最小抑菌浓度测定

几种测定抗菌药物最低抑菌浓度（MIC）方法 1.1.常量肉汤稀释法 1.1.1.抗菌药物贮存液制备 抗菌药物贮存液浓度不应低于 1000g/ml(如 1280g/ml)或 10 倍于最高测定浓度。溶解度低的抗菌药物可稍低于上述浓度。抗菌药物直接购自厂商或相 关机构。所需抗菌药物溶液量或粉剂量可公式进行计算。例如：需配制 100 ml 浓度为 1280g/ml 的抗生素贮存液，所用抗生素为粉剂，其药物的有效力为 750g/mg。用分析 天平精确称取抗生素粉剂的量为 182.6 mg。根据公式计算所需稀释剂用量为：（182.6 mg750g/ml）/1280g/ml=107.0ml，然后将 182.6 mg 抗生素粉剂溶解于 107.0ml 稀释 剂中。制备抗菌药物贮存液所用的溶剂和稀释剂见表 5。配制好的抗菌药物贮存液应贮存 于-60 以下环境，保存期不超过 6 个月。 1.1.2.药敏试验用抗菌药物浓度范围 根据 NCCLS 抗菌药物敏感性试验操作标准，药物浓 度范围应包含耐药、中介和敏感分界点值，特殊情况例外。 1.1.3. 培养基 NCCLS 推荐使用 Mueller-Hinton（MH）肉汤， pH7.27.4。需氧菌及兼性 厌氧菌在此培养基中生长良好。在测试葡萄球菌对苯唑西林的敏感性时，应在肉汤中加入 2%（ W/V）氯化钠，按制造厂家的要求配制需要量的 MH 肉汤。嗜血杆菌属菌使用 HTM 肉汤，肺炎链球菌和其它链球菌使用含 2%5%溶解马血的 MH 肉汤。 1.1.4.接种物的制备 有 2 种方法配制接种物，一是细菌生长方法，用接种环挑取形态相似 待检菌落 3-5 个，接种于 4-5ml 的水解酪蛋白（MH）肉汤中，35孵育 2-6h。增菌后的 对数生长期菌液用生理盐水或 MH 肉汤校正浓度至 0.5 麦氏比浊标准，约含 12108CFU/ml。二是直接菌落悬液配制法，对某些苛养菌，如流感嗜血杆菌、淋病奈瑟 菌和链球菌及甲氧西林耐药的葡萄球菌等菌株，推荐直接取培养 1824h 的菌落调配成 0.5 麦氏比浊标准的菌悬液。用 MH 肉汤将上述菌悬液进行 1100 稀释后备用。注意应在 15 分钟内接种完配制好的接种物，并取一份接种物在非选择性琼脂平板上传代培养，以检查 接种物纯度。 1.1.5.稀释抗菌药物的制备及菌液接种 取无菌试管（13100mm）13 支，排成一排，除第 1 管加入 1.6mlMH 肉汤外，其余每管加入 MH 肉汤 1ml，在第 1 管加入抗菌药物原液（如 1280g/ml） 0.4ml 混匀，然后吸取 1ml 至第 2 管，混匀后再吸取 1ml 至第 3 管，如此连 续倍比稀释至第 11 管，并从第 11 管中吸取 1ml 弃去，第 12 管为不含药物的生长对照。 此时各管药物浓度依次为 256、128、64、32、16、8、 4、2、1、0.5、0.25g/ml。然后 在每管内加入上述制备好的接种物各 1ml，使每管最终菌液浓度约为 5105CFU/ml。第 1 管至第 11 管药物浓度分别为 128、64、32、16、8、4、 2、1、05、0.25、0.125g/ml 。 1.1.6.孵育 将接种好的稀释管塞好塞子，置 35普通空气孵箱中孵育 1620h；嗜血杆菌 和链球菌在普通空气孵箱中孵育 2024h；对可能的耐甲氧西林葡萄球菌和耐万古霉素肠 球菌应持续孵育满 24h。 1.1.7.结果判断与解释 在读取和报告所测试菌株的 MIC 前，应检查生长对照管的细菌生长 情况是否良好，同时还应检查接种物的传代培养情况以确定其是否污染，质控菌株的 MIC 值是否处于质控范围。以肉眼观察，药物最低浓度管无细菌生长者，即为受试菌的 MIC。 甲氧苄胺嘧啶或磺胺药物的肉汤稀释法终点判断，与阳性生长对照管比较抑制 80%细菌生 长管药物浓度为受试菌 MIC。 根据 NCCLS 推荐的分界点值标准，判断耐药（resistant, R）、敏感(susceptible, S)或中 介（intermediate, I）。S 表示被测菌株所引起的感染可以用该抗菌药物的常用剂量治疗有 效，禁忌症除外。R 指该菌不能被抗菌药物的常用剂量在组织液内或血液中所达到的浓度 所抑制，或属于具有特定耐药机理（如 -内酰胺酶），所以临床治疗效果不佳。I 是指 MIC 接近药物的血液或组织液浓度，疗效低于敏感菌。还表示被测菌株可以通过提高剂量 （如 -内酰胺类药物）被抑制，或在药物生理性浓集的部位（如尿液）被抑制。另外，中 介还作为“缓冲域”，以防止由微小的技术因素失控，所导致较大的错误解释。 1.2.微量肉汤稀释法 1.2.1.抗菌药物和培养基制备 同常量肉汤稀释法。 1.2.2.MIC 板制备 无菌操作，将倍比稀释后不同浓度的抗菌药物溶液分别加到灭菌的 96 孔聚苯乙烯板中，第 1 至第 11 孔加药液，每孔 10l，第 12 孔不加药作为生长对照，冰冻 干燥后密封，-20以下保存备用。 1.2.3.接种物制备 将用生长法或直接菌悬液法制备的浓度相当于 0.5 麦氏比浊标准的菌悬 液，经 MH 肉汤 11000 稀释后，向每孔中加 100l，密封后置 35普通空气孵箱中，孵 育 1620h 判断结果。当试验嗜血杆菌属，链球菌属时，孵育时间为 2024h，试验葡萄球 菌和肠球菌对苯唑西林和万古霉素的药敏试验时孵育时间必须满 24h。此时，第 1 孔至第 11 孔药物浓度分别为 128、64、32、16、8、4、2 、1、0.5、0.25、0.125g/ml。 1.2.4.结果判断 以在小孔内完全抑制细菌生长的最低药物浓度为 MIC。当阳性对照孔（即 不含抗生素）内细菌明显生长试验才有意义。当在微量肉汤稀释法出现单一的跳孔时，应 记录抑制细菌生长的最高药物浓度。如出现多处跳孔，则不应报告结果，需重复试验。通 常对革兰阴性杆菌而言，微量肉汤稀释法测得的 MIC 与常量肉汤稀释法测得的结果相同或 低一个稀释度（1 孔或 2 倍）。 2.琼脂稀释法 琼脂稀释法是将不同剂量的抗菌药物，加入融化并冷至 50左右的定量 MH 琼脂中，制成含不同递减浓度抗菌药物的平板，接种受试菌，孵育后观察细菌生长情况， 以抑制细菌生长的琼脂平板所含最低药物浓度为 MIC。本法优点是可在一个平板上同时作 多株菌 MIC 测定，结果可靠，易发现污染菌；缺点是制备含药琼脂平板费时费力。 2.1.培养基制备 使用 MH 琼脂，按商品说明书进行配制， pH7.27.4。淋病奈瑟菌使用 GC 琼脂基础加 1%添加剂；其它链球菌使用含 5%（V/V）绵羊血的 MH 琼脂（当试验磺 胺药时，使用溶解的马血）。 2.2.含药琼脂平板制备 根据实验设计，将已倍比稀释的不同浓度的抗菌药物分别加入已加 热溶解，并在 4550水浴中平衡的 MH 琼脂中，充分混匀倾倒灭菌平皿，琼脂厚度 34mm。通常按 19 比例配制药物琼脂平板，根据需要来选择药物浓度范围。配制好的 含药琼脂平板应装入密封塑料袋中，置 28冰箱可贮存 5 天。 2.3.接种物制备与接种 制备浓度相当于 0.5 麦氏标准比浊管的菌悬液，再 110 稀释，以 多点接种器吸取制备好菌液（约 12l）接种于琼脂平板表面，每点菌数约为 104CFU， 形成直径为 58mm 的菌斑。接种好后置 35孵育 1620h（甲氧西林耐药葡萄球菌、万 古霉素耐药肠球菌孵育时间应满 24h），观察结果。奈瑟菌属、链球菌属细菌置 5%二氧 化碳、幽门螺杆菌置微需氧环境中孵育。 2.4.结果判断 将平板置于暗色、无反光物体表面上判断试验终点，以抑制细菌生长的最低 药物浓度为 MIC。在含甲氧苄胺嘧啶或磺胺琼脂平板上可见轻微细菌生长，与生长对照比 较抑制 80%以上细菌生长的最低药物浓度作为终点浓度。 如果出现有 2 个以上菌落生长于含药浓度高于终点水平的琼脂平板上，或低浓度药物琼脂 平板上不长而高浓度药物琼脂平板上生长现象，则应检查培养物纯度或重复试验。 3.E 试验（ E-test） E 试验是指浓度梯度琼脂扩散试验，其原理基本同扩散法，即浓度呈 连续梯度的抗菌药物从塑料试条中向琼脂中扩散，在试条周围抑菌浓度范围内受试菌的生 长被抑制，从而形成透明的抑菌圈。E 试验综合了稀释法和扩散法的原理和特点，同时还 弥补了二者的一些不足，可以像稀释法一样直接定量测出抗菌药物对受试菌的 MIC。 3.1.培养基、菌液制备和接种 同纸片扩散法。 3.2.贴 E 试验条 同纸片扩散法，E