儿童常见疾病的实验室诊断

儿童感染性疾病的儿童感染性疾病的 实验室诊断实验室诊断 前 言 感染性疾病是严重威胁儿童生命与健康的首要 元凶，至今全世界每年有1 300万儿童死于感染 性疾病。 我国儿童疾病谱已发生重大变化，先天性遗传 代谢性疾病、肿瘤、变态反应性疾病和心理行为 异常等的发生率有所上升，但感染性疾病仍是儿 童时期最常见的疾病。 儿童感染性疾病的病原体包括细菌、病毒、真 菌、支原体、衣原体、立克次体、螺旋体及寄生 虫等 儿童常见感染性疾病 的病原学特点 急性上呼吸道感染 病原体以病毒为主,占原发上感的90%以上， 支原体和细菌较少见。 常见病毒:柯萨奇病毒、流感病毒、副流感病 毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒等 肺炎支原体：不但可引起肺炎，也可引起上 感，肺炎多见于5-14岁小儿 常见细菌：溶血性链球菌A组、肺炎链球菌 、嗜血流感杆菌及葡萄球菌 多见于婴幼儿，与其呼吸系统生理解剖特点有关 ：支气管腔窄，纤毛运动差，血管丰富等，加上 免疫防御功能尚未充分发育。 WHO调查显示，2002-2006年全球5岁儿童死亡 原因中肺炎居首位(19%)。 按病原体分类：细菌性肺炎、病毒性肺炎、真菌 性肺炎、支原体肺炎、衣原体肺炎等。 明确儿童肺炎的病原学特点，作出正确诊断，对 肺炎的治疗具有重要的指导意义。 肺炎 研究报道，在北京儿童医院下呼吸道感染的病原学监 测结果：病原阳性58.5%，单纯细菌感染25%、单纯 病毒感染32%、支原体感染13%、混合感染28%。常 见病原中，RSV占28.4%，肺炎链球菌占16.7%、流 感嗜血杆菌13.7% 芬兰对254例社区获得性肺炎的病原学研究结果，住 院的肺炎病人中85%可找到病原学证据，其中62%为 病毒感染，53%为细菌感染，30%为混合感染。最常 见的病原为：肺炎链球菌（37%），RSV（29%）和 鼻病毒（24%） 020天 B族链球菌、革兰氏阴性肠道细菌、CMV 3周3月 RSV、副流感病毒、肺炎链球菌、金葡 菌等 4月4岁 RSV、ADV、流感及副流感病毒、肺炎 支原体、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌属等 515岁 肺炎支原体、肺炎衣原体、肺炎链球菌等 儿童不同年龄段的社区获得 性肺炎的病因 常见病毒：呼吸道合胞病毒(RSV)、流感病 毒(IFV)、副流感病毒(PIFV)、腺病毒(ADV) 、巨细胞病毒(CMV)、肠道病毒(EV)、鼻病 毒(RV)及麻疹病毒等。 有研究报道，304例病毒性肺炎儿童呼吸道 标本病毒抗原检测，阳性病毒株中，RSV占 23%，ADV占15%，IFV-A占24%， IFV-B占 16%，副流感病毒(PIFV)占5% 病毒性肺炎 常见细菌：肺炎链球菌、B型嗜血杆菌、化 脓性链球菌、革兰氏阴性肠道菌 有研究报道，细菌性肺炎患儿中以肺链感染 最多，其次为表皮葡萄球菌、流感嗜血杆菌 、卡他莫拉菌、大肠埃希氏菌、金黄色葡萄 球菌。 年龄因素：肺链可见于各年龄期，金黄色葡 萄球菌，B组链球菌及肠杆菌属主要发生在6 月尤其3个月以内的婴幼儿，流感嗜血杆菌好 发于3个月到5岁。 细菌性肺炎 我院09年痰标本中细菌分离情况 ESBLs(超广谱-内酰胺酶 ) 主要由大肠埃希菌和克雷伯菌属菌产生 是由质粒介导，水平传播，能水解亚氨 基-内酰胺，并可被-内酰胺酶 抑 制剂（克拉维酸等）所抑制的一类酶 易在不同菌株间传播 对青霉素类，头孢菌素类及单环类治疗 无效（无论体外试验是否敏感） 湖北地区ESBLs菌株检出率 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 耐苯唑西林的金黄色葡萄球菌 （ MRSA） 由于低亲合力青霉素结合蛋白（ PBP2a ） 的产生，对抗菌药物的亲和力降低，对多 种作用青霉素结合蛋白（PBPS）的抗菌药 物均耐药 对所有青霉素类、头孢菌素类、碳青霉烯 类和酶抑制剂的复合制剂均应报告耐药， 而不考虑其体外药敏的结果. 对MRSA的首选药物是糖肽类药物万古霉素 湖北地区MRSA流行率 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 在我国属第二位常见多发病，仅次于呼吸道 感染，是儿童患病和死亡的主要原因,也是营 养不良的重要原因 。 WHO统计, 除中国外，全世界每年有10亿人 患腹泻,其中5亿发生在发展中国家.我国卫生 部疾病控制司的调查结果显示,我国每年有 8.36亿人次患腹泻,其中5岁以下儿童占3亿人 次, 5岁以下儿童的年发病率平均为1.9次/人 小儿腹泻病 包括细菌性痢疾、阿米巴痢疾、伤寒沙门氏 菌肠炎、致病大肠杆菌肠炎、空肠弯曲菌肠 炎、轮状病毒肠炎、真菌性肠炎等。 夏季腹泻：其主要病原菌为致病性大肠杆菌 与痢疾杆菌；秋季腹泻：在1973年，被澳大 利亚学者用电镜在十二指肠粘膜活检标本及 粪便中发现，命名为轮状病毒。 随着经济发展，卫生条件改善，细菌性腹泻 愈来愈少，而病毒性腹泻发病率相对升高。 小儿腹泻病 好发于6个月至2岁婴幼儿，多发生在10、11 、12、1月秋冬季。 在病毒性腹泻中以轮状病毒肠炎发病率最高 ，症状较重。 在中国小儿腹泻病病原构成比中，轮状病毒 约占40%，位居第一位。 轮状病毒肠炎 是世界各国儿童致残和死亡的重要原因之一； 主要包括病毒性脑膜炎和脑炎、化脓性脑膜炎、结 核性脑膜炎； 其临床特点为发热、头痛、呕吐、 烦躁不安、惊厥、嗜睡、昏迷、 前囟隆起、颈项强直、 脑脊液改变。 中枢神经系统感染 疫苗接种能预防许多病毒引起的神经系统严重疾病，如脊髓 灰质炎、麻疹脑炎、腮腺炎脑膜脑炎、乙型脑炎等； 仍有许多其他病毒感染对发育期和成熟中枢神经系统的结构 和功能造成严重危害。主要包括： 肠道病毒属：柯萨奇病毒、埃可病毒、肠道病毒71型等， 疱疹病毒属：单纯疱疹病毒、人类疱疹病毒6型、巨细胞病毒、EB 病毒、水痘病毒等。 实验结果显示，武汉地区肠道病毒脑膜炎占无菌性脑膜炎的 80左右；且培养结果显示，多数肠道病毒血清型可引起中 枢神经系统感染，多呈散发，某些血清型可引起局部暴发流 行，血清型与临床损害缺乏明确的对应关系 病毒性脑炎 脑脊液检查一般显示细胞数有轻到中度增高，通常 以单核细胞为主。 脑脊液中蛋白可轻度增高，糖、氯化物往往正常。 通常难以从血液或脑脊液中分离到病毒， 利用PCR技术检查脑脊液中病毒核酸已成为病原诊 断的常用方法 。 病毒性脑炎-CSF检查 简称化脑， 尤其是婴幼儿较常见， 系由各种化脓 菌感染引起的脑膜炎症。 使用抗生素以来其病死率已由5090降至10 以下，但因致残率高，神经系统后遗症发生率占存 活儿的13，因此仍是小儿严重感染性疾病之一。 临床以发热、呕吐、头痛及精神改变等症状、脑膜 刺激征和脑脊液改变为特征。 化脓性脑膜炎 据美国资料,化脑的人群年发病率为1万5万； 5岁以下小儿的年发病率达8.7万，5岁以上者仅0 22万；2岁以内发病者约占本病的75 ，高峰 发病年龄为612个月。 在我国,脑膜炎球菌、肺炎链球菌及流感杆菌引起的 化脑占小儿化脑总数23以上。 不同年龄小儿感染的致病菌也有很大差异。新生儿 易发生肠道革兰阴性杆菌脑膜炎，其中大肠杆菌占 第一位，其次为金黄色葡萄球菌、变形杆菌、铜绿 假单胞菌、产气杆菌等。 化脓性脑膜炎 化脑患儿白细胞总数及中性粒细胞明显增加，贫血 常见于流感杆菌脑膜炎。 早期未用抗生素治疗者，血及脑脊液培养可得阳性 结果，能帮助确定病原菌。 脑脊液常规可见典型化脓性改变。其外观混浊或稀 米汤样，压力增高。镜检白细胞甚多，每升可达数 百至数万，其中以多核细胞为主。糖定量常2 mmolL。蛋白定性试验多为强阳性，定量常在1 g L以上。将脑脊液离心沉淀，作涂片染色，常能 见病原菌。 化脓性脑膜炎-CSF检查 病原学诊断是儿童感染性疾病诊 治中的关键环节。 可大大提高临床诊断水平，判断 疗效。 指导合理应用抗生素并考核其疗 效，遏制与延缓耐药菌株的产生。 为研究感染性疾病的致病机制和 流行病学特点，指导有效预防、控 制与管理措施提供有力依据。 病原学诊断的作用 病原学实验室诊断 的常用技术 传统方法 以病原体的分离培养和鉴定为主体， 至今仍是许多感染性疾病诊断的金标准 需时长、费用高、阳性率低等 新的病原学诊断技术 应用单克隆抗体的各种免疫学检测技术 核酸杂交技术 核酸扩增技术 流式细胞术等 新技术使病原体的检测变得更敏感、特异和快速，展 现出巨大的应用前景 病原学诊断技术的发展 分离培养与鉴定技术 形态学检测技术 免疫学检测技术 基因诊断技术 流式细胞术 病原学诊断技术分类 培养与鉴定技术 对病原体的分离培养不仅能使感染性疾病得以确 诊，而且建立在此基础上的药敏试验可指导临床 合理用药,如痰培养、咽拭培养、血培养等。 但是某些病原体目前还无法进行体外培养，或培 养步骤繁复而无法在小型实验室常规开展，如支 、衣原体、病毒等 更重要的是许多儿科感染常见病原体的培养结果 无法及时获取以指导临床治疗， 这些缺点大大限制了分离培养技术在病原学诊断 中的应用。 光镜检查：各种标本(血、尿、粪、脑脊液、胸腹 水、骨髓、脓液、皮肤瘀点等)制成的涂片，进行革 兰或特殊染色后可置普通光学显微镜下直接观察， 这是确定很多感染性疾病病原体的最基本和快速的 方法。 电镜检查：主要用于观察细菌、 病毒等的超微结构，对病毒感 染尤其具有快速诊断的价值。 形态学检测技术 免疫学检测技术(1) 其基本原理是抗原抗体反应，可利用单克隆 抗体检测病原体的特异性抗原，也可利用病 原体抗原检测患者体内的特异性抗体。 在病毒、支原体、衣原体、 立克次体等难培养病原体的 诊断中具有很大的实用价值。 免疫学检测技术(2) 酶免疫技术(EIA)：具有高度的特异性和敏感性，几 乎所有可溶性抗原抗体反应系统均可检测，最小可 测值可达纳克甚至皮克水平，且与IFA比较具有操 作简便、结果易判定、重现性好等优点。 ELISA：MP,CP-IgM，RSV、ADV、CMV、EB、 细小病毒等病毒的IgM、IgG 免疫印迹法：过敏原、ENA等 胶体金技术：HRV、HbsAg等 ELISA（酶联免疫吸附试验) 免疫学检测技术(3) 免疫荧光技术(IFA):是用荧光素标记抗 体分子，借助荧光显微镜检测相应抗原 或抗体，分直接法和间接法。 该方法可清楚的观察病原体抗原并定位 ，具有简单、敏感、特异等优点，已广 泛应用于病毒感染性疾病的诊断。 RSV、ADV、IFV、PIFV、嗜肺军团菌、Q 热立克次体、MP、CP等 免疫荧光技术 (IFA) 免疫荧光技术(IFA) 免疫学检测技术(3) 间接凝集反应：包括正向间接凝集反应和反向间接 凝集反应。正向间接凝集反应是以抗原致敏载体检 测标本中的相应抗体，反向间接凝集反应是以抗体 致敏载体检测标本中的相应抗原。 由于其操作简便、反应快速， 因而常用于流行病学调查和筛 选阳性标本。在标本中直接检 出细菌抗原，有利于感染性疾 病的早期诊断。 应用：MP-Ab,TP等, 基因诊断技术(1) 核酸杂交技术：不同病毒其核苷酸排列不相同，因 此利核酸链间碱基互补的原理进行基因诊断，即杂 交技术。优点是特异性强、敏感度高。缺点是实验 条件要求严格，需要精密先进的设备，尚未能常规 用于感染性疾病的病原学诊断。 常用方法有斑点杂交、 Southern 印迹、 Northern印迹、 原位杂交等。 基因诊断技术(1) 核酸扩增技术：以聚合酶链反应PCR技术最 常用和最成熟。PCR技术在敏感性、特异性 、检测速度等方面的强大优势使其越来越广 泛的被应用于各种感染的病原学诊断。 应用：HBVDNA，CMV、 EB、MPDNA，HCV、 RSV-RNA，TB、肺炎链球菌等 基因诊断技术(2) 基因定量诊断技术：是在聚合酶链反应PCR技术基 础上发 展起来的新技术，包括核酸杂交定量技术 和PCR定量技术， 主要用于数种病毒基因的定量 分析，如HIVA型、HBV、HCV、CMV、HPV等。 实时荧光定量PCR法为目前应用最广的基因定量诊 断技术，根据PCR反应液的荧光强度即可计算出初 始模板的数量，具有自动化程度高、动态监测、防 止污染等优点。 可用于病情评估、疗效预测、预后判断等，在感染 性疾病诊断中具有重要的临床应用价值。 实时荧光定量PCR法 基因诊断技术(3) 基因芯片技术：该技术是将大量探针同时固定于支 持物上，一次可对大量核酸分子进行检测分析，解 决了传统核酸印迹杂交技术操作复杂、自动化程度 低、检测目的分子数量少、效率低等不足，因此可 在短时间内对诊断不明的感染性疾病作出判断。 基因芯片还可用于病原体变异株、基因分型、耐药 基因等检测，随着其技术的日趋成熟也逐步在感染 性疾病的病原学诊断中发挥巨大作用。 应用：HBV基因分型、TB、HP 基因芯片技术 芯片 制备 识别 分子 片 基 1.加样 2.反应 3.洗涤 靶 分 子 荧光