存在形式 多肽与溶液pH 值相关 当溶液pH值小于等电点时，多肽以正离子形式存在； 当溶液pH值大于等电点时，多肽以负离子形式存在； 当溶液pH值等于等电点时，多肽的溶解性最小，电泳时也 不移动； 化学与材料科学学院 2、多肽链的水解 酸水解：常用6mol/L的盐酸或4mol/L硫酸在105-110条件 下进行水解，反应时间约20h； 优点：不容易引起水解产物的消旋化；缺点：色氨酸被沸 算完全破坏； 碱水解：一般用5mol/L的氢氧化钠煮沸10-20h；此法水解 过程许多氨基酸都受到不同程度的破坏，产量太低。 酶水解：主要使用蛋白酶进行部分水解，如胰蛋白酶、胰 凝乳蛋白酶及其羧肽酶氨肽酶。此法不会破坏氨基酸，也 不会发生消旋化，水解产物为部分较小肽段。 返回 化学与材料科学学院 活性肽 生物的生长、发育、细胞分化、大脑活动、肿瘤 病变、免疫防御、生殖控制、抗衰老、生物钟规 律及分子进化等均涉及到活性肽。 生物活性肽是机体内传递信息、调节代谢和协调 器官活动的重要化学信使。 天然存在的重要多肽 化学与材料科学学院 高等动物中枢神经系统产生的一类小活性肽。如 Met-脑啡肽和Leu-脑啡肽等。 +H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-COO- +H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-COO- 1、脑啡肽是一类重要的肽 天然存在的重要多肽 化学与材料科学学院 2. 多肽类激素及神经肽 促甲状腺素释放激素的N端残基是谷氨酸，此残基易于自身环化 成焦谷氨酰基（氨基与谷氨酸的羧基脱水缩和而成）。 天然存在的重要多肽 化学与材料科学学院 3、抗生素 抗革兰阴性杆菌抗生素， 具杀菌作用 具有表面活性剂的作用,能降低细 菌细胞膜的表面张力,改变膜的通 透性,甚至破坏膜 天然存在的重要多肽 化学与材料科学学院 4、激素 天然存在的重要多肽 化学与材料科学学院 天然存在的重要多肽 5、谷胱甘肽(glutathione, GSH)是体内重要的还原肽 谷胱甘肽的分子中有一个特殊的肽键，是由谷氨酸的羧基与半胱氨酸 的氨基缩合而成。由于GSH中含有一个活泼的巯基很容易氧化，二分 子GSH脱氢以二硫键相连成氧化型的谷胱甘肽（GSSG）。 返回 化学与材料科学学院 五、多肽的化学合成 多肽的化学合成，是按照设计的氨基酸顺序，通过定向形成 酰胺键方法得到目标多肽分子； 氨基酸之间形成酰胺键的反应相当复杂； 要成功的合成具有特定氨基酸顺序的多肽，必须采用定向形 成酰胺键方法，即对暂时不参予形成酰胺键的氨基和羧基， 以及侧链活性基团进行保护。同时还要对羧基进行活化。 化学与材料科学学院 化学与材料科学学院 （一）氨基酸常用的保护方法 化学与材料科学学院 保护基必须具备的条件 p易在预定的部位引入，在接肽时能起保护作用； p在某特定的条件下，保护基很易除去； p引入和除去保护基时，分子中的其它部位 不会受到影响，特别是已接好的肽键。 1.氨基保护 2. 羧基保护 3. 侧链保护 4. 接肽方法 多肽合成必须解决下面四个问题 化学与材料科学学院 1、氨基的保护 u常用氨基保护基的方法：酰化 u最广泛应用的氨基保护基(PG)是叔丁氧甲酰基(t- Boc) u三苯甲基、对甲苯磺酰基、芴甲氧羰基（Fmoc)，可用 HBr/CH3COOH在室温下除去； u苄氧酰基（CBz），通过催化加氢或用金属钠在液氨中处理 除去； 化学与材料科学学院 （1）用芴甲氧羰基保护 n芴甲氧羰基（Fmoc）基团作为保护基的优点： Fmoc基团可被碱脱除 对酸稳定，用三氯乙酸较强酸处理不受影响； 仅用温和的碱处理，通过-消除反应即可脱去，不需要三级胺 中和； nFmoc基团有特征性的紫外吸收，易于监测反应的进行，给使 用仪器自动化合成多肽带来许多方便。 化学与材料科学学院 （2）用叔丁氧羰基保护 t-Butoxycarbonyl 简写BOC n t-Boc是常用的氨基保护基。 n二叔丁基二碳酸酯与氨基酸作用，形成t-Boc-氨基酸，可 以有效地保护氨基； n t-Boc基可以在温和的酸性条件下，以气态形式被除去。 化学与材料科学学院 在多肽中的应用 CF3COOH -OH, 25oC 上保护基 接肽（过程略） 去保护基 化学与材料科学学院 C6H5CH2OH+COCl2（光气) （）用苄氧酰基（或称苯甲氧基甲酰氯）保护 Benzoxycarbonyl（简写Z） Z在弱酸性条件下比较稳定，但在催化氢解条件 下容易被除去。产物也容易分离。 化学与材料科学学院 H2 Pd/C +NH3CH2CO2- OH- H+SOCl2 +NH3CH2CO2-, OH- H+ H+ （1mol） 上保护基 接肽 去保护基 反应过程 返回 化学与材料科学学院 与氨基保护基比较，羧基保护基种类较少； 一般以盐或酯的形式加以保护； 常用的有钾盐、钠盐、三乙胺盐等； 常用的酯类有：甲酯和乙酯、苄酯 、叔丁酯； 叔丁酯是近年来最常用的羧基保护基。 2、羧基的保护 返回 化学与材料科学学院 3、侧链的保护 氨基酸保护基团功能性基团 Ala(A)None Arg(R)Pbf, Mtr, Pmc胍基Guanidine N Asn(N)Trt, Mebh, Tmob酰胺amide Asp(D)OtBu, OAI羧基carboxyl Cys(C)Trt, Acm,tBu,Stbu疏基sulfhydryl Gln(Q)Trt, Mbh, Tmob酰胺amide Glu(E)OtBu, OAI羧基carboxyl Gly(G)None His(H)Trt, Boc咪唑imidazole Ile(I)None Leu(L)None Lys(K)Boc, Aloco,Fmoc氨基amino Met(M)None Orn(O)Boc氨基amino Phe(F)None Pro(P)None Ser(S)tBu羟基hydroxyl Thr(T)tBu羟基hydroxyl Trp(W)Boc吲哚indole Tyr(Y)tBu苯基phenol Val(V)none羟基hydroxyl 返回 化学与材料科学学院 u 巯基经常用苄基和对甲氧苄基，如下式苯甲基保护 上保护基 去保护基 空气中氧化 Na, NH3(l) 实例：巯基的保护 n 保护基可以在钠、液氨作用下除去。 化学与材料科学学院 具有游离氨基的组分称为氨基组分，具有游离羧基的组 分称为羧基组分。 肽键生成的原理是：将N-保护氨基酸或肽的羧基转化成 活化型的RCOX，使得羰基碳原子带有较强的正电性而有利 于氨基组分对它进行亲核反应生成肽键。 RCOOH RCOX RCONHR HX R-NH2 （二）肽键的形成方法 化学与材料科学学院 羧基的羟基不是一个好离去的基团； 羧基本身不是一个最好的酰基化剂； 羧基的活化是将羧基转变成一个活泼的羧基衍生物，提 高羧基的酰化能力。 叠氮法、混合酸酐法和活化脂法均是温和的方法，已经 被广泛应用于肽的合成 1、羧基活化法 化学与材料科学学院 最早使用的方法； 氨基酸的酰氯容易与氨基作用形成肽键； 由于反应过程中容易引起氨基酸消旋化，实际 应用价值小。 （1）酰氯法 化学与材料科学学院 氨基酸的羧基可以转化成酸酐； 酸酐有两个亲电中心，在形成肽键时能够产生几乎等量的 副产物，应用不对称酸酐可以克服此缺点； 氨基被保护的氨基酸在低温且有叔胺的存在下与氯甲酸乙 酯生产成混合酸酐能与另一个氨基酸脂缩合成肽 在无水溶剂中可以减小消旋，保持很低的水平。 （2）混合酸酐法 化学与材料科学学院 -OH, 25oC N(C2H5)3 -5-0oC -(C2H5)3NHCl H2/Pd-C 接肽 C6H5CH2OCOCl Z-氨基酸的三乙胺盐和氯代甲酸酯反应生成混合酸酐 化学与材料科学学院 普通的氨基酸烷基酯就可以酰化另一氨基酸的氨基； 氨基被保护的氨基酸对硝基苯脂能与另一氨基酸的氨基缩合 成肽，此法作用温和、产率较高； 但如不够活泼时，可以在酯基内加入强吸电子基因，以增加 羧基的亲电能力，使更容易形成酰胺键。 （3）活化酯法 化学与材料科学学院 N(C2H5) 3 H+ 实例：对硝基苯酯，就是一个更为活泼的酯基 化学与材料科学学院 n 氨基酸酯与肼作用生成酰肼，酰肼与亚硝酸作用则生成叠氮 化合物，这个叠氮化合物与另一氨基酸酯作用即能缩合成二肽 。此法可称为叠氮法； n 用此法合成的肽能保持光学纯度。 （4） 叠氮法 化学与材料科学学院 2、偶联剂缩合法 偶联剂本身是一种脱水剂，能够促进羧基和氨基 之间的缩合反应 缩合剂可以直接与一个羧基被保护的氨基酸和一 个氨基被保护的氨基酸一起反应； 化学与材料科学学院 N， 二环己基碳二亚胺 dicyclohexylcarbodimide (DCC) 接肽 H2 / Pd-C 去保护基 DCC先与一份子氨基酸的羧基反应，形成类似酸酐的中间产 物，中间产物再与第二分子氨基酸的氨基作用，形成肽键 u反应中产生的二环已脲（DCU），不溶于大多数有机溶 剂，容易与产物分离。 化学与材料科学学院 3、脱保护基 脱保护基的方法形形色色，其重要性不亚于多肽的合成 。 三氟乙酸（TFA）是最常用的脱保护基试剂，可以脱除一 些不耐酸的保护基如Boc、tBu等。 TFA法比较温和，副反应少，因此得到越来越多的应用。 不足是用量比较大。 化学与材料科学学院 （三）多肽的固相合成 液相合成法 固相合成法 化学与材料科学学院 液相合成法 u 可以分为逐步延长法（stepwise elongation)和片段缩合法 (fragment condensation)。 u前者常用于合成小肽，后者用于合成比较长的肽链。其中的 片段缩合法可以分为大片段缩合法、较大片段缩合法和较小 片段缩合法三种。 u 液相合成法最经典的例子是牛胰RNaseA的合成。 化学与材料科学学院 u以往的多肽合成是在溶液中进行的； u自从1962年麦瑞菲尔德-Merrifield发展新的固相多肽合成方 法以来，经过不断的改进和完善，到今天固相法已成为多肽 和蛋白质合成中的一个常用技术，表现出了经典液相合成法 无法比拟的优点。 u固相合成法的特点是不必纯化中间产物，合成过程可以连 续进行，已经发展成为多肽自动合成仪。 多肽的固相合成法 Solid phase peptide synthesis 化学与材料科学学院 先将所要合成目标肽链的C-末端氨基酸的羧基以共价键形式 与一个不溶性的高分子树脂相连； 然后以这个氨基酸的氨基作为起点，与；另一分子氨基酸的 羧基作用（用DCC做偶联剂）形成肽键； 重复（缩合洗涤去保护中和和洗涤下一轮缩合）操 作，达到所要合成的肽链长度，最后将肽链从树脂上裂解下 来，经过纯化等处理，即得到目标的多肽。 固相合成法的基本原理 化学与材料科学学院 化学与材料科学学院 树脂的选择 l 将固相合成与其他技术分开来的最主要的特征是固相 载体，能用于多肽合成的固相载体必须满足如下要求 ： p 必须包含反应位点（或反应基团）； p 必须对合成过程中的物理和化学条件稳定； p 允许在不断增长的肽链和试剂之间快速、不受阻碍的接触； p 提供足够的连接点，以使每单位体积的载体给出有用产量的 肽，并且必须尽量减少被载体束缚的肽链之间的相互作用。 化学与材料科学学院 主要有三类： 聚苯乙烯-苯二乙烯交联树脂 聚丙烯酰胺 聚乙烯-乙二醇类树脂及衍生物 固相法合成多肽的高分子载体 化学与材料科学学院 聚苯乙烯树脂 化学与材料科学学院 n这些树脂只有导入反应基团，才能直接连上第一个氨基酸； n根据所导入反应基团的不同，又把这些树脂及树脂衍生物分 为氯甲基树脂、羧基树脂、氨基树脂； n氨基酸的固定主要是通过保护氨基酸的羧基同树脂的反应基 团之间形成的共价键来实现的。 固相法合成多肽的高分子载体作用 化学与材料科学学院 n氯甲基树脂：通常先制得保护氨基酸的四甲铵盐或钠盐、钾 盐、铯盐，然后在适当温度下，直接同树脂反应或在合适的有 机溶剂如DMF或DMSO中反应； n羧基树脂，通常加入适当的缩合剂如DCC或羧基二咪唑，使 被保护氨基酸与树脂形成共酯以完成氨基酸的固定； n氨基树脂或酰肼型树脂，加入适当的缩合剂如DCC后，通过 保护氨基酸与树脂之间形成的酰胺键来完成氨基酸的固定。 高分子载体共价键形成的方法 化学与材料科学学院 在固相合成绝大多数常用二氯甲烷为溶剂； a-氨基用Boc（叔丁氧羰基）保护的称为Boc固相合成法， a-氨基用Fmoc（芴甲氧羰基）保护的称为Fmoc固相合成法 。 固相合成法的类型 化学与材料科学学院 丁氧羰基（Boc）固相合成法 侧链保护基采用苄醇类； 常用树脂为氯甲基化聚苯乙烯树脂或羟甲基化聚苯乙烯树 脂或对乙酰基苄脂树脂； Boc保护-氨基的氨基酸衍生物共价交联到树脂上，用TFA 脱除Boc，三乙胺中和游离的氨基末端 再偶联下一个氨基酸，。 缺点：反复用酸脱除保护基，然后用氟化氢把肽段从树脂 上裂解下来，不可避免地会引起或多或少的副反应；某些 侧链保护基的不稳定，已经延长的肽链从固相支持物上的 逐步损失，还有天冬氨酸、谷氨酸残基的侧链变化 化学与材料科学学院 丁氧羰基（Boc）固相合成法 化学与材料科学学院 化学与材料科学学院 Fmoc固相合成法 C末端氨基酸与树脂结合 Na-Fmoc的脱除、洗涤 偶联、洗涤 重复(2)(3)步 脱保护基 化学与材料科学学院 Boc法用TFA+HF裂解和脱侧链保护基，Fmoc法直接用 TFA，有时根据条件不同，其它碱、光解、氟离子和氢解等脱 保护方法也被采用。合成肽链进一步的精制、分离与纯化通常 采用高效液相色谱、亲和层析、毛细管电泳等。 裂解及合成肽链的纯化 化学与材料科学学院 固相合成法对于肽合成的显著的优点 u 简化并加速了多步骤的合成； u因反应在一简单反应器皿中便可进行，可避免因手工操作 和物料重复转移而产生的损失； u固相载体共价相联的肽链处于适宜的物理状态，可通过快 速的抽滤、洗涤未完成中间产物的纯化，避免了液相肽合 成中冗长的重结晶步骤，可避免中间体分离纯化时大量的 损失； u 固相载体上肽链和轻度交联的聚合链紧密相混，彼此产生 一种相互的溶剂效应，这对肽自聚集热力学不利而对反应 适宜。 化学与材料科学学院 固相合成存在的主要问题 固相合成的主要存在问题是固相载体上中间体杂肽无法 分离，这样造成最终产物的纯度不如液相合成物; 必需通过可靠的分离手段纯化。 化学与材料科学学院 可溶性的问题 许多合成的肽粗品，尤其是那些经过几次沉淀和干燥的， 在标准的HPLC溶剂中十分难溶，原因为： 含有大量的疏水性残基，它们会象油一样紧密的拥成一簇 ，以减少与水的接触并增大 分子之间的疏水性作用。 非特异性的聚集。 含有Cys的肽中形成二硫键。 二级结构的形成，特别是较长的分子。 活性侧链（包括各种类型的氢键、盐桥等）之间的特异性 相互作用 化学与材料科学学院 肽的溶解 对于含有芳香或者烃侧链的氨基酸（Val、Leu、Ile、Met、Phe、Tyr、Ala ），加入DMF至50%溶解；或者加入最少量的DMF，然后用缓冲液稀释即 可。但应当注意有机溶剂对于后续试验的影响。 如果含有较多的碱性氨基酸，可以用醋酸的水溶液（1